Tóm tắt Luận án Nghiên cứu khu hệ vi sinh vật vùng rễ cây nghệ vàng curcuma longa l. nhằm định hướng tăng năng suất và chất lượng củ nghệ

.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu mẫu và xác định các chỉ số lý hóa của mẫu đất Thu mẫu: Các mẫu vùng rễ (bao gồm đất và phần rễ cây) được lấy ở độ sâu 10-15 cm dưới mặt đất bằng các dụng cụ thu mẫu vô trùng. Sau khi thu, mẫu được giữ trong các túi nilon sạch và được bảo quản ở thùng xốp 4oC cho đến khi tiến hành phân lập VSV. Xác định các chỉ số lý hóa của đất 2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng phân bón N đến năng suất nghệ Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 4-12/2016 và được lặp lại 4-12/2017. Lập 16 ô thí nghiệm tiêu chuẩn, mỗi ô thí nghiệm có diện tích 10 m2, theo 4 chế độ bón: N0, N150, N350 và N500 với phân N thay đổi từ 0 đến 500 kg.ha-1.y-1 kết hợp bón P và K (400:200 kg.ha -1 .y -1 ). Mẫu đất được thu ở độ sâu 10-15 cm, tại 5 điểm thu trong mỗi lô thí nghiệm theo mô hình W-pattern của Thomas (1985) [115]. Xác định các chỉ tiêu nghiên cứu: Chiều cao cây (cm); Số lượng lá/cây; Năng suất tươi (kg/ha); Hệ số khối lượng khô/khối lượng tươi (%); Hàm lượng các chất curcuminoid. Sau khi xử lý, nghệ khô dạng bột được chiết theo phương pháp chiết siêu âm (35 KHz, 25oC, 15 min) bằng hệ dung môi chiết ethanol/nước (70:30, v/v) theo mô tả của Mandal & cs. (2009) [116]. 6 Hàm lượng curcuminoid trong cặn chiết ethanol được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo Jayaprakasha và cs. (2006) [46]. 2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng phân bón N đến đa dạng khu hệ VSVVR cây nghệ Tách DNA tổng số từ các mẫu đất vùng rễ cây nghệ DNA tổng số được chiết bằng kit PowerSoil® DNA Isolation (Mo Bio Laboratories, Qiagen, Đức) và do nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Nano drop (Nanodrop 2000c, Thermo Fisher Scientific, USA), điện di trên agarose 1% và bảo quản ở -20oC. Giải trình tự metagenome amplicons Thư viện giải trình tự amplicons được tạo bằng bộ kit TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation (Illumina, USA) và chất lượng thư viện được đánh giá bằng hệ thống Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent, USA) trước khi giải trình tự trên máy Illumina Hiseq 2500 (Illumina, USA). Phân tích tin sinh học Luồng phân tích đa dạng khu hệ VSV vùng rễ cây nghệ được thực hiện nhờ công cụ Qiime2 (https://qiime2.org/) [118]. Quá trình phân tích gồm 3 bước chính, đó là: (i) Tiền xử lý; (ii) Xác định vị trí phân loại; và (iii) Phân tích đa dạng và hiển thị hóa.  Tiền xử lý: Sử dụng công cụ kiểm soát chất lượng của Qiime (V1.7.0, [146] và thuật toán UCHIME ( manual/uchime_algo.html) [148].  Xác định vị trí phân loại: Sử dụng phần mềm Uparse (Uparse v7.0.1001, [149], sở dữ liệu 7 Unite (https://unite.ut.ee/) [150] và Silva (https://www.arb- silva.de/) [151].  Phân tích đa dạng và hiển thị hóa  Một số chỉ số liên quan đến đa dạng khu hệ VSV Các chỉ số Shannon-Weaver (H), Simpson (D1), Chao1 và chỉ số ACE được xác định với công cụ Qiime 2.  