Bài giảng Công nghệ sinh học dược phẩm

đồng thời tiết cytokin để hoạt hoá các tế bào khác Tế bào T C : mang những hạt chứa các protein có thể giết virus và tế bào ung thư. Bên cạnh do, một số tế bào T được biệt hoá thành tế bào T nhớ . Có thể tồn tại một cách yên lặng trong nhiều năm sau khi kháng nguyên được loại bỏ. Sau khi trình diện kháng nguyên Phần 2: CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC PHẨM KỸ THUẬT LÊN MEN Cơ sở công nghệ Vi sinh vật : là quá trình sinh tổng hợp bằng kỹ thuật lên men nhờ VSV trong các bình phản ứng sinh học. Môi trường dinh dưỡng + VSV → Sản phẩm + VSV + Cơ chất còn xót + Các sản phẩm phụ + Nhiệt năng Các hình thức lên men Lên men hiếu khí Lên men kị khí Ưu và nhược điểm của phương pháp sinh tổng hợp Ưu điểm : Có khả năng tạo các phân tử phức tạp như protein, kháng sinh Biến đổi sinh học cho năng suất cao hơn Sinh tổng hợp ở điều kiện ôn hòa Sản phẩm thu được không có đồng phân Nhược điểm : Dễ bị nhiễm trùng Sản phẩm thường lẫn trong phức hợp Cần xử lý 1 môi trường lớn Quá trình lên men cần có thời gian dài  Quá trình sản xuất dược phẩm bằng pp lên men VSV gồm 4 giai đoạn chính: + Lựa chọn môi trường thích hợp + Tuyển chọn giống VSV + Lên men ở đk tối ưu + Thu nhận và tinh chế SP Môi trường lên men Thành phần nuôi cấy: Nguồn Carbon Nguồn Nitơ Nguồn khoáng đa lượng: K, P, Ca, Mg, Fe Nguồn khoáng vi lượng: Co Các vitamin Chất kích thích sinh trưởng:2,4D; α -naptylacetic acid Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ pH Các nguồn nguyên liệu chủ yếu của công nghệ lên men Nguồn NL từ nông nghiệp : củ cải đường, cà phê, ca cao , dừa, chè, và các phế phụ phẩm nông nghiệp như: rơm, bã mía, chất thải gia súc, Nguồn NL từ lâm nghiệp : vỏ cây, mùn cưa, tre, nứa, dung dịch thủy phân gỗ, cellulose, Nguồn NL từ công nghiệp : mật rỉ, phế phụ phẩm của ngành chế biến thịt, cá, sữa, tinh bột Nguồn rác đô thị, bùn, nước cống , Giống vi sinh vật Yêu cầu chất lượng giống: Tạo ra sp chính với năng suất cao, sp phụ ít Phát triển tốt trên các nguồn nguyên liệu rẻ tiền Sau lên men dễ tách sản phẩm ra khỏi sinh khối Phải là chủng VSV thuần khiết Có khả năng thích ứng và sinh sản mạnh Thời gian lên men ngắn, hiệu suất cao Dễ bảo quản, bảo tồn được đặc tính di truyền trong suốt thời gian bảo quản và sử dụng Nguồn giống VSV Phân lập từ nguồn tự nhiên : chọn nguyên liệu dùng phân lập→ P hân lập canh trường tập trung→Phân lập chủng thuần khiết →Kiểm tra tính di truyền mong muốn →Tạo sự ổn định đặc tính di truyền mong muốn Nguồn giống từ ngân hàng giống hoặc bảo tồn giống : chọn điều kiện và môi trường thích hợp để kích hoạt giống trước khi đưa vào sản xuất Nguồn giống sẵn có từ các cơ sở sx : B1: phân lập lại giống vsv đang sx B2: kiểm tra tính di truyền B3: ổn định đặc tính di truyền B4: Nâng cao đặc tính di truyền huấn luyện thích nghi với đk lên men công nghiệp thay đổi cơ chế trong thông tin di truyền Các biện pháp nâng cao chất lượng giống Kỹ thuật gây đột biến Kỹ thuật dung hợp tế bào Kỹ thuật tái tổ hợp Sơ đồ tổng quát quá trình nhân giống vi sinh vật cho sản xuất: Giai đoạn nhân giống trong phòng thí nghiệm : Giống VSV được bảo quản trên mt thạch nghiêng → Nhân giống cấp 1 trong 10ml môi trường lỏng → Nhân giống cấp 2 trong 100ml môi trường lỏng → Nhân giống cấp 3 trong 1l môi trường lỏng Giai đoạn nhân giống phân xưởng : Thu nhận giống cấp 3 → Nhân giống cấp 4 trong môi trường 10l → Nhân giống cấp 5 trong 100l môi trường lỏng → Nhân giống cấp 6 với thể tích 1m 3 trong thiết bị lên men có cánh khuấy bằng thép không rỉ... Sơ đồ quá trình chuẩn bị giống lên men Các yếu tố ảnh h ư ởng đ ến quá trình nhân giống Thành phần định tính và định lượng của môi trường nuôi Điều kiện nuôi khuấy : Sự sinh trưởng của vi sinh vật trong phương pháp nuôi cấy tĩnh có thể được chia thành 6 giai đoạn: Giai đoạn thích nghi Giai đoạn sinh trưởng nhanh Giai đoạn logarit Giai đoạn sinh trưởng chậm Giai đoạn ổn định Giai đoạn suy vong Ảnh hưởng của nhiệt độ : Mỗi loài VSV sẽ có 1 giá trị nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển Ảnh hưởng của oxy : giúp VSV tổng hợp năng lượng, duy trì các hoạt động trao đổi chất và tổng hợp sinh khối Sự khuấy trộn : giúp cho môi trường lỏng trở nên đồng nhất và làm tăng hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường Ảnh hưởng của thời gian : Kết thúc quá trình nhân giống để thu nhận sinh khối vào thời điểm đầu của giai đoạn ổn định để đạt hiệu quả kỹ thuật và kinh tế cao nhất Bảo quản giống : Nếu không được bảo quản đúng kỹ thuật giống sẽ bị giảm dần hoạt tính và số tế bào chết sẽ gia tăng Các giai đoạn lên men Cấp không khí vô trùng → Cần cho các quá trình lên men hiếu khí. Không khí phải được lọc vô khuẩn vì: Khí hậu nóng ẩm→ảnh hưởng đến thiết bị lọc khí Trong không khí chứa nhiều bụi Trong không khí chứa nhiều vi sinh vật →gây nhiễm tạp khuẩn môi trường lên men Khử trùng môi trường trước khi lên men Tác nhân khử trùng : vật lý (tia X, tia cực tím, sóng siêu âm, nhiệt, hơi nước), tác nhân hóa học Khử trùng trực tiếp bằng nhiệt →gây biến tính protein, 1 số vitamin, caramen hóa đường, oxy hóa các hợp chất phenol, trùng hợp các aldehyd chưa no, xảy ra pứ Maillard tạo các basechif là các chất độc đối với nhiều VSV Khử trùng liên tục bằng hơi nước quá nhiệt : không gây biến tính các thành phần của môi trường nuôi cấy vì thời gian tiếp xúc nhiệt ngắn Khử trùng bằng hơi nước theo phương pháp cổ điển: cho hơi nước sục hẳn vào môi trường Ưu điểm : Đơn giản, dễ thực hiện Giá thành thấp Nhược điểm : gây biến tính protein, một số vit amin gây quá nhiệt → sự trùng hợp một số thành phần môi trường làm cho môi trường bị biến đổi Các phương pháp khử trùng môi trường lên men Phương pháp thanh trùng liên tục Ưu: Rút ngắn t hời gian thanh trùng Bảo tồn thành phần và t ính chất ban đầu của m ôi trường Kiểm soát tự động Nhược: T hiết bị có giá thành cao Quá trình sục khí Mục đích: Cung cấp O 2 cho 