Bài giảng Công nghệ sinh học trong bệnh cây

ng mã hóa và 3’UTR. Tần số thay đổi theo đơn vị phân loại (theo nghĩa số lượng tuyệt đối các loci microsatellite và motif của chuỗi lặp). Ở thực vật, tần số microsatellite cao ở thực vật có bộ gen nhỏ (vd 0.85% ở cây Arabidopsis) và thấp hơn ở cây có bộ gen lớn (vd 0.37% ở ngô). Tần số = 1.07% ở nhiễm sắc thể 22 của người và 0.21% ở tuyến trùng Caernorhabditis elegans. Trình tự phân tích microsatellite Thực hiện một phân tích microsatellite không đơn giản như đối với các phân tích dùng mồi ngẫu nhiên hoặc ISSR. Có nhiều kỹ thuật microsatellite khác nhau nhưng phổ biến nhất là PCR sử dụng 2 mồi F và R được thiết kế ở một locus bảo thủ ở 2 phía của của microsatellite. Như vậy cặp mồi này có thể được áp dụng cho mọi cá thể của loài và tạo ra sản phẩm PCR có kích thước khác nhau nếu microsatellite của các cá thể là khác nhau (hình ). Tuy nhiên để có được bộ mồi thích hợp không hề dễ dàng vì microsatellite phải được phân lập trước. Hình Phát hiện microsatellites từ DNA genome. Hai mồi F và R (mũi tên xám) được thiết kế ở 2 bên vùng microsatellite. Nếu không có microsatellite => có sản phẩm 100 bp. Giả sử có một microsatellite với chuỗi lặp CA và n = 8 (dài 16 bp) thì sản phẩm PCR có kích thước = 116 bp. Các bước chính trong phân tích microsatellite bao gồm Xây dựng thư viện microsatellite Xác định loci microsatellite duy nhất Xác định vùng thích hợp để thiết kế mồi Thử PCR Đánh giá và diễn giải các băng Đánh giá sản phẩm PCR tao sự đa hình. Xây dựng thư viện microsatellite. Đây là bước phức tạp, tốn công sức nhất. Các bước cụ thể gồm: Tinh chiết DNA genomic Cắt sản phẩm DNA genome bằng RE. Điện di sản phẩm cắt bằng agarose nồng độ thấp (khoảng 0.7%). Chọn vùng điện di chứa các băng trong khoảng 300 – 700 bp. Tinh chiết các băng khỏi gel agarose. Clone các băng (dùng TA vector hoặc adapter) vào E.coli. Chọn lọc các clone (+, có khả năng chứa microsatellite) bằng Southen blot với dò chứa các chuỗi lặp. Giải trình tự các clon +. Sau khi đã biết trình tự các clone, các mồi đặc hiệu sẽ được thiết kế và thử PCR. Vì xây dựng thư viện microsatellite theo phương pháp truyền thống rất tốn công sức (có thể mất 1 tháng để hoàn thành), hơn nữa năng suất lại không cao nên đã có nhiều kỹ thuật khác được áp dụng. Chẳng hạn, trong một kỹ thuật gọi là PIMA (PCR isolation of microsatellite arrays), thay vì cắt sản phẩm DNA genome và clone, người ta thực hiện RAPD dùng mồi ngẫu nhiên. Các sản phẩm RAPD được clone và kiểm tra bằng mồi đặc hiệu chuỗi lặp và mồi đặc hiệu vector. Kỹ thuật PIMA dựa trên cơ sở là các sản phẩm RAPD thường chứa nhiều microsatellite hơn các sản phẩm cắt ngẫu nhiên. Kỹ thuật PIMA có thể giảm thời gian xuống còn 1 tuần. Hình. Sơ đồ trình bày các bước thiết lập marker microsatellite. Bên trái là sơ đồ truyền thống và bên phải là sơ đồ PIMA (Zane et al., 2002). Bước tiếp theo là chọn các marker satellite tốt nhất và tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR. Mục tiêu là để cân bằng giữa giữa yêu cầu đặc hiệu cao và năng suất của sản phẩm PCR. Ngoài ra còn cần phải xét đến khả năng nhận được sản phẩm từ nhiều loci microsatelitte khác nhau với kích thước không trùm (overlap) lên nhau. Hiệu quả của