Phân tích thành phần/tọa độ chính Phương pháp phân tích thành phần chính (PCA) và Phân tích tọa độ chính (PCoA) bằng phần mềm R (v 3.1.2, R Core Team 2014).  Đường cong rarefaction  Phân tích thống kê: Sử dụng phân tích phương sai ANOVA và Tukey’s Honest Significant Difference. 2.2.4. Phân lập vi khuẩn PGPR và xác định hoạt tính kích thích sinh trưởng Phân lập vi khuẩn vùng rễ có khả năng hòa tan phosphate vô cơ: Sử dụng phương pháp pha loãng và cấy trải trên đĩa thạch IPA [138]. Xác định khả năng sinh IAA: Sử dụng phương pháp Salkowski cải tiến [139]. Xác định khả năng kháng nấm gây bệnh ở thực vật: Sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch theo Ahmad & cs. (1998) [140]. Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của các PGPR: Các đặc điểm đươc xác định theo khóa phân loại Bergey’s [141, 142]. Xác định tên phân loại dựa trên trình tự đoạn gene 16S rDNA: Trình tự đoạn gene 16S rDNA của các chủng vi khuẩn được khuếch đại bằng PCR sử dụng cặp mồi Pr16F-Pr16R và so sánh với các trình tự đã công bằng công cụ BLASTN, phân tích bằng phần mềm BioEdit 7.0 [144] và MEGA X [145] [146]. 8 2.2.5. Phân lập nấm AM và nghiên cứu đặc tính sinh học Phân lập bào tử nấm AM từ mẫu đất vùng rễ nghệ: Phân lập theo phương pháp lọc ướt được mô tả lần đầu bởi Gerdeman & Nicolson (1963) [147]. Xác định tên phân loại dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA Xác định tên phân loại của các bào tử nấm AM bằng cách khuếch đại vùng gene 18S rRNA bằng cặp mồi NS31 và hỗn hợp mồi AM1, AM2 và AM3 trong phản ứng PCR [148] [149] [150]. Phương pháp biến nạp, nuôi cấy, chọn lọc tế bào tái tổ hợp mang gene đích được thực hiện dựa trên phương pháp sinh học thường quy. Tách plasmid, kiểm tra các đoạn gene chèn và được sau đó được giải trình tự trên máy ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, Mỹ). 2.2.6. Nghiên cứu tạo và thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật vùng rễ cho cây nghệ Tạo chế phẩm VSV vùng rễ cho cây nghệ  Xác định khả năng gây độc của chủng VSV: Theo phương pháp của Carter và cs. với một chút thay đổi theo điều kiện thí nghiệm [151].  Nhân nuôi nấm AM Nhân nuôi bào tử AM giống trên cây mã đề Ribwort (Plantago lanceolata) (được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học - Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam).  Nhân sinh khối, tạo hỗn hợp vi khuẩn  Thu hồi bào tử, tạo hỗn hợp bào tử nấm rễ  Phối trộn, tạo chế phẩm: Phối trộn hỗn hợp vi khuẩn và hỗn hợp bào tử nấm rễ theo tỉ lệ 1:1 (w/w). Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm VSV vùng rễ cho cây nghệ 9  Bố trí thí nghiệm Thử nghiệm được tiến hành tại Vườn thuốc Bộ Y tế tại Thanh Trì, Hà Nội từ tháng 5 đến tháng 11 năm 2018. Thí nghiệm thực hiện trên 2 nhóm: (i) Nhóm bổ sung chế phẩm VSV (Kí hiệu: CP) và (ii) Nhóm đối chứng (Kí hiệu: ĐC). Nghệ được trồng ở mỗi nhóm CP và ĐC trên diện tích 12 m2, tổng diện tích khu vực thí nghiệm 30 m2 (bao gồm cả phần diện tích của luống bảo vệ).  Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất Các chỉ tiêu sinh trưởng được theo dõi định kỳ. Năng suất được xác định dựa theo sinh khối tươi tại thời điểm kết thúc thử nghiệm. CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện thổ nhƣỡng và ảnh hƣởng của chế độ bón phân đạm hóa học đến năng suất cây nghệ Khảo sát các chỉ số môi trường của đất trồng nghệ Các chỉ số thu được giai đoạn trước khi trồng nghệ được xác định bằng các phương pháp tiêu chuẩn theo TCVN 7373:2004, 7374:2004, 7375:2004. Có thể nhận thấy, đất trồng nghệ có các chỉ số về hàm lượng N, P, K tương ứng với chỉ số của đất phù sa, chất lượng đất tương đối tốt, phù hợp canh tác nhiều loại cây trồng. Xác định năng suất nghệ theo chế độ bón phân N Năng suất củ nghệ sau thu hoạch tại mỗi chế độ dinh dưỡng được xác định sau khi thu hoạch như sau: Chế độ N0: 21038 ± 5013 kg/ha/năm; Chế độ N150: 27003 ± 4703 kg/ha/năm; Chế độ N350: 30902 ± 1642 kg/ha/năm; Chế độ N500: 20578 ± 2306 kg/ha/năm. 10 Từ kết quả đạt được có thể nhận thấy, khối lượng củ nghệ thu được (kg/ha) ở lô thí nghiệm với chế độ N0 và chế độ N500 là thấp nhất. Điều này cho thấy rằng, chế độ bón phân N ở mức quá thấp hoặc quá cao đều ảnh hưởng không tốt đến năng suất của củ nghệ sau thu hoạch. Chế độ canh tác với mức độ bón phân đạm từ 150 đến 350 kg/ha cho năng suất củ nghệ tươi sau thu hoạch cao hơn đáng kể. Hình 3. 1. Năng suất và hàm lượng curcuminoid tổng trong củ nghệ của các chế độ canh tác nghệ. Xác định năng suất curcumin theo chế độ bón phân N Từ dữ liệu hàm lượng các chất curcuminoid trong nguyên liệu mẫu khô theo khối, năng suất curcumin của mỗi chế độ canh tác đã được xác định. Kết quả cho thấy, năng suất curcumin cao nhất thu được tại lô thí nghiệm có áp dụng chế độ canh tác N150. Hình 3.1 tổng hợp các kết quả liên quan đến năng suất củ nghệ tươi và hàm lượng curcumin đạt được của mỗi chế độ bón phân. Với lượng phân đạm từ 150 đến 350 kg/ha/năm thì năng suất củ nghệ và hàm lượng curcuminoid đều ở mức cao hơn so với khi không bón (N0) và bón quá nhiều phân đạm (N500). Trong các thập kỷ gần đây, những nghiên cứu liên quan đến ảnh hưởng của N, P và K tới năng suất nghệ và hàm lượng curcumin 11 đã được khá nhiều tác giả thực hiện, tuy nhiên các kết quả nghiên cứu vẫn chưa đồng nhất và còn tồn tại những quan điểm trái ngược. Kết quả đạt được trong khảo sát này có ý nghĩa bổ sung và khẳng định cho luận điểm về tác dụng của phân bón N đến năng suất và hàm lượng curcumin trong củ nghệ vàng C. longa mà các nghiên cứu trên thế giới đã đề cập tới. Mặt khác, kết quả nghiên cứu đã đưa ra những số liệu đánh giá đầu tiên về tác dụng của phân bón hóa học đến năng suất của nghệ vàng ở Việt Nam. 3.2. Khảo sát một số nhóm vi sinh vật hữu hiệu trong vùng rễ cây nghệ Dựa trên các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến khu hệ VSVVR cộng sinh với cây nghệ vàng C. longa, chúng tôi đã thực hiện khảo sát sự có mặt của các VSV thuộc hai nhóm chủ yếu là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng (PGPR) và nấm rễ cộng sinh (AM) trong vùng rễ cây nghệ vàng tại vùng chuyên canh nghệ, qua đó định hướng tuyển chọn một số đối tượng tiềm năng để đề xuất chế phẩm sinh học làm tăng năng suất cây trồng. 3.2.1. Khảo sát vi khuẩn rễ kích thích sinh trưởng (PGPR) trong vùng rễ cây nghệ 3.2.1.