Tóm tắt Luận án Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5N1 clade 7 phân lập ở Việt Nam

ide gen H5. Tên của các mẫ đ p â lập được vir s cúm A/H5N1và tên của các mẫu RNA đ p át iệ dươ t vir s cúm A/H5N1 được đặt theo danh pháp qu c tế: Tên t pe cúm A/Lo i/T ước/Tên viết tắt Trung tâm Chẩ đoá T ú Tr ươ bằng tiếng Anh-ký hiệu của virus hoặc mẫ . Kết q ả c i tiết về các mẫ đ p â lập và phát hiệ dươ t vir s cúm A/H5N1 được trình bày ở bảng 3.2. Việc tìm kiếm sự tươ đồng của các virus cúm trên ngân hàng dữ liệu bằng gen HA cho thấy các mẫ vir s có độ tươ đồng rất cao với hai chủ vir s đ được mô tả trước đâ thuộc clade 7 là virus A/chicken/Hebei/326/2005/H5N1 và virus A/c icke / a i/2/2006/H5N1 độ tươ đồng trung bình của gen HA ở mức độ nuleotide lầ lượt l 96,1 v 96,3 v cả 15 mẫ đề được sắp ếp ằm tro một óm. 7 Bảng 3.2. ết uả giải trình tự g n và phân tích cây phát inh loài các chủng viru c m A H N1 phát hiện ở Lạng Sơn S TT Tên chủng virus cúm phân lập được Địa điểm phát hiện Phân loai clade/nhóm Subtype 1 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 Cao Lộc 7 H5N1 2 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 Cao Lộc 7/Nhóm B H5N1 3 A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 Cao Lộc 7/Nhóm B H5N1 4 A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 Cao Lộc 7/Nhóm B H5N1 5 A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 Cao Lộc 7/Nhóm A H5N1 Tên mẫu dương tính virus cúm (không phân lập được virus) 6 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/2008 Cao Lộc 7/Nhóm B H5N1 7 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/2008 Lộc Bình 7/Nhóm A H5N1 8 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/2008 Lộc Bình 7/Nhóm B H5N1 9 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/2008 Lộc Bình 7/Nhóm A H5N1 10 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/2008 Lộc Bình 7/Nhóm A H5N1 11 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/2008 Cao Lộc 7 H5N1 12 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/2008 Cao Lộc 7/Nhóm B H5N1 13 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/2008 Lộc Bình 7/Nhóm B H5N1 14 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/2008 Lộc Bình 7/Nhóm B H5N1 15 A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/2008 Lộc Bình 7/Nhóm B H5N1 Đá c ú ý, k i q a sát tr câ p át si lo i dựa tr e HA có t ể t ể t ấ rõ có 13 trong s 15 mẫ vir s cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam tác t 2 óm nhỏ rõ rệt tr câ p át si lo i (xem hình 3.2.), tạm được gọi l óm A v óm để p â t c . Các gen HA của 2 nhóm virus A hoặc B hiển thị sự khác biệt trong cùng nhóm ở mức độ rất t ấp đ i với chu i cleotide cũ ư c i axit amin, cụ thể sự khác biệt trung bình tổng thể về nucleotide là 0,39% và về a it ami l 0,38 . N ược lại, sự khác nhau giữa ai óm A v óm đạt trung bình 4,05% và 5,69% lầ lượt ở các mức độ nucleotide và amino acid trên khắp vùng gen HA mã hóa. ặc dù các e HA của nhóm A hoặc B khác biệt về chu i nucleotide hoặc axit amin rất t ấp tro cù óm, ư sự khác biệt giữa ai óm đạt tr b 4,1 ở mức độ cleotide v 5,7 ở mức độ axit amin trên gen HA (Bảng 