microsatellite phụ thuộc vào sự phong phú của các chuỗi lặp vì càng nhiều chuỗi lặp khác nhau thì càng dễ chọn lựa marker thích hợp. Nhìn chung, các nhà nghiên cứu thích dùng các mồi nhằm vào các đoạn microsatellite với 3 hoặc 4 nts lặp (để tránh hiện tượng hình thành các băng “stutters” thường bắt gặp ở các microsatellite 2 nts). Microsattelite: ưu điểm chính Là marker đồng trội => cực kỳ tuyệt vời cho phân tích di truyền quần thể đối với các sinh vật giao phối. Có thể tự động hóa nếu mồi được gán nhãn huỳnh quang và được phân tích trên máy sequencer tự động. Nếu bộ mồi đã được lựa chọn thì việc áp dụng tương đối dễ dàng. Microsattelite: nhược điểm chính Như đã trình bày, việc xây dựng thư viện microsattelite và chọn lựa mồi thích hợp là cực kỳ tốn kém công sức và tiền bạc. Các sản phẩm PCR trong phân tích microsatellite thường có kích thước nhỏ (một vài trăm bp) và chênh lêch kích thước nhiều khi không nhiều dẫn tới phải điện di agarose nồng độ cao (~3 %) hoặc điện di polyacrylamide hoặc phân tích dùng máy sequencer tự động (đắt). Marker EST (expressed sequence tags) Mỗi gen phải được phiên mã sang messenger RNA (mRNA) trước khi dịch mã sang protein. Tuy nhiên vì mRNA rất không bền bên ngoài tế bào nên các nhà khoa học phải chuyển nó sang dạng DNA bổ trợ (cDNA = complementary DNA). Ngay sau khi cDNA đã được phân lập, các nhà khoa học có thể giải trình tự vài trăm nts đầu 5’ và đầu 3’ của nó để tạo ra các nhãn chuỗi biểu hiện 5’ETS hoặc 3’ ETS (expressed sequence tags). 3’ETS thường nằm trong vùng không mã hóa (intron) hoặc UTR nên có xu hướng kém bảo thủ giữa các loài hơn. EST đầu tiên được sử dụng để xác định các transcripts nhưng dần trở thành công cụ để khám phá gen nhằm có được thông tin về biểu hiện và điều hòa gen và để phát triển các marker phân tử như EST-based RFLPs, SSRs, SNPs, và CAPS. ESTs đã được sử dụng để thiết kế các dò cho microarray DNA; phát triển các marker RFLP đơn hay có số copy thấp. Các marker RFLP xây dựng từ EST đã được sử dụng rộng rãi để xây dựng các bản đồ liên kết di truyền mật độ cao. Thông thường, các marker RFLP dựa trên EST cho phép thiết lập bản đồ liên kết có khả năng so sánh giữa các loài vì vùng mã hóa thường bảo thủ. Do vậy, phát triển một marker cho 1 loài có thể sử dụng sô liệu của loài khác đã có sẵn. EST cũng cho phép tính toán để phát triển các marker SSR hay SNP. Các phần mềm tìm kiếm mô hình (pattern) cho phép xác định các chuỗi lặp SSR trong EST. Thông tin trình tự nucleotide sẵn có cho phép thiết kế các cặp mồi để kiểm tra tính đa hình của đối tượng nghiên cứu. Khoảng 1 -5% các EST ở nhiều loài cây có các SSR có độ dài thích hợp (>=20 bp). Có thể tìm một số lượng lớn SSR của một đối tượng nếu nhiều EST của nó đã được xác định. Ví dụ Kantety et al. (2002) đã tiềm kiếm các SSR với chuỗi lặp 2,3 và 4 nucleotid với độ dài tối thiểu 18 nucleotid) từ 262,631 EST của 5 loài cây (ngô, lúa, lúa mỳ, lúa miến và yến mạch) sẵn có trên cơ sở dữ liệu và phát hiện thấy rằng 3,2% EST chứa SSR. Các SSR dựa trên EST thường liên kết với các vùng phiên mã bảo thủ trong loài hơn là liên kết với các vùng không phiên mã; do đó, các SSR này có thể áp dụng trên các đối tượng thuộc cùng chi. Các SSR dựa trên EST cũng có khả