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn PGPR Dựa trên các đặc tính cơ bản của PGPR bao gồm: Khả năng tạo các chất kích thích sinh trưởng thực vật (phytohormones); Khả năng cố định đạm; Khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh; Khả năng hòa tan phosphate và các chất dinh dưỡng khó tan [156] [157] [76], nghiên cứu đã được tiến hành nhằm phân lập các chủng vi khuẩn từ vùng rễ cây nghệ theo trình tự các tiêu chí: (i) Hòa tan phosphate vô cơ; (ii) Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA; (iii) Khả năng cố định đạm và (iv) Khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh. Kết quả sàng lọc những đặc tính trên cho các 12 chủng VSV từ các mẫu đất vùng rễ cây nghệ được thể hiện tại Bảng 3.6. Bảng 3. 6. Khả năng hòa tan phosphate, phát triển trên môi trường không chứa đạm và sinh tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn. T T Ký hiệu chủng Hòa tan phosphate vô cơ (D-d, mm)* Khả năng phát triển trên môi trƣờng không đạm Khả năng sinh tổng hợp IAA (ppm) 1 PGP-V2 3 + 24,80±2,21 2 PGP-V4 5 - 9,66±1,72 3 PGP-V5 3 + 67,51±2,11 4 PGP-V15 5 + 35,47±3,05 5 PGP-V18 3 + 26,82±1,46 6 PGP-V20 4 + 77,87±2,78 7 PGP-V21 6 + 63,11±2,09 8 PGP-V22 4 + 11,61±1,85 9 PGP-V24 4 - 45,81±2,89 *Ghi chú: D: đường kính vòng phân giải cơ chất xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn; d: đường kính khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch. Để tìm hiểu thêm về tác động kích thích gián tiếp của các chủng vi khuẩn PGPR lựa chọn, chúng tôi thực hiện xác định khả năng kháng nấm bệnh thực vật in vitro dựa trên sự ức chế sự hình thành sợi nấm A. niger và F. oxysporum trên đĩa thạch. Kết quả thử nghiệm cho thấy, trong số các chủng thử nghiệm, Bacillus sp. PGP- V21 là chủng vi khuẩn duy nhất biểu hiện hoạt tính kháng cả hai chủng nấm kiểm định (thuộc A. niger và F. oxysporum) với đường kính vòng phân giải lần lượt là 9 và 3 mm. Từ các kết quả nghiên cứu có thể thấy, PGP-V5, PGP-V20 và PGP-V21 là các chủng biểu hiện đặc điểm kích thích sinh trưởng thực vật tiêu biểu, bao gồm khả năng hòa tan P vô cơ, cố định đạm, sinh IAA với lượng lớn nhất, vì vậy được lựa chọn để tiếp tục khảo sát một số đặc điểm phân loại học, bao gồm đặc điểm hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và phân tích trình tự đoạn gene đặc trưng (gene 16S rRNA). 13 3.2.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại học của các chủng vi khuẩn lựa chọn Hình 3.2. Cây phân loại của các chủng PGP-V5, PGP-V20, PGP- V21 và một số chủng vi sinh vật đã biết dựa trên trình tự đoạn gene 16S rRNA đã công bố (Phương pháp maximum likelihood, 100 bootstrap replicates, consensus tree). Nhóm ngoài là chủng Methylobacterium populi AP014809. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch chứa môi trường LB của các chủng vi khuẩn được xác định dựa trên quan sát bằng mắt thường. Đặc điểm hình thái hiển vi và kích thước tế bào vi khuẩn được xác định được bằng quan sát dưới kính hiển vi Olympus (Japan) với độ phóng đại x1000. Đối chiếu các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa với khóa phân loại Bergey’s [141] [142], đã xác định được PGP-V5 là chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus spp. 3, PGP-V20 thuộc nhóm Enterobacteriaceae 2, PGP-V21 là vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus spp. 1. Dựa trên các kết quả tìm kiếm được trên 14 ngân hàng gen, kết hợp với phân tích trình tự đã xây dựng được cây phân loại của các chủng PGP-V5, PGP-V20 và PGP-V21 (Hình 3.3). Kết hợp với các đặc điểm hình thái, sinh lý, hóa sinh đã có và khóa phân loại của Bergey đã xác định được các chủng lựa chọn là Bacillus sp. PGP-V5, Enterobacter sp. V20 và Bacillus sp. V21. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sàng lọc được một số chủng PGPR có tiềm năng ứng dụng cao từ cây nghệ vàng tại vùng chuyên canh. Đây là những kết quả nghiên cứu mới và lần đầu tiên công bố trên đối tượng cây nghệ vàng C. longa tại Việt Nam. 3.2.2. Khảo sát nấm AM trong vùng rễ cây nghệ 3.2.2.1. Phân lập và khảo sát số lượng bào tử nấm AM từ mẫu đất vùng rễ cây nghệ Bên cạnh nhóm vi khuẩn PGPR, sự cộng sinh giữa nấm AM với cây nghệ vàng C. longa đã được một số tác giả trên thế giới đề cập tới, đặc biệt là nghiên cứu thực hiện với các giống nghệ vàng của Ấn Độ [160] [161], tuy nhiên đến nay chưa có bất kỳ một nghiên cứu tương tự nào thực hiện trên đối tượng nghệ bản địa của Việt Nam. Bằng phương pháp gạn và lọc ướt [147], sự hiện diện của bào tử nấm AM trong tất cả các mẫu đất vùng rễ cây nghệ vàng tại vùng nghiên cứu ở 3 thời điểm (cây 2, 5 và 8 tháng tuổi) đã được xác định. Kết quả cho thấy, số lượng các bào tử thu được tại 2 điểm phân lập thuộc khu vực nghiên cứu thay đổi trong khoảng từ 23,6±5,5 đến 45,1±6,2 bào tử/100 g đất ở thời điểm cây 2 tháng tuổi, và từ 40,3±8,2 đến 66,5±7,5 bào tử/100 g ở thời điểm cây 8 tháng tuổi. 3.2.2.2. Đặc điểm hình thái và phân loại học của một số chủng nấm AM trong đất vùng rễ cây nghệ Dựa trên tần xuất xuất hiện của các bào tử nấm AM, chúng tôi đã lựa chọn được 3 nhóm bào tử nấm điển hình từ các rây lọc 15 kích thước khác nhau, để tiến hành tách bào tử, lưu giữ và nhân nuôi. Qua phân loại sơ bộ xác định được AM-N1, AM-N2 và AM-N3 là các bào tử nấm thuộc chi Glomus. Hình 3. 5. Cây phân loại của các chủng AM-N1, AM-N2 và AM- N3 và một số chủng vi sinh vật đã biết dựa trên trình tự đoạn gene 18S rRNA đã công bố (Phương pháp maximum likelihood, 100 bootstrap replicates). Nhóm ngoài là chủng Gigaspora margarita BEG152. Để xác định vị trí phân loại của 3 chủng nấm AM trên, chúng tôi tiến hành tách DNA và thực hiện phương pháp Nested- PCR. Kết quả định danh trên cho thấy các mẫu AM đều có mức độ tương đồng so với các loài trên ngân hàng gene từ 86% trở lên, trong đó phần lớn đều thuộc chi Glomus. Dựa trên các kết quả tìm kiếm được, kết hợp với phân tích Maximum likelihood đã xây dựng được cây phân loại của các chủng AM-N1, AM-N2 và AM-N3 (Hình 3.5). 16 Kết hợp với các đặc điểm hình thái, đã xác định được các chủng nấm AM là Glomus sp. AM-N1, Glomus intraradices AM-N2 và Glomus mosseae AM-N3. 