Tài liệu về cá chẽm

hưởng rất lớn đến sản lượng và chất lượng sản phẩm. Virus và vi khuẩn Vibrio là hai tác nhân gây bệnh nguy hại nhất đối với nghề nuôi trồng thuỷ sản. Các ao hồ nuôi tôm thâm canh có môi trường nước nuôi rất phú dưỡng do việc sử dụng quá nhiều thức ăn tổng hợp giàu protein (30 - 40%), 92% hàm lượng các chất hữu cơ chứa nitơ ô nhiễm trong các ao hồ nuôi có nguồn gốc từ thức ăn. Qua tính toán thì chỉ có 17% thức ăn được đồng hoá thành sinh khối của tôm, 18% thức ăn hoà vào nước, 48% do bài tiết, do lột xác hoặc hoạt động sống và 20% ở phân. Như vậy, môi trường nước nuôi tôm dần bị ô nhiễm, khiến cho dịch bệnh có cơ hội phát triển. Để hạn chế dịch bệnh, người nuôi tôm phải thường dùng các chất diệt khuẩn, chủ yếu là các chất chlorine và các chất kháng sinh. Các biện pháp hoá học này đều có hậu quả nguy hiểm đối với sức khoẻ của vật nuôi và sức khoẻ của con người khi sử dụng. Đối với chlor và dẫn xuất có thể kết hợp với các chất hữu cơ thành phức chlor hữu cơ rất độc. Việc lạm dụng các chất kháng sinh dẫn đến hiện tượng kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh và có thể không kiểm soát được các bệnh dịch. Do đó, việc dùng các hoá chất trong chăn nuôi và bảo quản sản phẩm đang gặp rất nhiều khó khăn đối với các loại thuỷ sản xuất khẩu [10]. Những năm gần đây, để giảm thiểu những bất lợi do sử dụng hóa chất trong nuôi trồng thủy sản, việc nghiên cứu và sử dụng các CPSH để phòng bệnh và cải thiện môi trường trong quá trình nuôi tôm ở nước ta đang phát triển mạnh. Theo Cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản, hiện có khoảng trên 200 thương hiệu CPSH và vitamin đang bán trên thị trường nước ta. Đa số các CPSH có nguồn gốc nhập ngoại, giá bán của các loại chế phẩm này khá cao, nên đã gây khó khăn cho người nuôi trồng thủy sản trong việc lựa chọn một sản phẩm vừa đạt chất lượng vừa có giá thành rẻ. Với lý do đó, các Viện nghiên cứu, các nhà khoa học trong nước với sự hỗ trợ kinh phí từ Nhà nước đã nghiên cứu thành công một số các CPSH có giá thành tương đối rẻ nhưng chất lượng thì không thua các sản phẩm của nước ngoài. Các nhà khoa học tại Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm EBS2 để bổ sung vào thức ăn trong nuôi trồng thủy sản. EBS2 có vai trò quan trọng như những vitamin kích thích trong quá trình sinh trưởng của các đối tượng nuôi trồng thủy sản. Kết quả thử nghiệm với cua biển cho thấy trong 22 ngày đầu lô cua dùng thức ăn tổng hợp có bổ sung EBS2 đạt tốc độ tăng trưởng 3,5%. Trong khi đó lô không bổ sung EBS2 có tốc độ tăng trưởng là 0,9% và lô dùng thức ăn tự nhiên có tốc độ tăng trưởng là 0,5% (Phòng Hóa sinh biển, 2001). Tiến sĩ Nguyễn Hữu Phúc, Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM đã nghiên cứu chế tạo thành công hai CPSH để nuôi tôm. Hai chế phẩm này có tên là Probact dùng để trộn vào thức ăn của tôm, và Ecobact dùng để xử lý môi trường nước trong ao nuôi tôm. Hai CPSH này có tác dụng giảm thiểu vi sinh vật gây bệnh cho tôm, cải thiện chất lượng nước và bùn trong các ao nuôi tôm (góp phần tăng tính miễn dịch cho tôm trong quá trình nuôi). Bước đầu hai chế phẩm này đã được sử dụng thử nghiệm tại một số hộ nông dân ở huyện Cần Giờ, Nhà Bè, các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, cho kết quả khá tốt. Tôm ít bị bệnh, tăng trưởng tốt, năng suất thu hoạch tăng từ 30-45% [9]. Ngoài ra, CPSH Biochie bao gồm một số chủng thuộc chi Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis) và Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus) cũng được sử dụng rộng rãi ở trong nước, chúng có chức năng phân hủy hợp chất hữu cơ bằng cách tiết ra các enzyme như protease, amylase. Chúng còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh phát triển quá mức như Vibrio, Aeromonas. Sử dụng CPSH Biochie để xử lý nước nuôi tôm cá có tác dụng làm giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chu kỳ thay nước và cải thiện môi trường (tăng oxi hòa tan, giảm COD, BOD). Bên cạnh đó, còn có tác dụng giảm đáng kể tỷ lệ chết, tỷ lệ còi cọc, tăng sản lượng tôm cá và giảm mùi hôi của ngư trường [15a]. Ngoài những chế phẩm probiotic trên, CPSH BioF có chứa chủng Lactobacillus acidophillus được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản có tác dụng tăng khả năng hấp thụ thức ăn và hạn chế bệnh do Aeromonas, Vibrio gây ra. Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy khi bổ sung BioF vào thức ăn tôm làm tăng tỷ lệ sống và đặc biệt tăng đáng kể sản lượng tôm trong ao. Trung tâm Khuyến nông Hà Nội đã thử nghiệm nuôi tôm giống tại Sơn Thủy, Hà Nội trong các tráng kích thước 3x2x1,5m. Chỉ sau 5 ngày thử nghiệm đã thấy sự khác biệt về chiều dài và trọng lượng của tôm ở tráng có sử dụng chế phẩm so với đối chứng. Tiếp tục theo dõi sau 24 ngày thấy chiều dài trung bình của tôm ở bể thử nghiệm là 1,97 cm, ở lô đối chứng là 1,71 cm. Kết quả bước đầu cho thấy sử dụng BioF để nuôi tôm giống rất hiệu quả, tôm tăng trưởng nhanh, khoẻ, đồng đều [15b]. Viện Sinh học Nhiệt đới được sự hỗ trợ kinh phí của Sở Khoa học và Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh đã thành công trong việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm probiotic BioII gồm hỗn hợp các vi sinh vật sống và enzyme tiêu hóa dùng trong nuôi trồng thủy sản [4]. Chế phẩm này đã được khảo nghiệm trên ao nuôi tôm sú ở các tỉnh cho kết quả khả quan và được Công ty thuốc thú y và nuôi trồng thủy sản đưa ra thị trường. Chế phẩm EM được giáo sư Teruo Higa - Nhật Bản phát minh năm 1980, được ứng dụng trong các lĩnh vực nông - ngư nghiệp trên thế giới. Tuy nhiên, chế phẩm EM ở dạng lỏng được nhân giống từ EM gốc của Nhật Bản với mật độ tế bào vi sinh vật có lợi cho nuôi trồng thủy sản thấp (<107 CFU/ml) nên hiệu quả sử dụng không cao. Để góp phần hoàn thiện và nâng cao hiệu quả chế phẩm EM, nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Sở Khoa học và Công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, phòng Vi sinh ứng dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu sản xuất ra chế phẩm VEM (Vietnamese effective microorganisms) sử dụng bổ sung với chế phẩm BioII. Chế phẩm VEM gồm tập hợp các vi sinh vật hữu ích có trong chế phẩm EM. Ngoài ra, còn có thêm một số loài vi khuẩn Bacillus spp. được chọn lọc và vi khuẩn quang dưỡng, không chỉ có tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi