Tóm tắt Luận án Nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm Hầu Thủ (Hericium erinaceus) và nấm Hương (Lentinula edodes) nuôi trồng ở Việt Nam

Căn cứ vào kết quả LD50 dùng phép ngoại suy cho liều dùng trên động vật, chúng tôi

sử dụng cho uống chế phẩm bán trường diễn 2 mức liều thấp và cao.

Nghiên cứu ảnh hưởng của HG1 khi cho động vật uống bán trường diễn đối với trọng

lượng cơ thể và khối lượng gan, lách, thận

Dùng các nhóm chuột nhắt trắng khỏe mạnh, đủ điều kiện thí nghiệm, có trọng lượng

trung bình 20 ± 2,0g. Nhóm chứng cho uống dung môi (không chứa HG1) x 0,2mL

mỗi con một lần trong ngày. Nhóm HG1 thử cho uống 2 mức liều căn cứ vào LD50 của

HG1, liên tục trong 42 ngày. Theo dõi bằng các chỉ tiêu: tập tính động vật, lượng thức

ăn tiêu thủ, lượng nước uống được theo dõi theo từng nhóm. Kết thúc đợt uống HG1,

động vật thí nghiệm được giết, phẫu tích bóc tách các tạng gan, lách, thận, đánh giá

các tổn thương đại thể bằng kính lúp. Khối lượng mỗi tạng được cân bằng cân phân

tích. Xử lý số liệu theo nghiệm pháp t-Student; so sánh từng cặp và test trước-sau. Sự

khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05.

pdf27 trang | Chia sẻ: lavie11 | Ngày: 11/12/2020 | Lượt xem: 30 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Tóm tắt Luận án Nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm Hầu Thủ (Hericium erinaceus) và nấm Hương (Lentinula edodes) nuôi trồng ở Việt Nam, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
amma GT), định lượng creatinin để đánh giá chức năng gan, thận theo phương pháp của Bergmeyer H.U. (1986) trên máy xét nghiệm tự động tại lab cận lâm sàng - Viện Bỏng Quốc gia - Học viện Quân y. Nghiên cứu tác dụng của HG1 đối với các biến đổi mô bệnh học ở gan, thận, lách động vật thí nghiệm Các mẫu gan, thận, lách được lấy trước và sau khi cho động vật uống HG1 bằng cách giết chuột, phẫu tích các mẫu gan, thận, lách, cố định bằng formol, đúc chuyển qua các dung dịch để loại nước, rồi đúc trong khối parafin, cắt lát dày 56 µm bằng máy Microtome Sartorius Werke. Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxylin - Eosin (HE). Đọc tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100200 lần. Chụp ảnh qua kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 200400 lần. Đánh giá các tổn thương theo từng nhóm và so sánh. Xử lý số liệu thu được bằng phương pháp mô tả 10 hình thái giải phẫu bệnh lý trên mẫu tiêu bản và trên ảnh chụp được từ các tiêu bản trên. 3.4.3. Nghiên cứu một số tác dụng của sản phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của HG1 trên mô hình gây độc gan bằng carbon tetracholorid Chuột nhắt trắng được chia thành 3 nhóm: Nhóm 1: Nhóm chứng sinh học (không gây độc gan) Nhóm 2: Chỉ gây độc gan đơn thuần bằng cách tiêm carbon tetrachlorid Nhóm 3: Dùng chế phẩm HG1 điều trị dự phòng 7 ngày liên tục liều 3,0 g/kg TLCT theo đường uống, sau đó gây độc bằng cách tiêm carbon tetrachlorid. Gây độc gan cấp bằng tetrachlorid Chuột nhóm 2 và 3 được tiêm phúc mạc carbon tetrachlorid liều 4,2 mL/kg TLCL. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan và hiệu quả điều trị dự phòng của HG1:Hoạt độ enzym AST, ALT và γGT trong huyết thanh chuột, khối lượng gan tính theo 10 g TLCT chuột. Phương pháp nghiên cứu tác dụng của HG1 đến quá trình tổng hợp protein trên động vật khi dùng bán trường diễn Các nhóm chuột nhắt trắng nuôi trong cùng điều kiện. Các nhóm nghiên cứu và nhóm chứng thức ăn tổng hợp như nhau, nhóm nghiên cứu cho uống hàng ngày 3,0 g/kg TLCT /24 h chế phẩm HG1 sau 6 tuần dùng, các nhóm động vật được lấy máu định lượng protein toàn phần trên máy xét nghiệm hóa sinh tự động. Tính toán: Lượng protein toàn phần được so sánh trước và sau thử nghiệm (nghiệm pháp trước - sau). Nghiên cứu tác dụng trên hệ miễn dịch của HG1 thực nghiệm Động vật thí nghiệm: CNT 68 tuần tuổi, trọng lượng 20,0g ± 2,0 g được dùng cho thí nghiệm này. Các nhóm động vật thí nghiệm gồm: CNT được gây suy giảm miễn dịch (SGMD) thực nghiệm bằng cách chiếu xạ bằng nguồn chiếu xạ telecobalt 60 (60Co) suất liều 7,0 Gy và được điều trị bằng chế phẩm HG1 cho uống trước để dự phòng. Gồm các nhóm: Đối chứng sinh học (ĐCSH): CNT được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm (20C, 12/12 giờ sáng/tối, yên tĩnh). Đối chứng SGMD: CNT được gây SGMD bằng cách chiếu xạ 7,0 Gy, sau đó không dùng gi, nuôi như ĐCSH. Nhóm NC: được gây SGMD thực nghiệm, cho uống HG1 với 2 mức liều ngoại suy căn cứ vào kết quả nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn. Các chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ (%) chuột sống/chết trong vòng 30 ngày kể từ sau khi chiếu xạ. Khối lượng trung bình của tuyến ức, hạch lympho vùng nách và khối lượng của lách so với trọng lượng cơ thể (TLCT). Đánh giá sự thay đổi mô học của tuyến ức, hạch lympho và lách. Số lượng tế bào tủy, bạch cầu, coloni lách ở chuột nhắt trắng. 