Bài giảng Các kỹ thuật chính của công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật

1Ch−ơng iii Các kỹ thuật chính của công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật I.nhân giống vô tính in vitro ( vi nhân giống cây trồng ) 21.KháI niệm chung Nhân giống vô tính in vitro:
Là quá trình sản xuất một l−ợng lớn cây hoàn chỉnh, từ các bộ phận, cơ quan nh− chồi, mắt ngủ, vảycủ, đoạn thân, lá,...của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Nhân nhanh in vitro đ−ợc ứng dụng vào:
Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công tác giống.
Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt.
Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác.
Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.
Bảo quản nguồn gen in vitro −u điểm của kỹ thuật nhân nhanh in vitro:
Ph−ơng pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể t−ơng đối đồng nhất về mặt di truyền
Có thể nhân giống cây trồng ở qui mô công nghiệp (kể cả trên các đối t−ợng khó nhân bằng ph−ơng pháp thông th−ờng)
Dễ dàng tạo đ−ợc cây sạch virus
Các cây sau nhân in vitro có xu h−ớng đ−ợc trẻ hoá---->nâng cao hiệu quả nhân bằng các ph−ơng pháp thông th−ờng sau đó 3Hạn chế của kỹ thuật nhân nhanh in vitro:
Chi phí cao so với các ph−ơng pháp nhân giống vô tính khác nên giá thành không cạnh tranh
Không phải bất cứ loài cây nào cũng có thể vi nhân giống
Một số loài cây trồng rất dễ bị biến dị khi nhân giống in vitro 2.Các b−ớc chính trong nhân vô tính in vitro B−ớc 0 lựa chọn cây mẹ Ra rễ Giai đoạn v−ờn −ơmB−ớc 4 Chuyển ra môi tr−ờng tự nhiên B−ớc 2 Nhân nhanh Lấy mẫu B−ớc I Nuôi cấy khởi động Thích nghi Vi giâm cành Hình 27. Các b−ớc trong nhân cây trồng bằng nuôi cấy mô Nguồn: Robert N. Trigiano Dennis J. Gray, 2000 B−ớc 3 4B−ớc 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Tr−ớc khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy).
Các cây này cần phải sạch bênh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh tr−ởng mạnh.
Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi tr−ờng thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả tr−ớc khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh tr−ởng của mẫu cấy in vitro. B−ớc 1: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đ−a mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh tr−ởng tốt. -Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít chuyên hoá ( đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ...) -Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp:th−ờng dùng các chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl, Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br... 5B−ớc 2: Nhân nhanh  Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái vă tăng nhanh số l−ợng thông qua các con đ−ờng: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.  Vấn đề là phải xác định đ−ợc môi tr−ờng và điều kiện ngoaị cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi tr−ờng có nhiều xytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy th−ờng là: 25-270C, 16 giờ chiếu sáng/ ngày, c−ờng độ ánh sáng 2000- 4000 lux. B−ớc 3: tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, ng−ời ta chuyển chồi từ môi tr−ờng nhân nhanh sang môi tr−ờng tạo rễ. Môi tr−ờng tạo rễ th−ờng đ−ợc bổ sung một l−ợng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi tr−ờng nhân nhanh giàu xytokinin sang môi tr−ờng không chứa chất điều tiết sinh tr−ởng.
Đối với các phôi vô tính th−ờng chỉ cần gieo chúng trên môi tr−ờng không có chất điều tiết sinh tr−ởng hoặc môi tr−ờng có chứa nồng độ thấp của xytokinin để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh 6B−ớc 4: thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên.
Để đ−a cây từ ống nghiệm ra v−ờn −ơm với tỷ lệ sống cao, cây sinh tr−ởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
Cây trong ống nghiệm đn đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây).
Có giá thể tiếp nhận cây invitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát n−ớc.