3.4). Mức độ khác biệt cao tươ đươ với sự thay thế ≥ 30 a it ami iữa các chu i protein HA ở hai nhóm. 8 Hình 3.2. Cây phát inh loài dựa trên chuỗi nucleotide gen H5 của những viru c m A/H5N1 clade 7 (Phương pháp phân tích Neighbor-joining sử dụng phần mềm MEGA 5, giá trị boostrap 1000) Ngoài ra, sự khác biệt trung bình của tất cả các vir s á 7 đ iải trình tự trong nghiên cứu này so với tổ tiên gần nhất về gen HA là A/chicken/Shanxi/2/2006 là 3,8% (3,3-3,9%) ở mức độ cleotide v 5,8 5,4-6,1 ở mức độ v a it ami (Bảng 3.4). Tóm lại, những dữ liệu này cho thấy virus A/chicken/Shanxi/2/2006 là tổ tiên gần nhất của á 7 HA e được ác định trong nghiên cứu này. 9 Bảng 3.4. So ánh mức đ khác biệt về di truyền trên g n HA của chủng viru A H N1 clad với m t chủng tham chiếu Ký hiệu Virus (Xắp ếp th o clad ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Axit amin (%) 1 A/goose/Guangdong/1/1996 (0) 3.9 3.8 4.3 4.3 4.5 3.6 6.5 8.4 9.1 9 8.8 9 2 A/goose/Guiyang/337/2006 (4) 4 4.8 5.6 6.1 5.9 4.3 7 8.2 9 8.2 8.1 8.4 3 A/Viet Nam/1203/2004 (1) 3.5 4.5 3.2 3.4 3.4 4.7 7.2 9 9.7 9.3 9.1 9.3 4 A/Indonesia/5/2005 (2.1.3) 4.4 5.4 3.7 3.6 3.2 4.5 7 8.4 9.5 8.8 8.6 9 5 A/bar-headed goose/Qinghai/1/2005 (2.2) 4.3 5.4 3.5 3.5 3.1 5 7.9 8.6 9.1 9.1 9 9.1 6 A/Anhui/1/2005 (2.3.4) 4 5.3 3.3 3.4 3.1 4.5 7.2 9 9.1 9.1 9 9.1 7 A/Beijing/01/2003 (7) 3.1 4 3.7 4.6 4.4 4.1 5 7 7.9 7.2 7 7.4 8 A/chicken/Shanxi/2/2006 (7) 4.6 5.7 5.3 6 6.2 5.6 3.3 5.4 5.9 5.9 5.7 6.1 9 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 (7, Vietnam) 6.2 6.5 6.6 7.1 6.9 6.8 4.4 3.3 6.1 3.2 3.1 3.4 10 A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 (7, Vietnam, nhóm A) 6.3 6.7 6.8 7.3 7.1 6.9 4.7 3.6 4 5.7 5.6 5.9 11 A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 (7, Vietnam, nhóm B) 6.8 6.8 7 7.5 7.3 7 4.7 3.9 2.8 4.1 0.2 0.5 12 A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 (7, Vietnam, nhóm B) 6.7 6.7 6.9 7.5 7.2 7 4.7 3.9 2.8 4.1 0.1 0.4 13 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 (7, Vietnam, nhóm B) 6.6 6.6 6.9 7.4 7.2 6.9 4.6 3.8 2.7 4 0.4 0.3 Nucleotide (%) - Các c ủ vir s A/H5N1 óm t ộc clade 7 Việt Nam đều bị xóa mất một alanine ở vị trí 253 và chèn thêm 3 axit amin được gạch chân) vào vị trí poly basic gần cleavage site, tạo ra một chu i polybasic ở vị trí cleavage site n ư sa PQREREGGRRRKR*GLF. - Các virus A/H5N1 nhóm A của clade 7 vẫn duy trì chu i trình tự axit amin t ô t ườ PQI GRRRKR*GLF ư các vir s cúm A/H5N1 clade 7 k ác. Đá c ú ý là virus A/chicken/ Vietnam/NCVD-016/2008, dườ ư l vir s tổ tiên (ng ồ c) của cả 2 óm vir s A v , bởi vir s có một chu i poly basic trung gian mang một a it ami được c è v o ư của nhóm B (PQREGGRRRKR*G). - Một c ủ vir s tr ia k ác iữa 2 nhóm A và B là A/chicken/Vietnam/NCVD-s ab19/2008, cũ có chu i trình tự trung gian với alanine bị óa tại vị tr 253 v iệ tượ c è một axit amin (glycine) gần vị trí cleavage site tạo nên chu i trình tự polybasic PQIEGGRRRKR*G gi ư óm . 