năng cao hơn trong đánh giá sự biểu hiện khác nhau của gen so với các SSR dựa trên genome ngẫu nhiễn khác. Kỹ thuật CAPS CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) là một kỹ thuật kết hợp giữa PCR và RFLP nên còn có tên nguyên thủy là PCR-RFLP. Kỹ thuật rất đơn giản và gồm 2 bước: (1) PCR để nhân một đoạn genome quan tâm và (2) tiếp theo, dùng RE thích hợp để cắt sản phẩm PCR. Do vậy, CAPS phụ thuộc vào mô hình cắt bằng RE. Ưu điểm Đơn giản: chỉ PCR và cắt bằng RE (không cần phát triển dò và lai phân tử như RFLP) Chủ yếu di truyền đồng trội. Nhược điểm Khả năng phát hiện đa hình DNA không cao bằng SSR và AFLP vì mức đa hình chỉ phụ thuộc vào sự thay đổi trình tự tại vị trí nhận biết của RE trên sản phẩm PCR. Kỹ thuật SNP Đơn vị cấu trúc nhỏ nhất của bộ genome là nucleotide. Có 4 loại nucleotide là A, G, C, T. Một đa hình nucleotide đơn (SNP, single nucleotide polymorphism) hình thành ở một vị trí nucleotide, và một loại nucleotide ở vị trí này được gọi là một allele. Ví dụ, có 2 đoạn DNA CCACGTT và CCATGTT, trong đó có 2 nucleotide khác nhau ở vị trí thứ tư là C và T; trong trường hợp này chúng ta gọi SNP có 2 allele. Mặc dù sự đa hình có thể gồm 2, 3 hay 4 allele các SNP 3 hay 4 allele là cực kỳ hiếm. Do vậy, nhìn chung SNP được xem như là đa hình 2 allele. Để sai khác trở thành một SNP nó phải có tần số > 1%. Một locus SNP được gọi là đồng hợp tử khi 2 allele giống nhau và dị hợp tử khi 2 allele khác nhau. Allelle có tần số cao hơn được gọi là hoang dại (wildtype) còn allele kia được gọi là đột biến. Vì số lượng SNP khá phong phú và phân bố đều khắp bộ gen của nhiều sinh vật (Vd ở bộ gen lúa, trung bình cứ 170 bp có 1 SNP) nên SNP đã trở thành 1 công cụ phân tích di truyền hấp dẫn. Vì marker SNP chỉ là sự sai khác của 1 bp nên trái với các loại marker khác, người ta không thể phân biệt được allele trên cơ sở so sánh kích thước băng điện di. Có nhiều phương pháp genotyping dựa trên SNP và tất cả các phương pháp đều gồm 2 phần: (1) tạo một sản phẩm đặc hiệu allele và (2) phân tích sản phẩm đó. Phần lớn các phương pháp thuộc 1 trong 4 nhóm sau: Các kỹ thuật lai trực tiếp đặc hiệu allele. Dựa trên khả năng phân biệt 2 chuỗi DNA khác nhau chỉ bởi 1 nucleotide bằng lai DNA. Hai dò đặc hiệu allele sẽ được thiết kế, thường với một nucleotide đa hình ở giữa. Dưới điều kiện lai hóa đã được tối ưu hóa, chỉ các tổ hợp lai khớp nhau hoàn hảo mới ổn định. Phần lớn các lớn các kỹ thuật lai là Dot Blot trong đó DNA thử (genome, cDNA hay sản phẩm PCR) được cố đinh trên màng và được lai hóa với dò (thường là oligonucleotide). Trong kỹ thuật Dot Blot đảo, dò sẽ được cố định trước lên màng. Nhìn chung, kỹ thuật lai hóa dễ mắc lỗi nên cần phải thiết kế dò cẩn thận và chuẩn điều kiện lai. Cải tiến mới nhất đối với nhóm kỹ thuật lai là dùng microarray (xem phần). Các kỹ thuật kéo dài mồi. Có 3 nhóm chính: Minisequencing. Nucleotide đa hình được xác định bằng cách thêm một dideoxynucleotid triphosphate (ddNTP). Kéo dài mồi đặc hiệu allele. Mồi chỉ được tổng hợp tiếp nếu khớp hoàn hảo với khuôn (chú ý đầu 3’ của mồi). Pyrosequencing. Là kỹ thuật sequencing dựa trên sự phát hiện pyrophosphate giải phóng ra trong quá trình sequencing. Các kỹ thuật nối oligonucleotid. Hai