trồng thủy sản mà còn cạnh tranh và đối kháng với các loài vi khuẩn gây bệnh tôm - cá. Mật độ tế bào vi khuẩn Bacillus spp. và vi khuẩn quang dưỡng thêm vào tương ứng là 1010 và 107 CFU/ml [4]. Tại Bạc Liêu, nhiều hộ nuôi tôm đã áp dụng phương pháp nuôi có sử dụng chế phẩm vi sinh. Mô hình này bước đầu mang lại hiệu quả khá cao, có đến gần 80% số hộ áp dụng mô hình này thu lợi nhuận ổn định. Ưu điểm của mô hình nuôi tôm sử dụng chế phẩm vi sinh là tạo nên môi trường sạch, chi phí thấp, tôm phát triển nhanh và hạn chế dịch bệnh, nhất là bệnh đốm trắng, đầu vàng, phân trắng. Theo kết quả khảo sát của Bộ thuỷ sản, về mật độ nuôi tôm 10-20 con/m2 chiếm 60%, trong đó số hộ sử dụng chế phẩm vi sinh đạt hiệu quả gần 80%. Ðối với hai dạng mật độ dưới 10 con/m2 chiếm 11% và dưới 20 con/m2 chiếm 29%, thì những hộ chỉ sử dụng chế phẩm vi sinh đạt hiệu quả 65-75%. Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Cà Mau cũng đã phối hợp với Trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật và công nghệ Cà Mau triển khai mô hình nuôi tôm thâm canh bằng CPSH EM.ZEO tại xã Tân Hưng Đông - huyện Cái Nước. Nhìn chung, việc áp dụng mô hình nuôi tôm bằng chế phẩm EM.ZEO bước đầu mang lại hiệu quả khả quan, giữ cho môi trường của ao luôn sạch, tôm khoẻ mạnh mà hoàn toàn không sử dụng các hoá chất độc hại, kháng sinh. Trong suốt quá trình nuôi, tôm phát triển tốt và không bị nhiễm bệnh. Đây là mô hình nuôi tôm công nghiệp mang tính bền vững vì quy trình của dự án sử dụng chủ yếu vi sinh EM.ZEO. Chế phẩm được bổ sung vào thức ăn, hoà vào nước để làm sạch hoặc giảm thiểu ô nhiễm môi trường nước và xử lý ao đìa tránh được ô nhiễm H2S cùng với NH3, CH4. Chế phẩm probiotic có thể dùng với chế phẩm dưỡng tảo, tạo điều kiện cho vi tảo phát triển, tăng nguồn thức ăn cho tôm cá. Biện pháp dùng CPSH probiotics đang là biện pháp thích hợp và có rất nhiều triển vọng [10]. 2.4. Tổng quan về Quorum sensing Vi khuẩn sống như một quần xã, trong đời sống của chúng đều có sự cạnh tranh và cộng tác. Tuy nhiên, trong thế giới vi sinh thì sự cạnh tranh diễn ra khốc liệt hơn nhiều vì vòng đời của mỗi loài ngắn. Nhiều nhà khoa học cho rằng, Quorum sensing cho phép vi khuẩn hợp tác hành động. Như vậy, có thể định nghĩa Quorum sensing là khả năng của vi khuẩn có thể liên lạc và trao đổi thông tin để cộng tác thông qua các chất mang dấu hiệu [21]. 2.4.1. Vật chất liên lạc của Quorum sensing Các vi khuẩn có thể tự tổng hợp và tiết ra những chất làm dấu hiệu một cách chắc chắn, gọi là chất kích thích (pheromones hay là autoinducer - AI) thường là N – acyl homoserine lactones (AHLs). Vi khuẩn cũng có cơ quan đặc biệt để nhận biết được các tác nhân gây cảm ứng. Khi tác nhân gây cảm ứng này bao quanh cơ quan thụ cảm của vi khuẩn thì nó làm hoạt hóa sự sao chép của các gen chủ yếu trong đó bao gồm cả sự tổng hợp các chất gây cảm ứng. Khi chỉ có một vài vi khuẩn cùng loài ở các vùng lân cận thì sự truyền thông tin làm giảm sự tập trung của các tác nhân gây cảm ứng từ mức trung bình cho đến 0, do đó vi khuẩn tạo ra rất ít các chất gây cảm ứng. Thoạt đầu khi ở mức độ thấp chúng khuếch tán ra khỏi vùng của chúng và xâm nhập