11 Số lượng bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu máu ngoại vi. Tỷ lệ thực bào và chỉ số thực bào. Phản ứng quá mẫn với kháng nguyên (KN) đặc hiệu: gây mẫn cảm chuột nhắt bằng kháng nguyên albumin lòng trắng trứng (OVA). 4 ngày sau khi gây mẫn cảm, thử thách với kháng nguyên OVA bằng cách tiêm kháng nguyên vào dưới da gan bàn chân chuột nhắt trắng. Đánh giá đáp ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên OVA tại các thời điểm 24 h, 48 h, 72 h và 96 h sau thời điểm tiêm. 3.4.4. Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm trên động vật của sản phẩm HG1 − Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng trọng lượng 20,0  2,0 g đạt tiêu chuẩn nghiên cứu. Động vật thí nghiệm được nuôi dưỡng theo quy định trong phòng thí nghiệm chuyên dụng dược lý 1 tuần trước khi làm thí nghiệm. − Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm của HG1 Đánh giá hoạt tính tan huyết trên tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich Chuẩn bị dịch tế bào hồng cầu: Thu máu từ chuột dòng CD1 (20 g): Chuột được gây mê bằng diethyl ether, nhanh chóng mổ ngực của chúng và lấy máu bằng cách chọc nóng trong dung dịch đệm PBS 10 mM pH 7,4 lạnh (4C) - không dùng thuốc chống đông máu. Hồng cầu được rửa 3 lần với PBS, dùng ít nhất 10 lần thể tích dung dịch rửa, ly tâm 5 phút ở tốc độ 1500 rpm. Nồng độ hồng cầu đạt mức OD 1,0 ở 700 nm ở những mẫu chưa cho tan huyết. Với thử nghiệm tan huyết, 10 µL dung dịch mẫu thử nghiệm được pha với 90 µL dung dịch hồng cầu 5% trên phiến 96 giếng trong 1 giờ (37C). OD được theo dõi liên tục bằng spectrophotometer ở 700 nm (Specord UV-VIS). Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich (EAC) Dòng tế bào 4N Ehrlich được sử dụng trong thí nghiệm này. Các tế bào ung thư EAC được nuôi cấy trong ổ bụng của chuột bằng phương pháp tiêm vào khoang cơ thể chúng. Dòng chuột CD1 được sử dụng trong thí nghiệm này. Tế bào được thu lại sau 7 ngày nuôi cấy. Chuột được gây mê với diethyl ether và nhanh chóng mổ ổ bụng để lấy các tế bào ung thư (bằng xi lanh). Các tế bào được rửa 3 lần với buffer muối (saline buffer) pH 7,4, dùng ít nhất 10 thể tích lần dung dịch rửa, ly tâm 5 phút ở tốc độ 1000 rpm; sau đó tạo lại dung dịch tế bào với saline buffer (nồng độ 2x106 tế bào/mL). Với thử nghiệm gây độc tế bào, 10 µL dung dịch mẫu thử nghiệm trong DMSO được pha với 90 µL dung dịch tế bào trên phiến 96 giếng trong 1 giờ (37C). Tổng tế bào và số tế bào sống được đếm qua kính hiển vi với thuốc nhuộm Trypan Blue 0,17%. Đánh giá hoạt tính chống u in vivo đối với tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC) 12 Ung thư EAC được phát triển ở chuột dòng CD1. Chuột đực của dòng CD1 từ 68 tuần tuổi với cân nặng 20g được sử dụng. Trong thí nghiệm này có 40 động vật thử nghiệm. Mỗi nhóm thí nghiệm gồm 10 động vật thử nghiệm. Tế bào ung thư Ehrlich được tiêm vào khoang cơ thể của chuột với nồng độ 2x106 tế bào/mL. Cho chuột dùng chế phẩm HGC1 bắt đầu 1 ngày sau khi cấy khối u. Hỗn hợp pha trong 1% DMSO và dầu olive với các liều 100, 10 và 1 g/kg được thêm vào mỗi chuột 1 ngày 1 lần, trong 5 ngày (5 liều). Nhóm đối chứng chỉ có 1% DMSO và dầu olive. Đánh giá hoạt tính chống u trên tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich (EAC) bằng MRI Chuột BALB/c đực 68 tuần (trọng lượng khoảng 26 g) tuổi được sử dụng. Tế bào Ehrlich được cấy vào chuột ở dưới xương đòn vai phải với nồng độ 5x106 tế bào/mL. Cho chuột dùng mẫu thử nghiệm 1 ngày sau khi cấy khối u. Sử dụng kỹ thuật MRI để ước tính khả năng kiềm hãm khối u Ehrlich sau mỗi 2 ngày kể từ ngày thứ 7 sau khi cấy với tế bào ung thư (ở nhóm đối chứng và nhóm thử nghiệm). Chuột được gây mê với xylazine (13 mg/kg trọng lượng cơ thể). CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương Phần này trình bày về cách phân lập và xác định cấu trúc theo đinh hướng hoạt tính ức chế sự hình thành khối u trong môi trường thạch của các hợp chất từ nấm hương. 