dò oligonucleotid được thiết kế: một dò một dò đặc hiệu allele (đầu 3’ của nó là ở vị trí đa hình) và một dò kế tiếp phía hạ lưu. Khi lai hóa 2 dò lên chuỗi thử, nếu không có mismat ở vị trí đa hình, đầu 3’ của dò đặc hiệu allele sẽ được nối với đầu 5’ của dò thứ 2. Các kỹ thuật cắt dò. Hai dò oligonucleotide được thiết kế: dò 1 (dò xâm nhập) tương đồng phần 3’ tính từ vị trí đa hình của chuỗi thử (đầu 3’ của dò là 1 nucleotide không khớp (non-matching) với nucleotide đa hình của của chuỗi thử). Dò 2 là dò đặc hiệu allele, được thiết kế gối qua vị trí đa hình khoảng vài nucleotide. Khi lai với chuỗi thử, nếu không có mismatch, hai dò sẽ tạo ra một cấu trúc 3 hướng và 1 cleavase sẽ nhận biết được cấu trúc này và cắt phần gối của dò đặc hiệu allele. Phần bị cắ này thường được gắn với một nhãn huỳnh quang và phát huỳnh quang khi được giải phóng khỏi dò. Kỹ thuật rep-PCR Rep-PCR (repetitive sequence primed PCR) là 1 kỹ thuật PCR fingerprinting rất hiệu quả để nghiên cứu đa dạng các loài vi khuẩn. Kỹ thuật sử dụng các mồi được thiết kế dựa trên các chuỗi lặp trên bộ gen vi khuẩn như: Các chuỗi lặp đối song vùng không mã hóa (REP, repetitive extragenic palindromic) có kích thước 35 - 40 bp, các chuỗi lặp bảo thủ vùng liên gen (ERIC, enterobacterial repetitive intergenic consensus) có kích thước 124 - 127 bp, chuỗi BOX có kích thước 54-bp. Phản ứng PCR sử dụng các mồi này được gọi cụ thể là REP-PCR, ERIC-PCR và BOX-PCR. Mặc dù Gillings & olley (1997) đã chứng minh rằng các chuỗi lặp này không có ở bộ gen eukaryote nhưng kỹ thuật này cũng có thể được áp dụng để nghiên cứu đa dạng nhiều loài nấm gây bệnh cây. Các mồi rep-PCR trong trường hợp nghiên cứu nấm, như vậy, đóng vai trò như các mồi ngẫu nhiên giống như trong kỹ thuật RAPD. Bảng: các mồi được sử dụng trong rep-PCR Mồi Trình tự Tham khảo BOX A1R 5'-CTACggCAAggCgACgCTgACg-3' Versalovic et al. 1994 ERIC 1R 5'-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3' Versalovic et al. 1991 ERIC 2 5'-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3' Versalovic et al. 1991 REP 1R 5'-IIIICgICgICATCIggC-3' Versalovic et al. 1991 REP 2I 5'-ICgICTTATCIggCCTAC-3' Versalovic et al. 1991 Tóm tắt các kỹ thuật Thử thách đối với nhà nghiên cứu là làm sao chọn một hoặc vài kỹ thuật phù hợp với mục tiêu nghiên cứu của mình. Các đặc điểm mong muốn của một marker phân tử tốt là: một mặt có tính đa hình cao, di truyền đồng trội (phân biệt được cả đồng hợp tử và dị hợp tử), xuất hiện thường xuyên và phân bố đồng đều trên bộ gen, chọn lọc trung tính; nhưng mặt khác lại phải dễ tiếp cận, chi phí thấp, dễ thực hiện, có khả năng áp dụng với kết quả thống nhất giữa các phòng thí nghiệm. Không có một marker phân tử nào hiện nay có thể đáp ứng được các yêu cầu này, tuy nhiên người ta vẫn có thể chọn được các kỹ thuật mong muốn tùy đều kiện. Các yếu tố cần xét khi lựa chọn là Hệ thống marker sẵn có. Tính đơn giản và thời gian thực hiện của kỹ thuật. Mức đa hình yêu cầu của đối tượng nghiên cứu Chất lượng và số lượng DNA của đối tượng nghiên cứu Kỹ năng và trang thiết bị Kinh phí của nghiên cứu. Tính di truyền của marker trong đối tượng nghiên cứu (trội hay đồng trội) Loại thông tin di truyền cần biết Ví dụ, xét về điều