3.3. Nghiên cứu tác đọng của chế độ bón phân N đến đa dạng khu hệ vi sinh vật vùng rễ 3.3.1. Đánh giá đa dạng khu hệ vi khuẩn đất vùng rễ cây nghệ liên quan đến chế độ bón phân N 3.3.1.1. Phân tích các chỉ số đa dạng của khu hệ vi khuẩn vùng rễ cây nghệ OTU trong vùng đất rễ cây nghệ tại 4 chế độ bón phân đạm (N0, N150, N350 và N500) được phân tích bằng phần mềm Uparse, cơ sở dữ liệu Unite và thuật toán Blast, kết hợp phần mềm Qiime. Số lượng loài nấm trung bình trong các mẫu DNA tổng số của chế độ N0, N150, N350 và N500 lần lượt là 3105, 2286, 2760 và 2843 loài (Bảng 3.16). Bảng 3. 1. Kết quả phân tích phân loại học dữ liệu giải trình tự metagenome 16S và các chỉ số đa dạng. Tên mẫu N0 (n=3) N150 (n=3) N350 (n=3) N500 (n=3) Số lượng loài trung bình 3105 2286 2760 2843 Chỉ số Simpson 0,703 ± 0,11 0,665 ± 0,08 0,712 ± 0,10 0,733 ± 0,12 Chỉ số ACE 2012 ± 354 1893 ± 196 2068 ± 244 1992 ± 259 Chỉ số Chao1 1765 ± 103 1994 ± 262 1549 ± 306 1266 ± 220 Chỉ số Shannon- Weaver 3,77 ± 0,50 2,95 ± 0,25 4,04 ± 0,71 3,73 ± 0,56 Phân tích tọa độ chính (PCoA) dựa trên các chỉ số đa dạng sinh học (Hình 3.10) cho phép phân tách hai nhóm L (màu xanh) và H (màu đỏ). Nói cách khác, có sự khác biệt giữa các quần xã vi khuẩn từ nhóm năng suất cao H (N150 và N350) và nhóm năng suất thấp L (N0, N500). 17 3.3.1.2. Thành phần phân loài của các quần xã vi khuẩn vùng rễ cây nghệ Kết quả phân tích cho thấy thành phần phân loài vi khuẩn ở mức độ ngành và lớp của các mẫu đất vùng rễ cây nghệ thuộc các nhóm L và H tương đối đồng đều. Trong đó, đáng kể có lớp Alphaproteobacteria thuộc ngành Proteobacteria ở cả hai nhóm đều chiếm trên 40% tổng số OTU xác định được (p<0,05); lớp Gemm-1 của ngành Gemmatimonadetes ở phần lớn các mẫu nghiên cứu đều chiếm tỉ lệ trên 5% tổng số OTU (p<0,05). Như vậy có thể thấy, thành phần phân loài dựa trên phân tích dữ liệu metagenome amplicons 16S của các mẫu đất vùng rễ cây nghệ là khá đồng đều, điều này gợi ý rằng đây là khu hệ vi khuẩn đặc trưng cho đất tại vùng nghiên cứu, hoặc có thể đặc trưng cho vùng rễ cây nghệ nghiên cứu. Đáng chú ý, vi khuẩn thuộc nhóm Proteobacteria là các vi khuẩn Gram (-), trong đó có một số loài có thể sống trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, đặc biệt là một số vi khuẩn cố định đạm sống tự do [171]. Điều này phần nào lý giải cho sự phân bố ưu thế của nhóm Proteobacteria trong các mẫu đất vùng rễ tại chế độ N0. Rất có thể, điều kiện nghèo dinh dưỡng N tại chế độ N0 đã làm hạn chế sự phát triển của nhiều nhóm VSV, khiến ưu thế cạnh tranh của các Proteobacteria, đặc biệt là Alphaproteobacteria tăng cao và phân bố rộng rãi hơn. Như vậy, sau khi phân tích dữ liệu giải trình tự các amplicons ITS và 16S metagenome của khu hệ VSV đất vùng rễ cây nghệ vàng C. longa, đã thu được tổng số 4776 OTU vi khuẩn và 1760 OTU vi nấm. Các OTU vi khuẩn được xác định chủ yếu thuộc các ngành Proteobacteria (40-60%), Firmicutes (5-20%), Crenarchaeota (1-15%), Gemmatimonadetes (5-10%), Acidobacteria (5-10%), Actinobacteria (3-10%) và Chloroflexi (3-8%). Phần lớn các OTU vi nấm được xác định là thuộc Ascomycota (42-85%), 10- 18 65% số OTU vi nấm thuộc Basidiomycota, và khoảng 1-12% số OTU còn lại thuộc các ngành Mortierellomycota, Glomeromycota và Chytridiomycota. Các kết quả đạt được từ đây đã giúp đưa ra một số dự đoán về xu hướng biến động của các nhóm vi sinh vật trong đất dưới ảnh hưởng của điều kiện canh tác (lượng phân bón N) biến đổi và những gợi ý về mối liên quan giữa cấu trúc, thành phần của khu hệ vi sinh vật đất vùng rễ với năng suất và chất lượng cây trồng nói chung và cây nghệ vàng nói riêng. 