4.1.1. Tách các phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học Quả thể nấm hương khô được chiết và tách phân đoạn như miêu tả ở sơ đồ 3.1 (mục 3.1.1). Từ dịch chiết cồn đã tách được: 01 chất kết tinh NH1 và 3 phần chiết gồm: cặn n-hexan, cặn ethyl axetat, cặn butanol. Từ bã nấm 03 phân đoạn polysaccharide (P1- NH, P2-NH, P3-NH) được tách chiết (xem sơ đồ 3.1 ở mục 3.1.1). Ngoài ra, từ dịch lên men nấm hương phân đoạn polysaccharide P4-NH được tách (xem mục 3.1.2). Hàm lượng polysaccharide các phân đoạn tách từ nấm hương cũng được trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1. Polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hương Dạng nguyên liệu 100 g quả thể Dịch thể (g/L) (P4) Chiết nước nóng (P1) Chiết axit (P2) Chiết kiềm (NaOH 1M) (P3) Polysaccharide*(**) 3,84 (3,01) 2,5 (1,95) 11,08 (9,5) 5,2 (3,94) Lượng polysaccharide thô trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể) Số trong ngoặc: là hàm lượng polysaccharide trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể) Tất cả các phân đoạn chiết tách của nấm hương được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch. Kết quả cho thấy mẫu NH-hexan và P1- NH có hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư gan (HepG2) và ung thư mô liên kết (RD). Hơn nữa cả 2 mẫu đó đều biểu hiện hoạt tính ức chế sự hình thành khối u trên thạch với mật 13 độ hình thành khối u giảm tương ứng là 58,56 và 54,09%, kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là 52,01 và 35,36% so với đối chứng. Chúng tôi lựa chọn ra 2 phân đoạn n-Hexan và P1-NH từ nấm hương để phân tách tiếp theo sự dẫn đường của phép thử hoạt tính chống ung thư. Phân đoạn n-Hexan được tách thành 3 phân đoạn nhỏ NH-A1, NH-A2, NH-A3. Kết quả đánh giá hoạt tính chống ung thư thông qua thử nghiệm gây độc tế bào và ức chế tạo u trên thạch của các phân đoạn. Kết quả cho thấy phân đoạn NH-A1 biểu hiện hoạt tính gây độc tế bào và ức chế sự hình thành khối u trên thạch. Phân đoạn NH-A1 được lựa chọn để nghiên cứu thành phần hóa học. Từ phân đoạn NH-A1 sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan/axeton theo tỉ lệ 3/1-1/1, thu được 2 hợp chất ký hiệu là NH-2 (150 mg) và NH-3 (50 mg) (sơ đồ 3.2). Từ phân đoạn polysaccharide P1-NH tinh sạch được β-1,3/1,6 glucan (GL-NH) (xem mục 3.1.4) 1.1.2. Xác định cấu trúc các hợp chất NH1, NH2 và NH3 Hợp chất NH1: galactiol Chất kết tinh màu trắng, điểm chảy 167-169C. 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, ppm) δ 4,40 (d, J = 5,5 Hz, 1H-OH), 4,35 (t, J = 6 Hz, 1H –OH), 4,13 (d, J = 7 Hz), 1H-OH), 3,60 (m, 1H, H1a), 3,53 ( t, J = 7,5 Hz,1H, H3), 3,45 (m, 1H, H1b), 3,38 (m, 1H, H2). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, ppm) δ 71,5 (C2), 69,8 (C3), 63,9 (C1) Hợp chất NH2: Ergosterol Tinh thể hình kim màu trắng, Tnc: 168oC, ESI-MS: m/z 397,3 [M + H]+ (C28H44O, M = 396). 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, ppm) δ: 5,75 (dd, J1=2Hz, J2=5,5Hz, 1H,H6), 5,38 (m,1H,H7), 5,23 (dd, J1=7Hz, J2=15Hz, 1H, H23), 5,17 (dd, J1=7Hz, J2=15Hz, H22), 3,64 (m, H3), 2,47 (m, 1H), 2,28 (t, J = 12 Hz, 2H,H4), 2,04 (m, 1H, H20), 1,98 (1H, m, H9), 1,94 (1H, m, H14), 1,90 (1H, m, H12b), 1,76 (2H, m, H2b, H24), 1,75 (1H, m, H1b), 1,73 (1H, m, H14), 1,67 (1H, m, H15), 1,28 (1H, m, H16a), 1,74 (1H, m, H16b), 1,25 (1H, m, H15a), 1,68 (m, 1H, H15b), 1,64 (m, 1H, H11), 1,50 (1H, m, H2a), 1,38 (m, 1H, H25), 1,34 (1H, m, H12a), 1,25 (m, 1H, H1a), 1,78 (1H, m, H1b), 1,04 (d, J=6,5Hz, 3H21), 0,95 (s, 3H, H19), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H28) và 0,83 (t, J =7 Hz, 6H, H26-27), 0,63(s, 3H, H-18). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, ppm) δ: 141,7 (C-5), 139,9 (C-8), 135,6 (C-22), 131,9 (C-23), 119,60 (C-6), 116,50 (C-7), 70,49 (C-3), 55,79 (C-17), 54,59 (C-14), 46,29 (C- 9), 42,87 (C-24), 42,59 (C-13), 40,83 (C-40), 40,82 (C-20), 39,12 (C-12), 38,41 (C-1), 37,06 (C-10), 33,12 (C-25), 32,03 (C-2), 28,29 (C-16), 23,02 (C-15), 21,14 (C-4), 21,12 (C-21), 16,31 (C-19), 19,66 (C-26), 19,96 (C-27), 17,62 (C-28) và 12,07 (C-18). Hợp chất NH3: Ergosterol peroxide Chất tinh thể hình kim màu trắng, Tnc. 181-183oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 429,3 [M + H] + (C28H44O3, M = 426). 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz, ppm) δ: 1,56 (1H, m, H1a), 1,85 (1H, m, H1b), 1,72 (1H, m, H2a), 1,96 (1H, m, H2b), 3,97 (1H, m, H3), 1,27 (1H, m, H4a), 1,97 (1H, m, H4b), 6,24 (1H, d, J = 8,5 Hz, H6), 6,50 (1H, d, J = 8,5 Hz, H7), 1,51 (1H, m, H9), 1,41 (1H, m, H11a), 1,62 (1H, m, Hb-11), 1,55 (1H, m, H12a), 2,11 (1H, m, H12b), 1,58 (1H, m, H14), 1,25 (1H, m, H15a), 1,53 (1H, m, H15b), 1,37 (1H, m, H16a), 1,78 (1H, m, H16b), 1,24 (1H, m, H17), 0,86 (3H, s, H18), 0,88 (3H, s, H19), 2,03 (1H, m, H20), 1,01 (3H, d, J = 7,0 Hz, H21), 5,14 (1H, dd, J = 14 8,5, 15,5 Hz, H22), 5,22 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H23), 1,87 (1H, m, H24), 1,50 (1H, m, H25), 0,88 (3H, d, J = 6,6 Hz, H26), 0,83 (3H, d, J = 6,5 Hz, H27) và 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz, H28). 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz, ppm) δ: 30,09 (C-1), 34,71 (C-2), 66,49 (d, C-3), 39,37 (C-4), 82,17 (C-5), 135,22 (C-6), 130,75 (C-7), 79,44 (C-8), 51,12 (C-9), 36,99 (C-10), 20,64 (C-11), 39,91 (C-12), 44,58 (C-13), 51,70 (C-14), 23,42 (C-15), 28,65 (C-16), 56,23 (C-17), 12,88 (C-18), 18,18 (C-19), 39,73 (C-20), 20,89 (C-21), 135,44 (C-22), 132,33 (C-23), 42,79 (C-24), 33,08 (C-25), 19,65 (C-26), 19,96 (C-27) và 17,57 (C-28). Hợp chất NH-GL: β-1,3/1,6 glucan Kết quả phổ cho thấy, có 9 tín hiệu nguyên tử C chính. Tín hiệu tại C = 103 chỉ ra nguyên tử C1; tín hiệu C = 86,1 chỉ ra nguyên tử C3; tín hiệu C = 76,7 chỉ ra C5; tín hiệu C = 76,3 chỉ ra C3’; tín hiệu C = 73,7 chỉ ra C2; tín hiệu C = tín hiệu 70,3 chỉ ra C6s (thay thế); tín hiệu C = 68,4 chỉ ra C4 và tín hiệu C = 61,2 chỉ ra C6. Hợp chất NH1: galactiol CH CH CH CH2 CH HO OH H2C OH OH HO HO 1 23 Hợp chất NH-2: Ergosterol HO 1 3 5 8 9 10 11 13 14 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Hợp chất NH3: Ergosterol peroxide HO 1 3 5 8 9 10 11 13 14 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 O O Chất NH-GL: β- 1,3/1,6 glucan 1.1.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hương Các hợp chất phân lập được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch mềm. Kết quả thu được ở bảng 4.2, 4.3. Bảng 4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm hương ST T Ký hiệu mẫu Nồng độ mẫu (g/ml) Dòng tế bào Phần trăm sống sót (%) Hep-G2 Fl RD Lu DMSO 100  0,0 100  0,0 100  0,0 100  0,0 Chứng (+) 5 2,1 0,07 1,7 0,4 0,3  0,02 5,20,4 1 NH1 10 92,70,8 96,31,2 94,40,5 99,71,8 2 NH2 10 61,10,4 72,80,2 79,51,1 92,50,3 3 NH3 10 26,50,7 32,91,1 42,20,4 48,90,6 4 NH-GL 20 91,30,7 93,21,1 86,50,9 90,41,4 15 STT Ký hiệu mẫu Dòng tế bào Giá trị IC50 (g/ml) Hep-G2 Fl RD Lu Chứng (+) 0,22 0,27 0,16 0,31 1 NH3 3,84 4,17 7,61 9,21 Kết quả cho thấy, hợp chất NH3 biểu hiện hoạt tính độc tế bào cả 4 dòng tế bào thử (ung thư gan – Hep G2, ung thư tử cung-Fl, ung thư mô liên kết-RD, ung thư phổi – Lu) với giá trị IC50 lần lượt là 3.84, 4.17, 7.61, 9.21g/ml. Bảng 4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2 