Phải chủ động điều chỉnh đ−ợc ẩm độ, sự chiếu sáng của v−ờn −ơm cũng nh− có chế độ dinh d−ỡng phù hợp. Các ph−ơng thức nhân giống vô tính in vitro (Nguồn: E.F. George, 1993) Cây mẹ Nhân giống từ chồi nách Nhân giống từ chồi bất định và phôi vô tính Meristem Đỉnh chồi Mắt ngủ Cây giống Cây con Nuôi cấy chồi đỉnh Nuôi cấy đoạn thân Tạo chồi trực tiếp Tạo phôi trực tiếp Cây từ phôi Tạo chồi gián tiếp Tạo phôi gián tiếp Cây con Phát sinh hình thái trực tiếp Phát sinh hình thái gián tiếp Mẫu cấy Mẫu cấy Callus Phôi vô tính Chồi bất định Huyền phù tế bào Callus 7Hoạt hoá chồi nách
Sự phát triển của chồi nách đ−ợc kích thích bằng cách loại bỏ −u thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh chồi và đoạn thân mang mắt ngủ. Theo ph−ơng thức này sự phát triển chồi diễn ra theo hai cách: -Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách. Tr−ờng hợp này th−ờng xảy ra khi nuôi cấy cây hai lá mầm nh− thuốc lá, khoai tây, hoa cúc... -Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách. Tr−ờng hợp này hay gặp với cây 1 lá mầm nh− mía, lúa,... 8Tạo chồi bất định
Trong tr−ờng hợp này cần phải thực hiện quá trình phản phân hoá và tái phân hoá tế bào để bắt các tế bào soma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô seo.
ở các đối t−ợng một lá mầm nh− lan, dứa, chuối, hoa loa kèn... th−ờng gặp sự phát triển cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorm): cùng một lúc mẫu cấy tạo thành hàng loạt protocorm, các thể này hoặc tiếp tục sản sinh protocorm mới hoặc phát triển thành cây. 9Tạo phôi vô tính
T−ơng tự nh− tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần phải thực hiện quá trình phản phân hoá và tái phân hoá tế bào để bắt các tế bào soma hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo.Nh−ng phôi vô tính có cấu trúc l−ỡng cực bao gồm cả chồi mầm và rễ mầm
Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo. Tạo phôi vô tính Sự hình thành phôi có 2 b−ớc:
Sự phân hoá các tế bào có khả năng phát sinh phôi: cần môi tr−ờng giàu auxin. Các tế bào có khả năng phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein và ARN thông tin.
Sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành: cần môi tr−ờng nghèo hoặc không có auxin. Nồng độ cao của auxin kích thích sự hình thành phôi vô tính nh−ng ức chế quá trình phân hoá và phát triển tiếp theo của các phôi này. 10 C BA Hình 28. Sự hình thành phôi vô tính của cây cải dầu. A: giai đoạn sớm (7-10 ngày); B: giai đoạn giữa (10-14 ngày); C: giai đoạn cuối 11 Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính Khái niệm
Có thể sử dụng các polyme sinh học để bao gói 1 phôi vô tính với một thể tích nhất định môi tr−ờng dinh d−ỡng để tạo hạt nhân tạo
Hạt nhân tạo đ−ợc dùng trong nhân giống các cây lai F1có giá trị cao, cây chuyển gen, bảo tồn cây có nguy cơ tuyệt chủng và nguồn gen −u tú (elit)… Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính
Ưu thế của hạt nhân tao:  Có giá cạnh tranh do sản xuất tự động hoá  Có thể sử dụng gieo trồng trực tiếp trên đồng ruộng không cần giai đoạn thích ứng  Có thể bổ sung vào phần “vỏ” hạt các chất bảo vệ thực vật, chất kích thích sinh tr−ởng  Dễ dàng bảo quản và vận chuyển 12 Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính Điều kiện:
Hệ thống sản xuất hạt giống nhân tạo phải có khả năng sản xuất với số l−ợng lớn các thể phôi soma và phôi soma đ−ợc sản xuất đồng nhất, để có thể đ−ợc trồng trọt bằng những kỹ thuật truyền thống một cách trực tiếp.