3.2.2. Giải trình tự gen NAN1 và phân tích cây phát sinh loài dựa trên chuôi nucleotide gen N1 Chúng tôi tiến hành lập cây phát sinh loài của gen N1 dựa trên chu i nucleotide và kết quả được biểu diễn ở hình 3.4. Kết quả phân tích phát sinh loài dựa tr e N1 cũ đồng nhất đ i với kết quả so sánh dựa trên ge H5. N a l e N1 các c ủ vir s cúm A/H5N1 clade 7 p â lập ở Việt Nam có độ tươ đồ cao đ i với gen N1 của các c ủ vir s cúm t ộc clade 7 của Trung Qu c và cụm với nhau trên cây phát sinh loài. Các chủ vir s cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam bị đột biế óa deletio mất 20 axit amin ở vị trí từ 49-68 trên vùng thân của p â tử k á NA. Trong 5 chủ vir s A/H5N1 clade 7 p â lập ở Việt Nam có 4 chủng là A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008, 10 A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 và A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 cụm t óm. Tro k i đó c ủng A/chicken/Vietnam/NCVD-093 lại nằm tách khá xa khỏi nhóm này và có mức độ tươ đồng gần với chủ vir s t ộc clade 7 của Trung Qu c phân lập từ ăm 2003(A/Beijing/01/2003). Hình 3.4. Cây phát sinh loài dựa trên chuỗi nucleotide g n N1 của các chủng virus A/H5N1 clade 7 (Phương pháp phân tích Neighbor-joining sử dụng phần mềm MEGA 5, giá trị boostrap 1000) Giữa các chủ vir s cúm A/H5N1clade 7 cũ g có sự tiế óa k ác a đ i với gen N1, cụ thể là chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-093 khác biệt với nhóm còn lại A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 A/chicken/Shanxi/10/2006 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/2008 A/chicken/Hebei/706/2005 A/chicken/Liaoning/A-1/2007 A/mallard/Huadong/hn/2005 A/chicken/Shanxi/2/2006 A/chicken/Ningxia/24/2006 A/chicken/Hebei/126/2005 A/chicken/Hebei/102/2005 A/chicken/Hebei/326/2005 A/Beijing/01/2003 2003 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/2008 A/Viet Nam/1194/2004 A/Viet Nam/1203/2004 A/chicken/Vietnam/8/2003 A/chicken/Viet Nam/AG-010/2004 A/Vietnam/CL20/2004 A/chicken/Viet Nam/DT-015/2004 A/chicken/Bac Lieu/07-10/2007 A/Muscovy duck/Ca Mau/07-04/2007 A/duck/Viet Nam/38ST/2008 A/duck/Hue/V6/2010 A/duck/Viet Nam/TMU026/2009 A/chicken/Viet Nam/TMU025/2009 A/duck/Hai Phong /208/2006 A/chicken/Bac Giang/07-74/2007 A/duck/Ha Tinh/07-53/2007 A/chicken/Ha Nam/07-83/2007 A/duck/Vietnam/8/05 A/goose/Vietnam/3/05 A/duck/Vietnam/1/2005 A/Hong Kong/485/1997 A/chicken/China/27402/1997 A/HongKong/486/97 A/HongKong/481/97 A/Hong Kong/156/97 A/duck/Guangxi/2291/2004 A/duck/Guangxi/1378/2004 A/chicken/Viet Nam/Ncvd8/2003 A/Hong Kong/213/2003 A/HK/212/03 2003 A/goose/Viet Nam/113/2001 A/Pheasant/HongKong/FY155/01 A/goose/Hong Kong/437-6/1999 A/Goose/Guangdong/3/97 A/Chicken/HongKong/YU822.2/01 A/Goose/Guangdong/1/96 40 72 52 99 95 51 100 81 100 55 100 100 98 100 95 100 83 50 70 61 46 100 85 97 92 68 79 73 89 99 99 97 95 98 71 91 89 90 69 99 65 49 86 99 54 0.005 V ir u s c la d e 7 H A 2 0 a x it a m in 1 9 a x it a m in 11 của các virus clade 7 của Việt Nam. Tuy nhiên, có thể nhận thấ rõ r l các vir s cúm A/H5N1thuộc clade 7 của Trung Qu c cũ ư Việt Nam đề có độ tươ đồng cao và khác biệt hoàn toàn với các clade khác hiện tại đa lư tro k vực. Việc phân tích sự khác biệt di truyền trên gen N1 về cleotide v mức độ axit amin của các c ủ vir s A/H5N1 t ộc clade 7 ở Việt Nam và một s c ủ vir s của Trung Qu c v của Việt Nam được trình bày ở bảng 3.6. So sánh cho thấy sự sai khác di truyền giữa óm 4 vir s cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam đ tr l A/c icke /Viet am/NCV -03/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008, A/chicken/Viet am/NCV -05/2008 v A/C icke /Viet am/NCV -016/2008 l rất thấp, ≤ 2 ở mức độ cleotide v ≤2,7 ở mức độ axit amin. N óm vir s có độ khác biệt tươ đ i lớn so với c ủ vir s khác của Việt Nam cũ t ộc clade 7 là A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008. Sự sai k ác về cleotide v a it ami của óm 4 c ủ vir s tr v vir s A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 lầ lượt là 4,7±0,2% (4,5-4,9%) và 5,6±0,3% (5,3-6,0%). Bảng 3.6. Mức đ khác biệt về di truyền trên gen N1 của 5 chủng viru c m A/H5N1 clade 7 so sánh với m t s chủng tham chiếu Ký iệ Tên chủng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Axit amin (%) 1 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 2.5 2.7 2.7 5.3 2.3 3.0 3.4 5.0 4.8 6.2 9.5 9.7 5.3 2 A/Chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 1.9 0.7 0.4 5.5 2.0 2.5 3.6 5.8 5.5 6.2 9.7 9.9 5.3 3 A/Chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 2.0 0.5 0.4 6.0 2.3 3.0 4.1 6.0 5.8 6.7 10.2 10.4 5.8 4 A/Chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 2.0 0.4 0.4 5.5 2.3 2.7 3.6 6.0 5.8 6.2 10.0 10.2 5.3 5 A/Chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 4.5 4.7 4.9 4.5 5.5 4.1 2.5 5.5 5.0 5.3 9.7 9.9 4.1 6 A/chicken/Shanxi/10/2006 1.6 1.4 1.6 1.7 4.5 2.7 3.6 5.5 5.5 6.5 10.2 10.4 5.3 7 A/chicken/Shanxi/2/2006 2.7 2.5 2.7 2.7 4.1 2.4 2.0 4.6 4.1 4.8 8.5 8.5 3.9 8 A/Beijing/01/2003 2.4 2.7 3.0 2.8 2.3 2.3 2.3 3.6 3.2 3.6 8.2 8.2 2.3 9 A/Viet_Nam/1194/2004 4.7 5.2 5.4 5.4 4.3 4.7 4.6 2.8 0.9 5.0 8.7 8.7 3.4 10 A/Viet_Nam/1203/2004 4.2 4.8 5.0 5.0 3.8 4.3 4.1 2.3 1.0 4.6 8.2 8.2 3.4 11 A/goose/Viet_Nam/113/2001 6.6 6.7 6.8 6.4 5.7 6.5 6.0 4.5 5.6 4.9 7.9 7.7 2.8 12 A/Hong_Kong/156/97 14.2 14.8 15.1 14.7 13.8 14.4 13.2 13.0 13.8 13.3 12.2 1.1 6.9 13 A/goose/Vietnam/3/05 13.0 13.4 13.7 13.3 12.3 13.0 11.9 11.4 12.3 11.7 10.9 1.8 6.9 14 A/Goose/Guangdong/1/96 5.2 5.6 5.9 5.5 4.3 5.3 5.0 3.0 3.6 3.3 3.2 11.1 9.8 Nucleotide (%) Chủ vir s A/c icke /Viet am/NCV -093 về mặt q a ệ ệ p ả ần nhất với chủ vir s A/ ei i /01/2003, l c ủ vir s p â lập ở ười ăm 2003 của Trung Qu c. Cụ thể sự sau khác chỉ là 2,3% ở mức độ nucleotide và 2,5% ở mức độ axit amin. Sự sai khác lớn nhất có thể q a sát t ấy giữa các vir s cúm A/H5N1 t ộc clade 7 t t ập ở Việt Nam so với các c ủ vir s A/H5N1 có hiệ tượ đột biế óa 19 axit amin (virus A/Hong_Kong/156/97 và virus A/goose/Vietnam/3/05 l 12,3-15,1 ở cleotide v 9,5 - 10,4%.