3.3.2. Đánh giá đa dạng khu hệ nấm đất vùng rễ cây nghệ liên quan đến chế độ bón phân N 3.3.2.1. Phân tích các chỉ số đa dạng của khu hệ nấm vùng rễ Thành phần khu hệ nấm trong vùng đất rễ cây nghệ tại 4 chế độ bón phân đạm (N0, N150, N350 và N500) được xác định bằng cách phân tích trình tự của các đoạn ITS khuếch đại từ mẫu DNA tổng số tương ứng. Sau khi phân tích trình tự bằng phần mềm Uparse, so sánh với cơ sở dữ liệu Unite dựa trên thuật toán BLAST và phần mềm Qiime, các OTU trong mẫu nghiên cứu được xác định. Bảng 3. 2. Kết quả phân tích phân loại học dữ liệu giải trình tự metagenome ITS và các chỉ số đa dạng. Tên mẫu N0 (n=3) N150 (n=3) N350 (n=3) N500 (n=3) Số lượng loài trung bình 736 588 718 688 Chỉ số Simpson 0,927 ± 0,21 0,749 ± 0,09 0,823 ± 0,11 0,833 ± 0,16 Chỉ số ACE 770 ± 113 623 ± 91 755 ± 106 783 ± 75 Chỉ số Chao1 761 ± 83 645 ± 136 754 ± 98 788 ± 177 Chỉ số Shannon- Weaver 5,76 ± 0,3 4,05 ± 0,70 4,43 ± 0,52 4,85 ± 0,48 Phân tích thành phần chính (PCA) phân nhóm các mẫu đất vùng rễ theo năng suất cho thấy sự khác biệt giữa các mẫu từ nhóm năng suất cao H (N150 và N350) và nhóm năng suất thấp L (N0, N500). Kết quả này cho thấy, hàm lượng phân bón N cung cấp cho 19 vùng rễ cây nghệ không chỉ ảnh hưởng đến năng suất và hàm lượng curcumin mà còn tác động rõ rệt tới khu hệ nấm. Tác động của bón phân hóa học tới khu hệ VSV trong các loại đất nông nghiệp khác nhau đã được nghiên cứu khá kỹ [169] [170], tuy nhiên đây là lần đầu tiên tác động của phân bón được thể hiện trên khu hệ vi nấm vùng rễ của cây nghệ C. longa. 3.3.2.2. Thành phần phân loài của các quần xã nấm vùng rễ cây nghệ Thành phần phân loại ở mức độ ngành và lớp trong các quần xã nấm vùng rễ cây nghệ cho thấy sự khác biệt trong cấu trúc của khu hệ nấm tại các nhóm canh tác nghệ với lượng phân đạm khác nhau. Mặc dù vậy, trong các quần xã vi nấm tại 4 chế độ phân bón hóa học vẫn có sự hiện diện ưu thế của các OTU thuộc ngành Ascomycota, đặc biệt trong các mẫu đất của chế độ N150 (74,16 ± 9,06% tổng số OTU quan sát được), và ít hơn ở lượng phân bón N cao (N500), đạt 37,57 ± 6,87% tổng số OTU quan sát được. Ngoài ra, tỉ lệ các OTU thuộc ngành Basidiomycota lại có xu hướng tăng dần khi lượng phân đạm tăng, tuy nhiên, phân tích thống kê cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa nhóm chế độ canh tác (p> 0,05). Ngoài ra, một số ngành nấm như Zygomycota, Rozellomycota và Blastocladiomycota được tìm thấy với tỷ lệ cao hơn trong hai mẫu đất có năng suất nghệ thấp hơn (N0 và N500), nhưng không thấy sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm H và L (p> 0,05). Ở mức độ lớp, lớp nấm Sordariomycetes thuộc ngành Ascomycota phân bố