Hệ thống sản xuất hạt nhân tạo phải đ−ợc cơ giới hóa và không phụ thuộc vào những thiết bị đắt tiền và nhất là thỏa mnn yêu cầu vô trùng. Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính
Các b−ớc tạo hạt nhân tạo  Tạo huyền phù phôi vô tính trong môi tr−ờng dinh d−ỡng với mật độ phù hợp và bổ sung Na-alginate đ−ợc làm tan trong n−ớc với nồng độ 2-4%  Dùng pipet (máy nhỏ giọt) nhỏ 100-150àl huyền phù nêu trên có chứa 1 phôi soma vào dung dịch CaCl2 (2- 2,5%). Khi đó sẽ sinh ra phản ứng trao đổi ion Na-Ca và hạt nhân tạo đ−ợchình thành, có đủ độ cứng thích hợp. Sau đó chuyển qua ngâm trong n−ớc làm cứng hạt 13 Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính  Dùng Ca-alginate th−ờng hạt luôn luôn ẩm −ớt bề mặt, hiện nay ng−ời ta dùng một loại polymer Elvax 4260 để bao lớp alginate.  Giai đoạn kế tiếp là làm khô hạt để giúp hạt nhân tạo dễ dàng bảo quản và nẩy mầm khi cần thiết. Kitto & Janick, đặt hạt cây cà rốt trên khay có chứa 25% polyoxyethylene để làm mất n−ớc, và khi làm −ớt lại thì hạt đ−ợc tái sinh và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Hạt nảy mầm in vitro Hạt tạo từ phôi vô tính Hạt tạo từ protocorm Hạt nảy mầm in vitro Callus phôi hoá Cây mẹ Cụm phôi vô tính Protocor m Cây từ hạt nhân tạo Cây in vitro ở v−ờn −ơm Cây từ hạt nhân tạo Cây mẹ Tạo hạt nhân tạo 14 Nhân giống qua tạo củ in vitro Tạo củ khoai tây in vitro Nhân giống qua tạo củ in vitro Tạo củ loa kèn in vitro 15 Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô 1.Tính bất định về mặt di truyền (genetic instability).
Mục đích của nhân giống in vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất (True-to-type) với số l−ợng rất lớn. Tuy nhiên, trong một số tr−ờng hợp ph−ơng pháp này cũng tao ra những biến dị soma. Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại. cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồi đỉnh.
Những nhân tố gây ra biến dị tế bào soma có thể là;  Kiểu di truyền (Genotype): Tần số biến dị ảnh h−ởng bởi genotyp của các loài cây trồng khác nhau. Nói chung cây càng có mức bội thể cao thì càng dễ biến bị.  Số lần cấy chuyển (Subcultures) số lần cấy chuyển càng nhiều thì độ biến dị càng cao. Theo Amstrong và Phillips (1988): khi nuôi cấy lâu dài th−ờng gây ra biến dị nhiễm sắc thể.  Loại mô (Tissue): Nói chung nuôi cấy đỉnh sinh tr−ởng trong nhân nhanh in vitro ít bị biến dị hơn so với nuôi cấy các cơ quan khác. Biến dị trong nhân giống dứa Cayen Chồi bị sọc lá, bạch tạngChồi dị dạng 16 Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô 2.Sự nhiễm mẫu (explant contamination). Các vi sinh vật nh− nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùng mẫu đ−a vào nuôi cấy. Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn nh−: Agrobacterium, Bacillus, Corylabacterium, Erwinnia và Pseudomonas có thể xâm nhiễm vào mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1-2 tuần nuôi cấy). Để khắc phục đ−ợc hiện t−ợng trên cần:  Tr−ớc hết cần phải lựa chọn cây mẹ đúng tiêu chuẩn.  