vào các vùng khác. Tại những vùng này vi khuẩn có những cơ chế bên trong để truyền thông tin cho đồng loại tập trung. Sau khi thông tin được phát ra thì có sự tập trung của đồng loại. Khi sự tập trung của đồng loại đến mức đủ lớn thì có những tín hiệu được phát đi báo hiệu cho những vùng tương tự có mặt và trả lời bằng 2 cách: - Sự hợp lại của các vùng có mật độ thấp để trở thành vùng có mật độ đủ lớn có khả năng gây hại cho vật chủ. - Sau khi tiếp nhận được thông tin thì chúng sinh sản nhanh để đạt được số lượng cần thiết. Những vùng này sau một lần thông báo thì nó cũng trả lời lại và làm cho nhiều AI báo động cho những vùng bên cạnh. Có nhiều kiểu cơ chế của thụ cảm Quorum sensing và nhiều loại vi khuẩn tham gia với nhiều loại cơ chế khác nhau ở các tổ chức. Tuy vậy, sự khác nhau phụ thuộc vào đặc điểm của vi khuẩn Gram dương hay Gram âm. Lần đầu tiên người ta chụp được ảnh của cơ quan thụ cảm, tác nhân gây cảm ứng bao gồm cơ quan thụ cảm của các vi khuẩn là ở vi khuẩn Vibrio harveyi, ảnh được chụp bằng tia X-quang vào năm 2002 [23]. 2.4.2. Dấu hiệu liên lạc của vi khuẩn và cơ chế tác động vào Quorum sensing Các nhà khoa học nghiên cứu về lĩnh vực này đã cho biết những loại vi khuẩn khác nhau thì có các chất dấu hiệu khác nhau. Trong một số trường hợp các loại vi khuẩn riêng lẻ có nhiều hơn một hệ thống Quorum sensing và do đó nó sử dụng nhiều chất mang dấu hiệu liên lạc. Người ta cũng biết các vi khuẩn phản ứng với cùng một chất theo nhiều cách khác nhau. Hay nói cách khác thì các chất mang dấu hiệu liên lạc có thể hiểu theo những cách khác nhau cũng như hiện tượng đồng âm khác nghĩa trong ngôn ngữ [21]. Có dấn liệu cho rằng các loài khác nhau có thể liên lạc với nhau qua hệ thống Quorum sensing. Điều này được xem như là sự phức tạp của hệ thống Quorum sensing và sự liên quan tới rất nhiều lĩnh vực vi sinh vật học. Trong điều kiện tự nhiên có nhiều loài vi khuẩn cùng tồn tại trong một khoảng không gian hẹp. Giữa các loài sẽ có một hệ thống Quorum sensing vì khi loài này sản sinh ra chất liên lạc với vi khuẩn cùng loài để phối hợp tập tính, thay đổi cách tăng trưởng, và hình thành cái gọi là biofilm (màng sinh học), là những chất tiết ngoại bào giúp cho chúng tạo thành một quần thể vi khuẩn gắn kết về mặt lý hóa, thì sẽ ức chế hoạt động của loài vi khuẩn khác. Trong vi khuẩn những phân tử kiểu Homonsoine lactone phục vụ nhiệm vụ chính là báo hiệu trong khi những phân tử Lipide, Peptide và hợp chất Protein ít khi báo hiệu cho các phân tử khác. Vi khuẩn Gram âm sử dụng những phân tử kiểu Homonsoine lactone tốt hơn, còn vi khuẩn Gram dương thì sử dụng Peptide hoặc sửa đổi những Peptide sơ cấp có nghĩa [23]. Nhìn vào cách phân tích trên chúng ta thấy được cơ chế để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn có hại hay kích thích sự phát triển của vi khuẩn có lợi, đó là chúng ta chỉ cần cắt đứt hay kích thích sợi dây liên lạc (Quorum sensing) giữa các vi khuẩn. Từ đó chúng ta có thể điều khiển số lượng mỗi loại theo mục đích của chúng ta. 2.4.3. Ứng dụng của Quorum sensing Nhiều bệnh nguy hiểm xảy ra với con người và vật nuôi có nguồn gốc từ vi khuẩn Gram âm. Với việc khám phá ra hệ thống Quorum sensing cùng với những hiểu biết về khả năng gây bệnh của vi khuẩn đã mở ra cho các nhà khoa học hướng nghiên cứu mới về khả năng ứng dụng của Quorum sensing. Cơ sở của những ứng dụng này là điều khiển số lượng vi khuẩn bằng cách làm nhiễu hệ thống dấu hiệu của chúng. Từ đó vi khuẩn không có khả năng tập trung đủ số lượng để gây bệnh hoặc là do nhiều gen gây bệnh của vi khuẩn do bị rối loạn của hệ thống Quorum sensing mà không thể tổng hợp được. Do vậy nếu chúng ta điều khiển được hệ thống này thì vi khuẩn không có khả năng gây bệnh nữa. Trong y học, thay vì phải dùng thuốc kháng sinh thì ta có thể phá hủy những dấu hiệu liên lạc của vi khuẩn hoặc khóa cơ quan thụ cảm của chúng. Điều này làm cho vi khuẩn không đủ số lượng cần thiết để gây bệnh. Trong nuôi trồng thủy sản đã có những nghiên cứu về sự phá hủy hệ thống Quorum sensing để ngăn ngừa và phòng trị dịch bệnh trong quá trình nuôi. Ví dụ: ấu trùng Nauplius của Artemia franciscana có thể sống sót sau khi xử lý vi khuẩn Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum và Vibrio haeveyi gây bệnh phát sáng bằng cách phá hủy hệ thống Quorum sensing của các loài vi khuẩn này [23]. Ở một số vi khuẩn sự tập trung số lượng đủ lớn và có sự thiết lập màng sinh học mới là điều kiện để gây bệnh. Dựa vào đặc điểm này nếu ta tác động vào Quorum sensing làm cho màng sinh học của vi khuẩn thiết lập chậm chạp hoặc không được thiết lập, hoặc gây cản trở sự tập trung số lượng vi khuẩn. Như vậy sẽ có ích trong việc ngăn chặn hay điều trị bệnh do vi khuẩn. Ngược lại nếu ta có thể tác động làm tăng khả năng thành lập màng sinh học của các vi khuẩn có lợi sẽ làm tăng nhanh chóng số lượng vi khuẩn có lợi để phục vụ cho mục đích nhất định nào đó. Chẳng hạn thành lập bộ lọc sinh học để làm sạch nước hay thiết lập hành rào sinh học để giữ lại các chất bẩn. Điều này rất có lợi trong môi trường nước đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản. 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2010 đến 05/2010. Địa điểm thực hiện: Trung tâm Quốc gia giống Hải sản Nam Bộ - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II. Địa chỉ: Số 167, đường Thùy Vân, Thành phố Vũng Tàu 3.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Ấu trùng cá chẽm (L. calcarifer) được chọn là đối tượng nuôi chính của thí nghiệm và trong phạm vi ứng dụng 4 chủng vi khuẩn probiotic vào giai đoạn ương nuôi ấu trùng cá chẽm từ 1–30 ngày tuổi. 3.3. Vật liệu nghiên cứu - Ấu trùng cá chẽm - Thức ăn tự nhiên (tảo, luân trùng, Artemia) - Các chủng vi khuẩn probiotic được phân lập từ Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II. Bao gồm 4 chủng. Bảng 1: Các dòng vi khuẩn probiotic dùng trong đợt thí nghiệm Ký hiệu khuẩn lạc Nguồn gốc phân lập Kết quả định danh Đối kháng Vibrio Phân hủy Quorum sensing Ch102 Hệ tiêu hóa cá chẽm Flavimonas sp. + + Ch104 Bacillus sp. + + Ch501 Micrococcus sp. - +++ Ch601 Cedecea neteri - +++ Ghi chú các kí hiệu: (-): không đối kháng; (+): đối kháng yếu; (++): đối kháng trung bình; và (+++): đối kháng mạnh. - Các dụng cụ, thiết bị dùng trong thí nghiệm: + Bể composite thể tích 0,5m3: số lượng 12 bể; + Thiết bị sục khí, hệ thống cấp nước, vợt lưới thu ấu trùng; + Kính hiển vi; + Máy quang phổ (Thermo); + Máy cất nước 2 lần (Anh, Model: Aquatron A4000D); + Tủ mát (Sanyo – Nhật, Model: MPR311D); + Cân phân tích (Sartorius – Đức, Model: CP224S); + Tủ ấm (Đức – WTBBINDER, Model: BD87531); + Tủ sấy (Đức – WTBBINDER, Model: ED53); + Tủ cấy vi sinh (SANYO, MCV-711A TS); + Nồi hấp vô trùng (HIMARAYA, Model: MVF50); + Máy đồng nhất mẫu; + Các loại micropipet 25-250µl và 1000-5000µl; + Các loại đầu típ hấp được nhiều lần; + Ống đong 100, 250ml; + Pipet 1ml, 5ml; + Bình tam giác 1000ml; + Cốc đốt 500ml, 1000ml; + Đĩa petri; + Ống falcon 50ml; + Một số dụng cụ khác bao gồm: Đèn cồn, quả bóp 3 van, que cấy mẫu, giá ống nghiệm inox, các loại chai thủy tinh chịu nhiệt (500ml, 1000ml, 2000ml). - Các hoá chất dùng trong thí nghiệm: + Chlorine, Natrithiosunphat, Sodium Chloride (NaCl); + Hóa chất đo thủy hóa; + Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Tryptic Soy Broth (TSB), Thiosulphate Citrate Salt Sucrose Agar (TCBS); + Cồn 960. 3.4. Nội dung thực hiện - Nuôi sinh khối tảo, luân trùng, Artemia làm thức ăn cho ấu trùng cá chẽm. - Ương nuôi cá bột lên cá hương 30 ngày tuổi. - Nhân sinh khối vi khuẩn trong phòng thí nghiệm. - Bổ sung vi khuẩn probiotic vào các bể ương ấu trùng và đánh giá đặc tính probiotic. 3.5. Phương pháp tiến hành 3.5.1. Chăm sóc, quản lý, ấu trùng cá chẽm - Ương nuôi cá bột lên cá giống Thí nghiệm được tiến hành trên ấu trùng cá chẽm mới nở. Trước khi thả cá, nước biển được lọc và xử lý giống như xử lý nước cho nuôi vi tảo, độ mặn 30-33‰, nhiệt độ 280C-310C, sục khí vừa đủ. Định lượng trứng và chuyển trứng vào các bể đã được xử lý để ấp trứng và ương ấu trùng. - Thể tích bể composite 0,5m3 (12 bể/đợt thí nghiệm tương đương với 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lai 4 lần) - Các bể thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên - Mật độ thả: 30 con/lít - Từ ngày thứ 2-14: thay 30 - 50% nước, cho ăn luân trùng 2 lần/ngày (vào 8giờ sáng và 14giờ chiều hàng ngày) với mật độ 10-20 ct/ml (Luân trùng đã được làm giàu bằng A1 DHA Selco, liều lượng 200ppm trong 4 giờ), ngoài ra còn bổ sung tảo Nannochlorosis sp. hoặc Tetraselmis sp. (mật độ 105 tế bào/ml) với lượng 500 lít/12 bể từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 10. - Ngày thứ 15-30: thay 50 - 60% nước, cho ăn Nauplius Artemia với mật độ 4 - 5ct/ml (Artemia đã được làm giàu bằng A1 – DHA selco liều lượng là 400ppm trong 6 giờ ). Cho ăn 2 lần/ngày vào 8 giờ sáng và 15 giờ chiều hàng ngày. Ngày 2 10 15 30 Ăn luân trùng giàu hóa 2 lần/ngày, mật độ 10-20ct/ml, thay 20-30% nước 0 Bổ sung tảo (105 tb/lít), 500 lít/12 bể Ăn Artemia giàu hóa 2 lần/ngày, mật độ 4 – 5ct/ml, thay 50-60% nước Hình 2: Sơ đồ quản lý, chăm sóc ấu trùng cá chẽm giai đoạn 2-30 ngày tuổi 3.5.2. Quy trình nhân sinh khối vi khuẩn trong phòng thí nghiệm - Các chủng vi khuẩn sử dụng cho mỗi đợt thí nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh (thời gian tối đa: 1 tháng). - Các chủng vi khuẩn được nhân sinh khối trong các elen (loại 2 lít) khác nhau, có sục khí. Thể tích nuôi 1000ml. - Môi trường nuôi sinh khối vi khuẩn là Tryptic