ở mức độ axit amin. 12 3.2.3. ết uả giải trình tự gen M và lập cây phát sinh loài dựa trên chuỗi nucleotide gen M Dựa trên sự sai k ác c i gen M của các c ủ vir s A/H5N1 so sá c ú tôi đ lập cây phát sinh loài (phylogenetic tree để theo dõi sự tiến hóa của các chủng virus này (Hình 3.5). Hình 3.5. Cây phát sinh loài dựa trên g n M của cácchủng viru A/H5N1 clade 7 (Được lập bằng phương pháp phân tích n ighbor-joining sử dụng phần mềm MEGA 5, giá trị boostrap 1000) Kết quả phân tích cho thấy các c ủ vir s cúm ia cầm A/H5N1 t ộc clade 7 của Việt Nam có độ tươ đồ cao v ằm trong nhóm với các c ủ vir s cúm A/H5N1Clade 7 Trung Qu c, chứng tỏ gen M của các vir s cúm A/H5N1clade 7 của A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/2008 A/chicken/Shanxi/10/2006 2006 A/chicken/Shandong/A-10/2006 2006 A/chicken/Shanxi/2/2006 A/Beijing/01/2003 A/chicken/Korea/es/2003 A/black-headed goose/Qinghai/1/2005 A/chicken/Bhutan/248006/2010 A/duck/India/TR-NIV4396/2008 A/duck/Hunan/1386/2003 A/Indonesia/239H/2005 A/Indonesia/CDC1046/2007 A/Indonesia/535H/2006 A/Ck/Indonesia/2A/2003 2003 A/chicken/East Java/UT6045/2007 A/duck/Guangxi/351/2004 A/chicken/Thailand/ICRC-7356/2010 A/Thailand/Kan353/2004 2004 A/duck/Vietnam/48/2004 2004 A/Cambodia/P0322095/2005 A/Vietnam/CL100/2004 A/duck/Vietnam/286/2005 A/Muscovy duck/Ca Mau/07-04/2007 A/chicken/Lang Son/200/2005 2005 A/duck/Guiyang/3834/2005 2005 A/Anhui/T2/2006 2006 A/Anhui/2/2005 2005 A/Shanghai/1/2006 2006 A/crested myna/Hong Kong/540/2006 A/Hong Kong/6841/2010 A/mallard/Korea/1195/2010 A/Hunan/1/2006 A/duck/Guangxi/150/2006 A/duck/Laos/P0117/2007 A/duck/Zhejiang/52/2000 A/goose/Fujian/bb/2003 A/goose/Vietnam/3/05 2005 A/Duck/Hong Kong/y283/1997 A/Hong Kong/156/1997 A/duck/Shantou/195/2001 A/Chicken/Hong Kong/SF219/2001 A/Goose/Guangdong/1/96 99 100 99 99 99 94 93 96 67 52 94 91 94 77 83 83 83 80 77 74 68 68 66 59 55 58 97 46 33 41 33 35 33 25 31 53 14 27 28 34 53 51 0.002 Clade 7 Clade 7 13 Việt Nam và Trung Qu c có cùng nguồn g c. Để thấ rõ ơ sự khác biệt di truyền ở mức độ nucleotide và axit amin, chúng tôi so sánh gen M của các c ủ vir s cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam với một s vir s cúm A/H5N1của Trung Qu c. Kết quả được biểu thị ở bảng 3.8. Mức độ sai khác về di truyền gen M giữa các c ủ vir s cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam với a k ô đá kể, sự sai khác t i đa về mức độ nucleotide là 1% và mức độ axit amin là 0,6%. Mức độ sai khác giữa các c ủ vir s cúm A/H5N1thuộc clade 7 của Việt Nam v các c ủ t ộc clade 7 của Tr Q c cũ rất thấp. Sự sai khác t i đa về di truyền ở mức độ nucleotide và axit amin giữa các virus của 2 nhóm này lầ lượt là 3,0±0.1% và 3,3±0.2% (virus A/chicken/Shanxi/2/2006). Sự sai k ác về di tr ề iữa các c ủ vir s cúm t ộc clade 7 do c ú tôi p â lập với các c ủ vir s t ộc clade k ác tr cơ sở gen M về cleotide v a it ami k ô iề , c ỉ tro k oả 3,6 về cleotide v 2-4 về a it amin. Hai c ủ A/goose/Vietnam/3/05 và chủ A/Ho Ko /156/97 t ộc clade 0 t có sự k ác biệt k á lớ : sự sai k ác về mức độ cleotide tới 10 v về mức độ a it ami tới 7%.Một c ủ vir s A/H5N1 k ác cũ t ộc clade 0 là chủng A/Goose/G a do /1/96, được coi là thủy tổ của các c ủ vir s cúm A/H5N1độc lực cao, có độ sai khác về di truyền với các c ủ vir s t ộc clade 7 của Việt Nam ở mức độ nucleotide là 5,3±0.2% (5,2-5,6%) và ở mức độ axit amin là 4,2±0.2 % (4,1- 4,4%). Bảng 3. . So ánh mức đ khác biệt về di truyền trên gen M của 5 chủng viru c m A H N1 thu c clad 7 so sánh với m t s chủng tham chiếu hiệu Tên chủng viru 