1 số qt OXH; đẩy nhanh qt làm thoát CO 2 và các khí độc hại ra khỏi môi trường Phải khử trùng không khí trước khi đưa vào môi trường lên men: Lọc sơ bộ không khí → Nén không khí → Làm lạnh không khí và tách hơi nước ngưng tụ → Khử trùng không khí Khuấy trộn Tạo sự tiếp xúc tối đa của môi trường và VSV, giúp sản phẩm trao đổi chất thoát ra khỏi TB nhanh hơn Các bọt khí có thời gian lưu trong môi trường lâu hơn→O 2 hòa tan trong môi trường nhiều hơn Sơ đồ cấu tạo thiết bị lên men chìm Thu nhận và tinh chế sản phẩm Lọc/ Ly tâm Phá vỡ tế bào Cô đặc Hòa tan Sấy khô Biến đổi Sắc ký Kết tinh Chiết xuất Tinh chế Kết tủa Lọc màng Bốc hơi Sơ đồ cắt ngang máy lọc chân không hình trống B ản chất của quá trình lên men trong sản xuất dược phẩm bằng phương pháp sinh học : Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong quá trình lên men là những phản ứng chuyển hydro và điện tử. Các enzym xúc tác cho quá trình này là các enzym oxy hóa khử (dehydrogenase, oxydase,) chủ yếu từ VSV → các quá trình lên men là các quá trình oxy hóa- khử sinh học để thu năng lượng và các hợp chất trung gian B ản chất của quá trình lên men trong sản xuất dược phẩm bằng phương pháp sinh học là thu sinh khối VSV để sinh tổng hợp ra sản phẩm theo mong muốn . KỸ THUẬT SẢN XUẤT ENZYM ĐẠI CƯƠNG Enzym là chất xúc tác sinh học, được hình thành trong tế bào sống: ĐV, TV, VSV Đặc biệt: khi tách rời E ra khỏi tế bào nó vẫn thực hiện được chức năng xúc tác Khả năng xúc tác cao E tách khỏi tế bào dưới dạng tinh khiết có thể xúc tác biến đổi cơ chất nhiều lần, với kỹ thuật đặc biệt có thể kéo dài thời gian sử dụng E Chức năng xúc tác của E còn phụ thuộc vào cấu hình không gian của chúng, chỉ cần làm thay đổi cấu hình không gian bằng pH hay nhiệt độ → E bị bất hoạt E được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống hàng ngày trong: nghiên cứu khoa học y dược học Công nghệ thực phẩm bảo vệ môi trường KỸ THUẬT SẢN XUẤT ENZYM Chọn giống vi sinh vật : Có điều kiện lên men đơn giản Tạo enzym ngoại bào Qui trình thu sản phẩm và tinh chế đơn giản Enzym ổn định trong khoảng nhiệt độ và pH rộng Môi trường lên men : Môi trường lên men xốp hoặc lên men chìm Nguyên liệu môi trường phải đơn giản và rẻ: các loại ngũ cốc, rỉ đường, cao ngô. Nguyên tắc chuyển gen để tạo enzym Trang 45 Những vấn đề cần nghiên cứu để biến đổi enzym Nâng cao hoạt tính enzym Tăng độ ổn định Cho phép enzym hoạt động ở môi trường thay đổi Thay đổi pH hoặc nhiệt độ tối ưu Thay dổi hẳn đặc tính của enzym Thay đổi phản ứng xúc tác Nâng cao hiệu quả quá trình Sơ đồ chiết xuất và tinh chế enzym Trang 48 PHƯƠNG PHÁP BẤT ĐỘNG ENZYM Các bước bất động Enzym: Enzym tinh chế được gắn hoặc được gói trong những polymer không hòa tan trong nước, hoặc hấp phụ trên các chất trơ vô cơ hoặc hữu cơ Enzym bất động được nhồi vào cột hình trụ có kích thước phù hợp Cho dung dịch cơ chất đi qua cột enzym → enzym sẽ phân cắt cơ chất thành sản phẩm tương ứng Tinh chế sản