trên thạch mềm của các hợp chất Kí hiệu mẫu Nồng độ mẫu thử (g/mL) Kích thước trung bình của khối u Độ giảm mật độ khối u (% ) Đường kính (µm) % giảm so với đối chứng Chứng âm (DMSO 1%) 29,631,71 0 0 NH1 10 27,751,35 5,14 3,330,58 NH2 10 28,111,57 3,91 48,330,50 NH3 10 13,280,98 55,18 58,331,26 GL-NH 20 19,451,25 34,36 39,250,94 Kết quả bảng 4.3 cho thấy hợp chất NH3 và GL-NH ức chế sự hình thành khối u. Hợp chất NH3 ức chế rõ rệt hơn cả, mật độ hình thành khối u giảm 58,33% và kích thước trung bình của khối u giảm 55,18 % so với đối chứng. 4.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ 4.2.1. Tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính chống ung thư Quả thể nấm hầu thủ khô được chiết và tách phân đoạn như miêu tả ở sơ đồ 3.4 (mục 3.2.1). Từ dịch chiết cồn đã tách được 3 phần chiết (cặn n-hexan, cặn etyl axetat, cặn butanol). Từ bã nấm chiết tách được 03 phân đoạn polysaccharide (P1-HT, P2-HT, P3-HT) . Ngoài ra, từ dịch lên men nấm hầu thủ tách được phân đoạn polysaccharide P4-HT (xem mục 3.2.2). Các phân đoạn polysaccharide thô cũng được xác định hàm lượng polysaccharide. Kết quả được trình bày ở bảng 4.4. Bảng 4.4. Polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hầu thủ và nấm hương Nấm Dịch thể (g/L) (P4) 100 g quả thể Chiết nước nóng (P1) Chiết axit (P2) Chiết kiềm (NaOH 1M) (P3) Nấm hầu thủ 3,6 (1,52) 6 (2,5) 1,5 (1,2) 16,0 (12,1) Lượng polysaccharide thô trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể) Số trong ngoặc: là hàm lượng polysaccharide trong 100 g mẫu nấm khô (hoặc 1L dịch thể) 16 Tất cả các phân đoạn đó được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và kháng u trên thạch. Kết quả cho thấy cho thấy cặn n-hexan và polysaccharide P3-HT biểu hiện khả năng ức chế sự hình thành khối u với mật độ hình thành khối u giảm tương ứng là 47,93 và 30,35% và kích thước trung bình của khối u giảm tương ứng là 44,49 và 33,63% so với đối chứng. Cặn chiết n-hexan được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột lặp lại trên silica gel pha thường và sephadex với các hệ dung môi thích hợp (sơ đồ 3.5) thu được 2 hợp chất HT1 và HT2. Từ phân đoạn P3-HT tiến hành tinh chế theo sơ đồ 3.6 thu nhận được β-1,3/1,6 glucan tinh sạch (GL-HT) (xem mục 3.2.4). 4.2.2. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ Hợp chất HT1: axit stearic Hợp chất HT1 thu được ở dạng rắn, tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 69,6C. 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, ppm)  11,91 (1H, s (broad), COOH); 2,18 (2H, m, H-2); 1,47 (2H, m, H-3); 1,23 (28H, s, H-4 – H17); 0,85 (3H, t, J = 6,5 Hz, H-18) 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz, ppm)  174,4 (C-1); 33,7 (C-2); 31,3 (C-3); 29,1 (C- 4, C-5, C-6, C-7, C-8, C-9, C-10, C-11); 29,0 (C-12); 28,9 (C-13), 28,8 (C-14); 28,6 (C-15); 24,5 (C-16); 22,1 (C-17); 13,9 (C-18) Hợp chất HT2 - Ergosterol peroxide Chất tinh thể hình kim màu trắng, điểm chảy 181-183oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 429,3 [M + H] + (C28H44O3, M = 426). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm) : 1,58 (1H, m, Ha-1), 1,86 (1H, m, Hb-1), 1,71 (1H, m, Ha-2), 1,96 (1H, m, Hb-2), 3,97 (1H, m, H-3), 1,27 (1H, m, Ha-4), 1,97 (1H, m, Hb-4), 6,24 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-6), 6,50 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-7), 1,51 (1H, m, H-9), 1,41 (1H, m, Ha-11), 1,62 (1H, m, Hb-11), 1,55 (1H, m, Ha-12), 2,11 (1H, m, Hb-12), 1,58 (1H, m, H-14), 1,25 (1H, m, Ha-15), 1,53 (1H, m, Hb-15), 1,37 (1H, m, Ha-16), 1,78 (1H, m, Hb-16), 1,24 (1H, m, H-17), 0,86 (3H, s, H-18), 0,88 (3H, s, H-19), 2,03 (1H, m, H-20), 1,01 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21), 