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Axit amin (%) 1 A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 0.6 0.3 0.3 0.3 1.6 1.3 3.5 1.9 7.4 1.9 2.1 3.8 4.4 7.4 2 A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 1.0 0.3 0.3 0.3 1.6 1.3 3.5 1.9 7.4 1.9 1.8 3.8 4.4 7.4 3 A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 0.9 0.3 0.0 0.0 1.3 0.9 3.2 1.6 7.1 1.6 1.8 3.5 4.1 7.1 4 A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 0.9 0.3 0.2 0.0 1.3 0.9 3.2 1.6 7.1 1.6 1.8 3.5 4.1 7.1 5 A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 0.9 0.3 0.2 0.0 1.3 0.9 3.2 1.6 7.1 1.6 1.8 3.5 4.1 7.1 6 A/chicken/Shandong/A-10/2006 1.3 1.3 1.2 1.2 1.2 0.9 3.8 1.6 7.4 1.6 1.8 3.5 4.4 7.4 7 A/chicken/Shanxi/10/2006 0.8 0.9 0.8 0.8 0.8 0.8 4.1 1.6 7.4 1.6 1.8 3.5 4.4 7.4 8 A/chicken/Shanxi/2/2006 3.1 3.1 2.8 2.9 2.9 2.8 3.0 3.2 7.4 3.2 3.5 5.1 5.8 7.4 9 A/Beijing/01/2003_2003 2.4 2.4 2.3 2.3 2.3 1.7 2.1 3.5 5.8 0.0 0.7 1.9 2.8 5.8 10 A/goose/Vietnam/3/05 10.0 10.1 9.7 9.7 9.7 10.0 10.4 9.3 8.7 5.8 5.7 5.8 3.8 0.0 11 A/Anhui/2/2005 3.0 3.1 3.0 3.0 3.0 2.4 2.7 4.0 0.9 8.1 0.7 1.9 2.8 5.8 12 A/blackheadedgoose/Qinghai/1/2005 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 2.6 2.7 4.0 1.4 9.3 1.3 2.1 3.2 5.7 13 A/goose/Fujian/bb/2003 4.0 4.1 3.8 3.8 3.8 3.4 3.7 4.4 2.1 8.1 2.0 2.3 2.8 5.8 14 A/Goose/Guangdong/1/96 5.5 5.6 5.2 5.2 5.2 5.0 5.3 5.7 3.5 6.0 3.4 3.8 3.2 3.8 15 A/Hong_Kong/156/97 10.7 10.8 10.5 10.5 10.5 10.7 11.1 9.3 9.4 1.3 8.8 9.8 8.8 7.5 Nucleotide (%) Tóm lại, kết quả phân tích phát sinh loài, kết quả phân tích sự sai khác di truyền dựa trên gen H5, N1 và M của các c ủ vir s cúm A/H5N1Clade 7 của Việt Nam 14 cho thấ , các c ủ vir s t ộc clade 7 của Việt Nam có độ tươ đồng cao với a c ứ tỏ c ú có cù ồn g c, v tươ đồ với các c ủ vir s A/H5N1 cũ t ộc clade 7 p â lập ở Tr Q c. 3.3. Xác định m t s đặc tính sinh học của viru A H N1 clad phân lập ở Việt Nam (A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008) 3.3.1. Tính thích ứng trên phôi gà ( ác định ch s EID50) Virus bắt đầu giết chết phôi trong vòng 2 ngày từ sau khi gây nhiễm. Điều này cũ p ù ợp với các nghiên cứ trước đâ rằ vir s cúm độc lực cao t ường giết chết phôi trứng trong vòng 48 giờ sau khi gây nhiễm xoang niệu mô. Kết quả ác đị k ả ă â iễm tr p ôi v c ỉ s I 50 của c ủ virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 được trình bày ở bảng 3.10. - Ở nồ độ pha loãng 10-3, toàn bộ phôi trứng chết trong vòng 40h sau khi gây nhiễm. Bảng 3.10. Kết quả theo dõi tỷ lệ s ng/chết của phôi trứng khi gây nhiễm virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 Lầ t iệm Hiệ iá p a lo p ôi â iễm p ôi bị iễm p ôi k ô iễm t c lũ Tỷ lệ iễm virus (%) A/(A+B)×100 Nhiễm virus (A) Không nhiễm (B) Tổng cộng (A+B) Lầ 1 10-3 5 5 0 20 0 20 100 10-4 5 5 0 15 0 15 100 10-5 5 5 0 10 0 10 100 10-6 5 4 1 5 1 6 83.3 10-7 5 1 4 1 5 6 16.7 10-8 5 0 5 0 10 10 0 ĐC -) 3 0 3 EID50/0,1ml 107 t eo cô t ức Reed-Muench) Lầ 2 10-3 5 5 0 19 0 19 100 10-4 5 5 0 14 0 14 100 10-5 5 5 0 9 0 9 100 10-6 5 3 2 4 1 5 80.0 10-7 5 1 4 1 5 6 16.7 10-8 5 0 5 0 10 10 0 ĐC -) 3 0 3 EID50/0,1 ml 106.9 t eo cô t ức Reed-Muench) Lầ 3 10-3 5 5 0 19 0 19 100 10-4 5 5 0 14 0 14 100 10-5 5 5 0 9 0 9 100 10-6 5 3 2 4 1 5 80.0 10-7 5 1 4 1 5 6 16.7 10-8 5 0 5 0 10 10 0 ĐC -) 3 0 3 0 EID50/0,1 ml 10 6.9 t eo cô t ức Reed-Muench) - Nồ độ 10-4:toàn bộ s phôi trứng chết trong ngày thứ hai, trong khoảng 40-48 giờ sau khi nhiễm. - Nồ độ 10-5: giết chết toàn bộ phôi trứ ư tro t ời ia lâ ơ so với nồ độ 10-3 và 10-4, ư cũ k ô q á 72 kể từ khi gây nhiễm. 