Có thể sử dụng một số chất kháng sinh để chống hiện t−ợng nhiễm khuẩn và nấm . Nh−ng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và có phản ứng đến kiểu di truyền do đó cần rất thận trọng khi sử dụng kháng sinh. Chất kháng sinh th−ờng gây ra những huỷ hoại ở ty thể và lạp thể nên có ảnh h−ởng đến di truyền tế bào chất. Sự nhiễm mẫu cấy 17 Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô 3.Việc sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy (Toxic compounds phenol). Trong nuôi cấy mô th−ờng quan sát thấy hiện t−ợng hoá nâu hay đen mẫu, mẫu này có thể khuyếch tán trong môi tr−ờng. Hiện t−ợng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol. Thí dụ các chất phenol eucomicacid và tyramine đn làm hoá nâu mẫu cây lan Cattleya khi nuôi cấy. Các ph−ơng pháp loại trừ sự hoá nâu:  Bổ sung than hoạt tính vào môi tr−ờng nuôi cấy (0,1 - 0,3%): ph−ơng pháp này đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya và Aerides. Tuy nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ một số chất điều tiết sinh tr−ởng và dinh d−ỡng cần thiết khác.  Bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hoá tốt ở mẫu một số cây ăn quả, (táo, hồng).  Sử dụng mô non, gây vết th−ơng nhỏ nhất khi khử trùng.  Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xytric vài giờ tr−ớc khi cấy.  Nuôi cấy mẫu trong môi tr−ờng lỏng, O2 thấp, không có ánh sáng (1 - 2 tuần).  Cấy chuyển mẫu liên tục(1-2ngày/lần) sang môi tr−ờng t−ơi trong 1 - 2 tuần Sự tiết độc tố từ mẫu cấy 18 Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô 4.Hiện t−ợng thuỷ tinh hoá (Vitrification).  Cây bị “thuỷ tinh hoá”- thân lá cây mọng n−ớc,trong suốt, cây rất khó sống khi đ−a ra ngoài môi tr−ờng do bị mất n−ớc rất mạnh.  Th−ờng xảy ra khi nuôi cấy trong môi tr−ờng lỏng hay môi tr−ờng ít agar, sự trao đổi khí thấp. Đặc biệt th−ờng xảy ra khi nuôi cấy táo, mận, hoa cẩm ch−ớng, hoa đồng tiền và hoa cúc.  Cây bị thuỷ tinh hoá th−ờng có hàm l−ợng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều phân tử phân cực nên dễ hấp thụ n−ớc. Cây in vitro th−ờng có mật độ khí khổng cao, khí khổng có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong quá trình nuôi cấy. Để tránh hiện t−ợng thuỷ tinh hoá có thể tiến hành một số giải pháp:  Giảm sự hút n−ớc của cây bằng cách tăng nồng độ đ−ờng hoặc các chất gây áp suất thẩm thấu cao.  Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi tr−ờng.  Giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuôi cấy.  Sử lý axit absixic hoặc một số chất ức chế sinh tr−ởng. Những công nghệ mới trong vi nhân giống cây trồng 1.Công nghệ vi nhân giống quang tự d−ỡng  Là b−ớc phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào do giáo s− T. Koyoki Kozai đề xuất và nghiên cứu từ hơn 2 thập kỷ qua.  Công trình nghiên cứu tập trung vào vấn đề nhân giống cây nuôi cấy mô trên môi tr−ờng không có đ−ờng nh−ng đ−ợc điền khiển chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2.  Công nghệ này đn đ−ợc thử nghiệm thành công trên nhiều đối t−ợng cây trồng nh− cà chua; khoai lang; rau spinach; d−a chuột; xà lách; keo; cà phê; xoài; tre; thông; ...  Công nghệ này đang đ−ợc tiếp tục hoàn thiện để làm cơ sở cho hệ thống nhân giống công nghiệp hóa (T. Kozai; F.Afreen; S.M.A.Zobayed - 2005) 19 Những công nghệ mới trong vi nhân giống cây trồng(tiếp)  Lợi ích của vi nhân giống sử dụng hệ thống quang tự d−ỡng
Tốc độ sinh tr−ỏng, chất l−ợng và tỷ lệ sống của mô thực vật đ−ợc nâng cao ở tất các các b−ớc trong nhân giống trong điều kiện tự d−ỡng.