5,14 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H-22), 5,22 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H-23), 1,87 (1H, m, H-24), 1,50 (1H, m, H-25), 0,88 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-26), 0,83 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-27) và 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-28) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): 30,13 (C-1), 34,71 (C-2), 66,47 (C-3), 39,36 (C- 4), 82,16 (C-5), 135,21 (C-6), 130,75 (C-7), 79,43 (C-8), 51,12 (C-9), 36,98 (C-10), 20,64 (C-11), 39,71 (C-12), 44,57 (C-13), 51,70 (C-14), 23,41 (C-15), 28,64 (C-16), 56,22 (C-17), 12,88 (C-18), 18,18 (C-19), 39,71 (C-20), 20,88 (C-21), 135,42 (C-22), 132,33 (C-23), 42,78 (C-24), 33,07 (C-25), 19,64 (C-26), 19,94 (C-27), và17 ,56 (C-28). Hợp chất HT3 - Cerebroside B. Chất bột màu trắng, điểm chảy 180-190oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 726,6 [M- H] + , m/z 750,5 [M+Na] + , m/z 728,3 [M+H] + , m/z 710,5 [M-H2O+H] + , m/z 548,3 [M- glucose+H] + (C41H77NO9, M = 727). 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD, ppm) 3,73 (1H, Ha-1), 4,13 (1H, Hb-1), 4,01 (1H, H-2), 4,16 (1H, H-3), 5,50 (1H, dd, J = 7,0, 15,5 Hz, H-4), 5,76 (1H, dt, J = 15,5, 6,0 Hz, H-5), 2,07 (2H, H-6), 2,10 (2H, H-7), 5,17 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-8), 2,00 (1H, H-10), 1,43 (1H, H- 11), 1,31 (2H, H-16), 1,33 (2H, H-17), 0,92 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-18) 1,62 (3H, s, H-19), 4,01 (1H, H-2’), 1,57 (1H, Ha-3’), 1,74 (1H, Hb-3’), 1,44 (2H, H-4’), 1,31 (2H, H-14’), 1,33 (2H, 17 H-15’), 0,92 (3H, t, J = 7,0 Hz, H-16’), 4,29 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1”), 3,22 (1H, H-2”), 3,37 (1H, H-3”), 3,31 (1H, H-4”), 3,30 (1H, H-5”), 3,69 (1H, Ha-6”) và 3,89 (1H, dd, J = 2,0, 11,5 Hz, Hb-6”). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD, ppm) 70,13 (C-1), 55,01 (C-2), 73,29 (C-3), 131,51 (C- 4), 135,04 (C-5), 34,02 (C-6), 29,09 (C-7), 125,22 (C-8), 137,18 (C-9), 41,18 (C-10), 29,52 (C-11), 30,79-31,24 (C-12 đến 15), 33,49 (C-16), 24,15 (C-17), 14,86 (C-18), 16,53 (C-19), 177,60 (C-1’), 73,49 (C-2’), 36,28 (C-3’), 26,57 (C-4’), 30,79 (C-5’), 31,24 (C-13’), 33,49 (C-14’), 24, 15 (C-15’), 14,86 (C-16’), 105,13 (C-1”), 75,39 (C-2”), 78,31 (C-3”), 71,97 (C- 4”), 78,38 (C-5”) và 63,08 (C-6”). Hợp chất HT4 - Hericenone D Chất kết tinh màu trắng, điểm chảy 41-43oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 599,2 [M + H] + , m/z 597,4 [M - H] - (C37H58O6, M = 598). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm) H: 6,53 (1H, s, H-6), 5,32 (2H, s, H-7), 10,11 (1H, s, H-8), 3,91 (3H, s, H-9), 3,40 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-1’), 5,32 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2’), 3,00 (2H, s, H-4’), 6,09 (1H, t, J = 1,0, 1,5 Hz, H-6’), 1,84 (3H, d, J = 1,5 Hz, H-8’), 2,12 (3H, d, J = 1,0 Hz, H-9’), 1,78 (3H, d, J = 0,5 Hz, H-10’), 2,33 (2H, d, J = 7,5 Hz, H-2”), 1,62 (2H, m, H-3”), 1,25 (26H, m, H-4”-17”), 0,88 (3H, m, H-18”) và12,37 (1H, s, OH). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm) C: 138,70 (C-1), 112,91 (C-2), 162,94 (C-3), 117,33 (C-4), 163,49 (C-5), 105,55 (C-6), 62,90 (C-7), 193,10 (C-8), 55,93 (C-9), 21,62 (C- 1’), 126,27 (C-2’), 130,35 (C-3’), 55,55 (C-4’), 199,54 (C-5’), 122,85 (C-6’), 155,42 (C-7’), 27,66 (C-8’), 20,67 (C-9’), 16,41 (C-10’), 173,20 (C-1”), 34,25 (C-2”), 24,89 (C-3”), 29,13 (C-4’’), 31,94 (C-17”) và 14,12(C-18”). Hợp chất HT5 - Ergosterol Chất tinh thể hình kim màu trắng, điểm chảy 168oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 397,3 [M + H] + (C28H44O, M = 396) 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm) H: 