15 - Nồ độ 10-6: p ôi t ườ c ết tro vò 72-96 . Ở độ p a lo t ườ vẫ có 1-2 phôi vẫn còn s ng (tùy theo lần thí nghiệm khác nhau). - Nồ độ pha loãng cao nhất gây chết phôi trứng là 10-7, tuy nhiên chỉ có 1/5 phôi chết ở thời điểm 96h , và 4 phôi vẫn còn s ng. - Đ i c ứ âm: các p ôi trứ s k ỏe mạ , b t ườ . T tr b c ẩ độ của vir s tr p ôi l 107,9EID50/ml. 3.3.2. Tính thích ứng trên tế bào ơ phôi gà ( ác định ch s TCID50) Kết quả ác đị k ả ă â iễm tr tế b o ơ p ôi v c ỉ s TCI 50 của c ủ vir s A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 được trình bày ở bảng 3.12. - Từ nồ độ 10-2 đến nồ độ 10-5 toàn bộ các giếng tế b o đều có CPE và thảm tế b o đ bị virus phá hủy trong vòng 24-72 giờ. Đặc biệt ở nồ độ 10-2 v 10-3 thảm tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 24 giờ nhiễm. - Nồ độ 10-6 t ườ c ỉ có 3-4 giếng có hiệ tượng bệnh tích tế bào CPE bị virus phá hủy. Bảng 3.12. Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào trên CEF khi gây nhiễm virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 Lầ t iệm Hiệ iá p a lo iế â iễm giếng có CP iế k ô có CPE t c lũ Tỷ lệ iễm virus (%) A/(A+B)×100 Nhiễm virus (A) Không nhiễm (B) Tổng cộng (A+B) Lầ 1 10-2 5 5 0 24 0 24 100 10-3 5 5 0 19 0 19 100 10-4 5 5 0 14 0 14 100 10-5 5 5 0 9 0 9 100 10-6 5 2 3 4 3 7 57.1 10-7 5 2 3 2 6 8 25 10-8 5 0 5 0 11 11 0 ĐC -) 5 0 5 TCID50/0,1ml 106,2 Lầ 2 10-2 5 5 0 24 0 24 100 10-3 5 5 0 19 0 19 100 10-4 5 5 0 14 0 14 100 10-5 5 5 0 9 0 9 100 10-6 5 4 1 4 1 5 80 10-7 5 0 5 0 6 6 0 10-8 5 0 5 0 11 11 0 ĐC -) 5 0 5 TCID50/0,1ml 106,4 Lầ 3 10-2 5 5 0 23 0 23 100 10-3 5 5 0 18 0 18 100 10-4 5 5 0 13 0 13 100 10-5 5 5 0 8 0 8 100 10-6 5 3 2 3 2 5 60 10-7 5 0 5 0 7 7 0 10-8 5 0 5 0 12 12 0 ĐC -) 5 0 5 TCID50/0,1ml 106,2 - Nồ độ 10-7 chỉ có 2 giếng nhiễm virus ở lần thí nghiệm thứ nhất, lần thứ 2 và 3 không có giếng nào nhiễm virus. 16 - Nồng độ 10-8 không có CPE, tức là không có hiệ tượng nhiễm virus. T tr b c ẩ độ của vir s tr tế b o ơ p ôi l 107,3TCID50/ml. 3.3.3.Kết quả ác định đ c lực của viru c m A/H5N1clade 7 3.3.3.1. Thông s đ c lực dựa trên đặc tính phân tử Độc lực và mức độ lây nhiễm của virus cúm trên gia cầm phụ thuộc v o tác động của enzyme protease của vật chủ đến sự phá vỡ các liên kết hóa học và tính thụ cảm của ư kết t , và sự phá vỡ liên kết của men protease phụ thuộc vào s lượng các axit ami cơ bản tại vù “Cleava e site” của gen HA của vir s, đó l các a it ami arginine (R) và lysine (K). Khi giải trình tự e HA, c ú tôi ác định mức độ có mặt và s lượng của các a it ami cơ bản arginine và Lysine tại vù “cleava e site” của các c ủ vir s cúm A/H5N1 clade 7. Kết quả trình tự vù “cleava e site” của c ủ vir s đại diệ c o clade 7 Việt Nam l A/C