phẩm thô thu được Các phương pháp bất động enzym Microencapsulation (gói enzym trong bao cực nhỏ) Liên kết enzym vào chất mang không tan Định vị enzym trong pha lỏng của hệ thống hai pha Giữ enzym bằng màng siêu lọc Ưu điểm của phương pháp bất động enzym Cho phép sử dụng enzym nhiều lần Có thể tiến hành quá trình liên tục trong thời gian dài Cho phép kiểm tra chặt chẽ hơn quá trình xúc tác Cho phép phát triển hệ thống phản ứng nhiều enzym Hiệu quả kinh tế cao CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 V itamin B12 : cyanocobalamin C ung cấp nguyên liệu để tổng hợp ADN, góp phần vào quá trình phân chia tế bào và trưởng thành tế bào trong cơ thể Vitamin cũng có vai trò quan trọng trong chuyển hóa acid béo và duy trì bao myelin của dây thần kinh Nguồn gốc B12 do VK tổng hợp từ thiên nhiên, sau đó mới đi vào chu trình thức ăn của các động vật, chủ yếu từ các động vật ăn cỏ Trong thực phẩm, vitamin B12 có trong thức ăn nguồn gốc động vật như thịt (nhất là nội tạng, đặc biệt là gan), trứng, sữa Công thức hóa học vitamin B12 CTHH: C 63 H 88 CoN 14 O 14 P B12 = Corin + nucleotide Trong đó: Nucleotide = 5,6 dimethylbenzimidazol + đường ribose + H 3 PO 4 Corin + cobalamin (Cobalt + R) Nếu R là CN → Cyanocobalamin Nếu R là OH → Hydroxocobalamin Cobalamin Corin Ribose Nucleotide 5,6 DMB R Cobalt H 3 PO 4 + + Tính chất của vitamin B12 Tinh thể hình kim màu đỏ sẫm Nhiệt độ nóng chảy: 300 o C Tan trong nước, cồn, phenol Không tan trong ether, cloroform, aceton Dung dịch B12 trong nước có độ hấp thụ cực đại trong vùng UV ở: 278, 361 , 550nm Vitamin B12 bị ánh sáng phân hủy Lên men sinh tổng hợp vitamin B12 Các nguồn lên men tổng hợp B12: Bùn + vi khuẩn sinh metan sống kị khí Nước thải công nghiệp kháng sinh + vi khuẩn tạo kháng sinh tương ứng Str.Griseus → Streptomycin Str.aureofanciens → Tetracyclin . Lên men sinh tổng hợp B12 từ Probionibacterium shermanii Lên men sinh tổng hợp B12 từ Probionibacterium Shermanii Trực khuẩn G (+) Sống kỵ khí tùy nghi Điều kiện môi trường: pH 4,5 – 7,5 Nhiệt độ 28 – 32 o C Nguồn carbon: glucose Nguồn nitơ: các amino acid (Methionin tăng hiệu suất tổng hợp B12), muối amoni Các ion kim loại: muối cobalt Các vitamin: thiamin, biotin, acid nicotinic, acid folic Giữ giống Thành phần môi trường thạch giữ giống (%) Glucose 3,0 Cao ngô 0,5 KH 2 PO 4 0,1 CoCl 2 .6H 2 O 0,01 Agar 1,0 pH 6,8 – 7,2 Điều kiện giữ giống: Khử trùng 110 o C/20 phút Điều kiện kỵ khí bắt buộc Nhiệt độ 30 o C trong 72 giờ Nhân giống Thành phần môi trường nhân giống (%) Glucose 3,0 Cao ngô 1,5 CoCl 2 .6H 2 O 0,015 5,6DMP 0,015 pH 6,8 – 7,2 Điều kiện nuôi cấy: Khử trùng 115 o C/30 phút Điều kiện kỵ khí Nhiệt độ 30 o C/48 giờ Tỷ lệ giống: 10% Lên men Môi trường lên men tạo B12 (%): Glucose 3,0 Cao ngô 1,5 CoCl 2 .6H 2 O 0,015 5,6DMP 0,015 pH 6,8 – 7,2 Điều kiện lên men: Khử trùng 115 o C/30 phút Thời gian 6 – 7 ngày pH: 6,8 – 7,2 Cung cấp khí : Kỵ khí bắt buộc trong 2 – 3 ngày đầu Thổi khí nhẹ từ ngày thứ tư Bổ sung 5,6 DMB : Vai trò: Chuyển nhân tố B → vitamin B12, tăng hiệu suất sinh tổng hợp Nồng độ cung cấp: 1-10mg/l Thời điểm bổ sung: sau 72 giờ lên men Hiệu suất sinh tổng hợp B12 : 80-100mg/lít môi trường (trên qui mô 100 m 3 ) ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH Bước ngoặt lịch sử lớn trong y học là phát minh vĩ đại về kháng sinh của Alexander Fleming (1928) đã mở ra kỷ nguyên mới: khai sinh ngành công nghệ sản xuất kháng sinh và ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho con người. Định nghĩa : Kháng sinh là những dược phẩm đặc biệt có nguồn gốc từ VSV, bán tổng hợp hay tổng hợp; có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt 1 cách chọn lọc trên 1 nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, protozoa) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp Phân loại kháng sinh Căn cứ vào tác dụng trị bệnh có thể chia kháng sinh thành 3 loại chính: Kháng sinh kháng khuẩn Kháng sinh trị nấm Kháng sinh chống ung thư Căn cứ vào cấu trúc hóa học chia ra các nhóm : Các chất kháng sinh có cấu trúc β -lactam (penicillin, cephalosporin) Các chất kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol) Các chất kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin) Các chất kháng sinh polypeptid (polymycin, bacitracin) Các chất kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin) Các chất kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (các tetracyclin) Các chất kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin) Các chất kháng sinh chống ung thư nhóm antracyclin (daunorubicin) Các chất kháng sinh chống ung thư nhóm actinomycin (dactinomycin D) .. Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh Đơn vị kháng sinh Đơn vị kháng sinh : là lượng kháng sinh tối thiểu pha trong 1 thể tích quy ước dung dịch có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của chủng VSV kiểm định đã chọn. Thí dụ: Với penicillin là số mg penicillin pha vào trong 50 ml môi trường canh thang và sử dụng Staphylococcus aureus 209P làm chủng kiểm định Với Streptomicin là số mg pha trong 1 ml môi trường canh thang và kiểm định bằng vi khuẩn E.coli Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường được biểu thị bằng 1 trong các đơn vị là : mg/ml,  g/ml, hay đơn vị kháng sinh UI/ml hay UI/g, International Unit . Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu là đặc tính cho thấy năng lực kìm hãm hay tiêu diệt 1 cách chọn lọc các chủng VSV gây bệnh, trong khi không gây ra các hiệu ứng phụ quá ngưỡng cho phép trên người bệnh được điều trị. Đặc tính này được biểu thị qua 2 giá trị: Nồng độ kìm hãm tối thiểu ( Minimun Inhibitory Concentration - Viết tắt là MIC ) Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu ( Minimun Bactericidal Concentration - Viết tắt là MBC ) Phổ kháng khuẩn của kháng sinh Phổ kháng khuẩn của kháng sinh biểu thị số lượng các chủng gây bệnh bị tiêu diệt bởi kháng sinh này. T