nhiều hơn các mẫu thuộc chế độ N350 và N500, trong khi lớp Eurotiomycetes được tìm thấy với tỷ lệ cao hơn đáng kể trong các mẫu từ chế độ không bón phân N (N0) (p <0,05). Trong ngành Basidiomycota, Agaricomycetes là nhóm chiếm ưu thế nhất với tỷ lệ tăng đáng kể trong các mẫu thuộc chế độ bón phân N cao (p <0,05) (Hình 3.8). Đây là những phát hiện mới và chưa từng 20 được công bố về một số lớp nấm ưu thế trong khu hệ vi snh vật vùng rễ cây nghệ, đặc biệt là những thay đổi liên quan đến tỉ lệ phân bố của chúng theo hàm lượng N trong đất. Kết quả trên không chỉ có tính mới mà còn có ý nghĩa định hướng cho các nghiên cứu mở rộng của vấn đề xác định một chế độ bón phân hợp lý cho cây nghệ trên thế giới và ở Việt Nam. 3.3.3. Khác biệt trong thành phần một số nhóm vi sinh vật hữu hiệu trong vùng rễ cây nghệ Dựa trên các kết quả khảo sát một số nhóm VSV hữu hiệu trong vùng rễ cây nghệ (mục 3.2), chúng tôi đã định hướng phân tích khác biệt trong thành phần phân loại vi khuẩn PGPR (họ Bacilliaceae) vànấm AM (ngành Glomeromycota) ở mức độ chi cho các mẫu từ 4 chế độ bón phân N khác nhau của thí nghiệm. 3.3.3.1. Vi khuẩn thuộc họ Bacilliaceae Kết quả phân tích dựa trên phân bố của các OTU từ amplicons 16S cho thấy, họ vi khuẩn Bacilliaceae trong các mẫu đất vùng rễ nghệ ở các chế độ canh tác đều có thành phần gồm 3 nhóm chính: chi Bacillus, chi Geobacillus và các chi chưa được phân loại (unclassified). Đáng chú ý, tỉ lệ trung bình các OTU thuộc chi Bacillus tại các mẫu thuộc chế độ N0 và N500 (chế độ bón phân N cho năng suất thấp hơn) chiếm lần lượt 64 và 65% tổng số các OTU của họ Bacilliaceae, nhưng lên đến trên 90% tại các mẫu thuộc chế độ bón phân N cho năng suất cao là N150 và N350. Phân tích thống kê cho thấy đây là một sự khác biệt có ý nghĩa, với giá trị p<0,05. Kết quả này gợi ý về vai trò của một số vi khuẩn thuộc chi Bacillus đối với năng suất và chất lượng của cây nghệ trong nghiên cứu. Đặc biệt, phát hiện trên góp phần định hướng cho ứng dụng tạo phân bón sinh học từ chủng PGPR thuộc Bacillus cho cây nghệ tại Việt Nam. 3.3.3.2. Nấm thuộc ngành Glomeromycota 21 Có thể nhận thấy, trong thành phần phân loài ở mức độ ngành của các quần xã VSVVR cây nghệ tại các chế dộ bón phân N không có sự khác biệt đáng kể của tỉ lệ nấm thuộc Glomeromycota giữa các mẫu hay giữa hai nhóm mẫu L và H. Tuy nhiên, khi phân tích ở mức độ chi thì điểm khác biệt giữa các quần xã nấm AM trong vùng rễ cây nghệ đã được phát hiện (p<0,05). Nếu như trong quần xã VSVVR thuộc chế độ N0, tỉ lệ OTU thuộc chi Glomus trong tổng số OTU của Glomeromycota chỉ ở mức 13%, và ở mức 10% ở mẫu thuộc chế độ N500, thì tại chế độ N150 và N350 tỉ lệ này đã đạt lần lượt là 59 và 36%. Nhìn chung, phân tích metagenome ở mức độ chi của họ vi khuẩn Bacilliaceae và ngành nấm Glomeromycota đã cho thấy những khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các quần xã VSVVR cây nghệ thuộc nhóm H và L, cụ thể là ở tỉ lệ phân bố các OTU thuộc chi Bacillus và Glomus – các đại diện của VSV hữu hiệu đã xác định được trong mẫu nghiên cứu. Có thể nói, những kết quả trên đã giúp khẳng định dự