Soy Broth (TSB): 20g TSB và 15g NaCl pha trong 1 lít nước cất đã xử lý sau đó được hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. - Tỷ lệ cấp giống là 10% Cứ sau 2 ngày lại tiến hành cấy chuyển một lần để nhân sinh khối mới. 3.5.3. Cách thức bổ sung vi khuẩn vào các nghiệm thức Có hai phương pháp bổ sung vi khuẩn vào bể ương ấu trùng cá chẽm: - Phương pháp 1:Bổ sung vi khuẩn trực tiếp vào môi trường nước trong bể ương: + Mật độ vi khuẩn trong bình nuôi cấy được xác định bằng cách đo quang (OD) bằng máy quang phổ ở bước sóng 600nm. Công thức tính như sau: Mật độ vi khuẩn = 1,02 x 109 x OD600 (CFU/ml) + Mật độ mỗi chủng vi khuẩn cần bổ sung vào bể ương : 5 x 104 CFU/ml. Bổ sung vào bể trước khi cho trứng vào ấp. Sau đó bổ sung 2 ngày 1 lần. + Công thức tính thể tích dịch vi khuẩn cần thiết bổ sung vào mỗi bể: Thể tích vi khuẩn bổ sung (ml) = Thể tích bể nuôi (ml) x 5 x 104 CFU/ml Mật độ vi khuẩn (CFU/ml) - Phương pháp 2: Bổ sung vi khuẩn gián tiếp vào bể ương thông qua giàu hóa thức ăn tự nhiên: * Giàu hóa vi khuẩn cho luân trùng (Rotifer): + Tính toán số lượng luân trùng cần thiết của mỗi nghiệm thức của 1 lần cho ăn để tiến hành thu luân trùng và làm giàu vi khuẩn trong 10 lít/nghiệm thức. + Mật độ vi khuẩn làm giàu thông qua luân trùng là: 5 x 107 CFU/ml (tính trên thể tích luân trùng sau khi thu). + Thể tích vi khuẩn cần thiết để làm giàu đối với mỗi nghiệm thức là V (ml) V (ml) = 5 x 107 x thể tích luân trùng sau khi thu x 103/ Mật độ vi khuẩn. + Thời gian giàu hóa Rotifer: trong 2 giờ (có sục khí). * Giàu hóa vi khuẩn cho Artemia: + Artemia sau khi nở khoảng 6 - 8 giờ thì tiến hành giàu hóa vi khuẩn (lúc này ấu trùng Artemia đã mở miệng). + Tính toán số lượng Artemia cho ăn cần thiết của mỗi nghiệm thức. Thu và cho vào 3 bình khác nhau tương ứng với 3 nghiệm thức. Thể tích giàu hóa Artemia trong mỗi bể làm giàu là 30 lít/nghiệm thức. + Mật độ vi khuẩn làm giàu thông qua Artemia là: 5 x 107 CFU/ml (tính trên thể tích Artemia trong bể làm giàu). + Thể tích cần thiểt để làm giàu đối với mỗi nghiệm thức: Tương tự như làm giàu thông qua luân trùng. + Thời gian giàu hóa Artemia: Trong 2 giờ (có sục khí). A1 DHA Selco Vi khuẩn 0 2 4 6 Thời gian giàu hóa (giờ) A1 DHA Selco Vi khuẩn Giàu hóa luân trùng Giàu hóa Artemia Chú ý: Thời gian giàu hóa A1 – DHA Selco cho luân trùng và Artemia dài hơn thời giàu hóa vi khuẩn cho chúng, nên trong thí nghiệm chúng tôi tiến hành giàu hóa song song theo sơ đồ sau: Hình 3: Sơ đồ làm giàu luân trùng và Artemia 3.5.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm Các nghiệm thức của đợt thí nghiệm được bố trí như sau: Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Ghi chú Đối chứng (không có vi khuẩn) Hỗn hợp 1 (Ch102, Ch104) Hỗn hợp 2 (Ch501, Ch601) Các hỗn hợp vi khuẩn được thành lập dựa trên đặc tính tương thích lẫn nhau giữa các chủng vi khuẩn. Mỗi nghiệm thức lập lại 4 lần. Số bể cần dùng: 4 x 3 = 12 bể. Chăm sóc, quản lý BỂ ƯƠNG Thức ăn tự nhiên (luân trùng, Artemia) Quản lý hệ vi sinh thông qua bổ sung vi khuẩn probiotic Tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ: Hình 4: Sơ đồ quy trình thí nghiệm chung cho đợt thí nghiệm