Thiệt hại do sự nhiễm mẫu đ−ợc hạn chế do không sử dụng đ−ờng trong môi tr−ờng.
Tỷ lệ đột biến có thể đ−ợc giảm vì cây đựoc nuôi trong điều kiện môi tr−ờng giống tự nhiên.
Tự động hoá và do đó giảm đ−ợc chi phí lao động. Những công nghệ mới trong vi nhân giống cây trồng (tiếp)  Nh−ợc điểm:
Chi phí cao cho việc điều khiển môi tr−ờng ( ánh sáng, nhiệt độ, CO2, O2)
Cây vẫn sinh tr−ởng trong điều kiện vô trùng vì vậy vẫn dẫn đến chi phí cao cho hệ thống bình nuôi chuyên dụng và chuẩn bị giá thể. Hộp nuôi cây sử dụng trong hệ thống quang tự d−ỡng. Dài x Rộng x Cao = 610 x 31 x 105 mm, thể tích 20 lít ( Zobayed et al., 2000). 20 21 Những công nghệ mới trong vi nhân giống cây trồng (tiếp) 2.Bioreactor
Sự phát triển công nghệ Bioreactor trong vi nhân giống cây trồng
Takayama và Miasawa là những ng−ời đầu tiên nghiên cứu sử dụng biorector vào nhân giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly (Takayama và Akita, 1988), hoa lan hồ điệp (Yong et, al, 2000; Datta et al, 1999), cỏ ngọt với công suất 20000 chồi/ bình biorector 500lít (Takayama và Akita, 1994), ...
Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị bioreactor hoàn toàn tự động hóa. Ví dụ: một bioreactor vibro - mixer ( rung và trộn) trang bị với các ống silicone sục khí tự do đn có khả năng sản xuất 100000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong một lít dung dịch huyền phù nếu nh− dung dịch đó đ−ợc đặt trên một tấm giấy lọc và phát triển trong 4 tuần. (Preil và cộng sự, 1988)
Tuy nhiên, công nghệ này đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành rất phức tạp đặc biệt là khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy. 22 Những công nghệ mới trong vi nhân giống cây trồng (tiếp) Thuận lợi của hệ thống bioreactor so với nuôi cấy trong bình:
Thuận lợi thứ nhất là thể tích nuôi cấy tăng, th−ờng là ít nhất 1 lít. Điều này cho phép sản xuất nhiều phôi, chồi hơn mà không cần những kỹ thuật cao cấp.
Thuận lợi thứ hai, hầu hết các bình bioreactor đ−ợc thiết kế với một cơ chế khuấy, bằng cơ học hay bằng thổi khí, để duy trì nuôi cấy gần nh− đồng dạng.
Thuận lợi thứ ba, khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi tr−ờng nuôi cấy và môi tr−ờng vật lý có thể đ−ợc kiểm soát thích hợp cho sinh tr−ởng. Có những chỉ dẫn về các nhân tố môi tr−ờng nh− pH và oxygen hòa tan. Điều này không thể thực hiện đ−ợc với hệ thống nuôi cấy bình tam giác. 23 Những công nghệ mới trong vi nhân giống cây trồng (tiếp) Cách nhân giống bằng bioreactor
Bioreactor có thể đ−ợc ứng dụng để vi nhân giống thực vật trên quy mô th−ơng mại theo 3 h−ớng :  (1) Tạo chồi (chuối, dứa, hoa lan…)  (2) Tạo củ in vitro (Khoai tây, lily)  (3) Tạo phôi soma(cà phê, cao su, 24 25 26