1,25 (1H, m, H-1a), 1,75 (1H, m, H-1b), 1,50 (1H, m, Ha-2), 1,78 (1H, m, Hb-2), 3,63 (1H, m, H-3), 2,28 (2H, t, J = 13,5 Hz, H-4), 5,56 (1H, dd, J = 2,0, 5,5 Hz, H-6), 5,38 (1H, m, H-7), 1,97(1H, m, H-9), 1,65 (1H, m, H-11), 1,34 (1H, m, Ha-12), 1,90 (1H, m, Hb-12), 1,92 (1H, m, H-14), 1,67 (1H, m, H-15), 1,28 (1H, m, Ha-16), 1,74 (1H, m, Hb-16), 1,25 (1H, m, H-17), 0,63 (3H, s, H-18), 0,95 (3H, s, H-19), 2,05 (1H, m, H-20), 1,03 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 5,17 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H-22), 5,22 (1H, dd, J = 8,5, 15,5 Hz, H-23), 1,76 (1H, m, H-24), 1,38 (1H, m, H-25), 0,84 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-26), 0,82 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-27) và 0,91 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-28). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm) C: 38,39 (C-1), 32,02 (C-2), 70,47 (C-3), 40,83 (C-4), 141,36 (C-5), 119,60 (C-6), 116,30 (C-7), 139,80 (C-8), 46,27 (C-9), 37,04 (C-10), 21,13 (C-11), 39,11 (C-12), 42,41 (C-13), 54,57 (C-14), 23,01 (C-15), 28,29 (C-16), 55,76 (C-17), 12,06 (C-18), 16,30 (C-19), 40,82 (C-20), 21,11 (C-21), 135,60 (C-22), 131,99 (C- 23), 42,85 (C-24), 33,10 (C-25), 19,66 (C-26), 19,96 (C-27) và 17,62 (C-28). Hợp chất HT6 - β-Adenosine Chất tinh thể hình kim màu trắng, điểm chảy 234-235oC, phổ khối lượng ESI-MS: m/z 267,8 [M + H] + , 289,8 [M + Na] + (C10H13N5O4, M = 267). 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, ppm) H: 8,14 (1H, s, H-2), 8,34 (1H, s, H-8), 5,88 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-1’), 4,61 (1H, dd, J = 4,0, 10,5, H-2’), 4,15 (1H, br s, H-3’) 3,97 (1H, dd, J = 3,5, 6,5 Hz, H-4’), 3,57 (1H, m, H-5’a), 3,68 (1H, m, H-5’b), 7,32 (2H, s, NH2), 5,42 (1H, OH-2’), 5,17 (1H, d, J = 3,0, OH-3’) và 5,43 (1H, OH-5’) ppm 18 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, ppm) C: 152,41 (C-2), 149,08 (C-4), 119,37 (C-5), 156,17 (C-6), 139,95 (C-8), 87,95 (C-1’), 73,47 (C-2’), 70,68 (C-3’), 85,92 (C-4’), 61,69 (C-5’). Hợp chất GL-HT: β- 1,3/1,6 glucan Qua hình phổ 13C-NMR cho thấy có 10 tín hiệu nguyên tử C chính: tín hiệu C = 103,4 và 103,1 biểu thị C1 chuỗi thẳng và C1’ của glucose nhánh, tín hiệu C = 86,3 biểu thị C3 (chuỗi thẳng) của chuỗi thẳng. Hai giá trị trên chứng tỏ có liên kết β-glucosidic trong polymer, tín hiệu C = 61,1 biểu thị C6, tín hiệu C =68,57 biểu thị C4, tín hiệu C = 73,0 biểu thị C2, C =76,9 biểu thị cho C5 của glucose trong chuỗi thẳng và C =70,2 biểu thị C6s (substituted, thay thế). 4.2.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ Các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và khả năng ức chế hình thành khối u in vitro. Kết quả được trình bày ở bảng 4.5 VÀ 4.6. Bảng 4.5. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm Hầu thủ ST T Ký hiệu mẫu Nồng độ mẫu (g/ml) Dòng tế bào Phần trăm sống sót (%) Hep-G2 Fl RD Lu DMSO 100  0,0 100  0,0 100  0,0 100  0,0 Chứng (+) 5 2,1 0,07 1,7 0,4 0,3  0,02 5,20,4 Hợp chất HT1: axit stearic Hợp chất HT3 - Cerebroside B O O OH HO HO OH 1 2 3 4 75 6 8 9 10 11 12 13 14 16 18 15 1" 2" 3" 4" 5" 6" NH OH O OH 17 19 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 10' 11' 12' 13' 14' 15' 16' Hợp chất HT2: Ergosterol peroxide O O HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Hợp chất HT5 - Ergosterol HO 1 3 5 8 9 10 11 13 14 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Hợp chất HT4 - Hericenone D O OH O O O O (CH2)14 1 4 5 7 8 9 1'3'5'7' 8' 9' 10' 1" 2" 3" 18" 2 Hợp chất GL-HT: β- 1,3/1,6 glucan Hợp chất HT6 - β-Adenosine N N N N NH2

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdftai lieu (73).pdf
Tài liệu liên quan