Hỗn hợp 1.1 Ch102, Ch104 Hỗn hợp 2.1 Ch501, Ch601 Hỗn hợp 2.3 Ch501, Ch601 Đối chứng 3 Hỗn hợp 2.2 Ch501, Ch601 Đối chứng 2 Hỗn hợp 1.2 Ch102, Ch104 Đối chứng 1 Đối chứng 4 Hỗn hợp 1.4 Ch102, Ch104 Hỗn hợp 2.4 Ch501, Ch601 Hỗn hợp 1.3 Ch102, Ch104 Hỗn hợp 1.1 Ch102, Ch104 Hỗn hợp 2.1 Ch501, Ch601 Hỗn hợp 2.3 Ch501, Ch601 Đối chứng 3 Đối chứng 3 Hỗn hợp 2.2 Ch501, Ch601 Đối chứng 2 Đối chứng 2 Hỗn hợp 1.2 Ch102, Ch104 Đối chứng 1 Đối chứng 1 Đối chứng 4 Đối chứng 4 Hỗn hợp 1.4 Ch102, Ch104 Hỗn hợp 2.4 Ch501, Ch601 Hỗn hợp 1.3 Ch102, Ch104 Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3.6. Chỉ tiêu nghiên cứu 3.6.1. Theo dõi các yếu tố thủy lý, thủy hóa - Nhiệt độ nước đo bằng nhiệt kế thuỷ ngân (hàng ngày lúc 14giờ). - Độ pH: đo bằng pH kế (hàng ngày lúc 14giờ ). - NH3, NO2: Đo trên Sera test kit (1lần/tuần lúc 14giờ). 3.6.2. Theo dõi yếu tố vi sinh: Mật độ Vibrio tổng số trong nước (2 ngày/lần) và trong ruột cá (1 tuần/lần) - Cách xác định mật độ Vibrio tổng số trong nước nuôi: Định kỳ 2 lần/tuần (thứ 2 và thứ 5) thu mẫu nước ở 12 bể ương cá, dụng cụ thu mẫu bằng făngcon 50ml. Tại phòng thí nghiệm, tiến hành lắc đều mẫu trước khi cấy. Lấy 50μl từ mỗi mẫu nước tiến hành tráng đĩa trên môi trường TCBS. Sau đó, đem ủ ở điều kiện nhiệt độ 300C, thời gian ủ 24 giờ để khuẩn lạc hình thành. Sau 24 giờ, tiến hành định lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Kết quả mật độ Vibrio tổng số được tính theo công thức là: Mi (CFU/ ml) = Ai x 20 Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình trên 1 đĩa và 20 là hằng số cần thiết để đưa về số ml nước cho vào mỗi đĩa (1ml). Trường hợp thấy mật độ Vibrio lần trước dày (trên 300 khuẩn lạc) thì lần sau pha loãng đi 10 lần và tiếp tục pha loãng đi 100 lần nếu lần thứ hai vẫn thấy dày. Lúc này công thức tính Vibrio tổng số sẽ là: Mi (CFU/ ml) = Ai x 20 x Di Với Di là độ pha loãng - Cách xác định Vibrio tổng số trong ruột cá: Định kỳ 1 lần/tuần (thứ 5) thu mẫu cá ở 12 bể ương (10 con/bể). Tiến hành nghiền (cả 10 con) với 10ml nước muối 20‰. Sử dụng kỹ thuật hộp trải (Trần Linh Thước, 2007), mỗi mẫu ruột tiến hành kiểm tra 1 lần trên môi trường TCBS. Sau đó, đem ủ ở điều kiện nhiệt độ 30oC, thời gian ủ 24 giờ để khuẩn lạc hình thành. Sau 24 giờ, tiến hành định lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Cuối cùng, xác định kết quả Vibrio tổng số được tính theo công thức là: Mj (CFU/ ml) = Aj x 20 hay Mj (CFU/ cá) = Aj x 20 Trong đó: Aj là số khuẩn lạc trung bình trên 1 đĩa, Di độ pha loãng và 20 là hằng số cần thiết để đưa về số ml nước cho vào mỗi đĩa (1ml). 3.6.3. Xác định các chỉ tiêu tăng trưởng của ấu trùng cá chẽm - Xác định tỷ lệ sống của cá hương: Tỷ lệ sống của cá hương (%) = Số cá hương đếm được x 100% Số cá bột đưa vào ương nuôi - Xác định trọng lượng khô cá thể: Cá 30 ngày tuổi sau khi đã xác định tỉ lệ sống, bắt ngẫu nhiên 10 con từ mỗi bể, thấm bằng giấy cho ráo nước. Để 10 con lên 1 khay nhôm, ghi tên nghiệm thức. Đồng thời sấy một khay nhôm cùng kích thước (không có cá) để làm đối chứng. Sau đó sấy khô theo 2 bước: + 950C trong 20h + 1050C trong 2h Để nguội, cân trong lượng khay nhôm + 10 con cá, trừ đi trọng lư