icke /Viet am/NCV -016/2008 v một s vir s cúm A/H5N1 thuộc một s clade k ác được so sánh tại bảng 3.13. Bảng 3.13. Các a it amin vùng ‘cl avag it ” của m t s virus cúm H N1 đ c lực cao và m t chủng tham chiếu Virus strain Clade Nơi phân lập HA0 cleavage site A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 7 PQREGGRRRKR*GLF A/goose/Guangdong/1/96 0 Tr Q c PQRERRRKKR*GLF A/Hong_Kong/213/03 1 Hong Kong PQRERRRKKR*GLF A/chicken/Vietnam/15/2007 1 Việt Nam PQREGRRKKR*GLF A/chicken/Egypt/9403/2007 2.2 Ai Cập PQGERRRKKR*GLF A/chicken/Primorje/1/2008 2.3.2 Nga PQRERRRKR*GLF A/duck/Vietnam/568/2005 2.3.2 Việt Nam PQRERRRKR*GLF A/Anhui/1/2005 2.3.4 Tr Q c PLRERRRKR*GLF A/duck/Vietnam/37/2007 2.3.4 Việt Nam PLRERRRKR*GLF A/chicken/Yunnan/493/2005 2.4 Tr Q c PQRERRRKR*GLF A/crow/Osaka/102/2004 2.5 N ật ả PQRE-RRKKR*GLF A/Pheasant/Hong_Kong/FY155/01 3 Hong Kong PQRERRRKKR*GLF A/goose/Guiyang/337/2006 4 Tr Q c PQRERRRKKR*GLF A/duck/Guangxi/668/2004 5 Tr Q c PQREIRRKKR*GLF A/chicken/Yichang/lung-1/04 6 Tr Q c PQRERRRKKR*GLF A/chicken/Shanxi/2/2006 7 Tr Q c PQREGGRRKR*GLF A/Chicken/Hong_Kong/YU22/2002 8 Hong Kong PQRERRRKKR*GLF A/goose/Shantou/1621/05 9 Tr Q c PQRERRRKKR*GLF 0 1 2 Chủng A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 có motif chứa nhiều axit ami cơ bả ư ar i i e v L si e tại vù “cleava e site”, cho thấ vir s cúm A/H5N1 được ếp loại v o óm vir s cúm có độc lực cao đ i với gia cầm. 17 3.3.3.2. Đánh giá đ c lực trên đ ng vật thí nghiệm Để đá iá độc lực của virus này chúng tôi chỉ sử dụng một chủng virus là A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 vì qua phân tích phát sinh loài (phylogeny) giựa tr e HA, vir s ằm tại c của óm các c ủ vir s A/H5N1 clade 7 của Việt Nam v ầ ất với các vir s cúm A/H5N1clade 7 ở Tr Q c. M i động vật thí nghiệm được cô cườ độc với liều 106TCI 50/100µl vir s cúm A/H5N1clade 7 q a đường nhỏ mũi. T iệm được lặp lại 2 lầ . Kết quả tổng hợp theo dõi thí nghiệm đá iá độc lực của virus A/Chicken/Vietnam/NCVD- 016/2008 được trình bày trong bảng 3.14. Bảng 3.14: Kết quả đánh giá đ c lực của viru c m A/H5N1 Clade 7 trên gia cầm Lầ t iệm Động vật thí nghiệm S lượng (con) Chết (con) Tỷ lệ(%) Điểm lâm sàng Thời gian chết trung bình (ngày) Lầ 1 Gà 11 11 100 1.9 5,4 Vịt 10 0 0 0 0 Ngan 10 0 0 0 0 Lầ 2 Gà 10 10 100 1.7 6,2 Vịt 10 0 0 0 0 Ngan 10 0 0 0 0 Vir s cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008) gây chết 100% s gà thí nghiệm. Theo tiêu chí về độc lực của virus cúm gia cầm của Tổ chức Thú y thế giới- OIE, vir s cúm A/H5N1clade 7 l vir s cúm có độc lực cao đáp ứng tiêu chí phân loại của OIE và kết quả tươ đồng với các chỉ thị độc lực ở mức độ phân tử của vùng “Cleava e site”. Thời gian gây chết động vật thí nghiệm trung bình - MDT (Mean death time) của vir s cúm A/H5N1Clade 7 đ i với l 5,4 ở t iệm lầ 1 v 6,2 ở t iệm lầ 2. C ú tôi cũ tiế â iễm a v vịt. Tất cả s vịt v a đều còn s ng sau khi kết thúc thí nghiệm. T m v o đó, toàn bộ s vịt v a tr đều khỏe mạ , ă b t ường và không thể hiện bất k triệu chứng lạ nào trong su t 2 tuần theo dõi. Quan sát gà chết có hiệ tượng phù nhẹ vù đầ , l m c o đầ sư l . K i mổ khám các bệ t