kiện kinh tế, các kỹ thuật dựa trên microarray và sequencing (như SNP) hiện nay có lẽ không dễ thực hiện tại các quốc gia đang phát triển như Việt Nam. Xét về mức sẵn có của trình tự gen, các marker dựa trên EST như EST-SSR, EST-CAPS và EST-RFLP chỉ có thể áp dụng cho các loài mà các chuỗi EST đã được xác đinh trước (sẵn có trên ngân hàng gen) Nhìn chung các kỹ thuật như RFLP, SSR, RAPD, AFLP, ISSR và rep-PCR có thể được áp dụng cho nhiều đối tượng trong điều kiện Việt Nam. Các bảng dưới đây mô tả đặc điểm một số kỹ thuật/marker phổ biến Mức phân biệt trông nghiên cứu đa dạng và phân loại một số kỹ thuật/marker phân tử Loại phân tích Mức phân biệt RAPD Cá thể, nhóm dưới loài SSR (Microsatellite) Cá thể, nhóm dưới loài, loài gần gũi (một số) AFLP Cá thể, nhóm dưới loài, loài gần gũi RFLP dựa trên mtDNA Nhóm dưới loài, loài gần gũi RFLP dựa trên vùng ITS/IGS Loài gần gũi, nhóm dưới loài Sequencing vùng ITS Loài gần gũi, nhóm dưới loài (một số) Sequencing vùng rRNA Ngành (phylum), họ, chi, loài Các gen mã hóa protein cấu trúc/chức năng Ngành (phylum), họ, chi, loài, dưới loài (một số) Bảng. Đặc điểm một số kỹ thuật/marker phân tử RFLP Microsatellite RAPD AFLP ISSR Mức phong phú trên bộ gen Cao Trung bình Rất cao Rất cao Trung bình Phần gen được khảo sat Các vùng mã hóa có số copy thấp Toàn bộ genome Toàn bô genome Toàn bộ genome Toàn bộ genome Lượng DNA yêu cầu Cao Thấp Thấp Trung bình Thấp Chất lượng DNA yêu cầu Cao Trung bình Trung bình Cao Trung bình Loại đa hình Các thay đổi, thêm, mất nucleotide đơn Các thay đổi độ dài đoạn lặp Các thay đổi, thêm, mất nucleotide đơn Các thay đổi, thêm, mất nucleotide đơn Các thay đổi, thêm, mất nucleotide đơn Mức đa hinh* Trung bình Cao Cao Rất cao Cao Di truyền của marker Đồng trội Đồng trội Trội Trội Trội Phát hiện allele Có Có Không Không Không Dễ sử dụng Rất nhiều bước Dễ Dễ Lúc đầu khó Dễ Khả năng tự động Thấp Cao Trung bình Trung bình Trung bình Tính lặp lại (độ tin cậy) Cao Cao Trung bình Cao Trung bình – Cao Loại dò/mồi DNA genome có số copy thấp hoặc clone cDNA Các chuỗi DNA lặp đặc hiệu Thường dài 10 nts (ngẫu nhiên) Các chuỗi đặc hiệu Các chuỗi DNA lặp đặc hiệu Cloning và/hoặc sequencing Có Có Không Không Không Phát hiện dùng bức xạ Có/không Không Không Có/Không Không Chi phí khởi đầu Cao Cao Thấp Trung bình Trung bình Hiện trạng bản quyền Không Không (một số có) Có Có Không Chương 4. Phân tích kết quả dựa vào số liệu băng điện di Giới thiệu Các loại marker phân tử khác nhau sẽ cho các kết quả điện di khác nhau. Ví dụ kỹ thuật RFLP và một số kỹ thuật fingerprinting khác như microsatellite (SSR) nhìn chung sẽ tạo các băng điện di đơn, thường từ 1 – 20 băng. Các băng này có thể dễ dàng chuyển sang dạng số liệu nhị nguyên (có băng = 1, không có băng = 0). Dựa trên số liệu này, người ta có thể tính toán mức tương đồng di truyền S (xem các công thức tính hệ số tương đồng) và khoảng cách di truyền D (=1-S), cuối cùng là xây dựng một cây phả hệ thường thông qua phân tích cụm. Phân tích dựa trên băng điện di giống nhau cho 2 nhóm phân tích. Nhóm 1 thường tạo ít băng (điển hình RFLP, microsatellite, ISSR) Nhóm 2 thường tạo rất nhiều băng phức tạp (điển hình AFLP, rep-PCR). Mặc dù các băng có thể được đánh giá và ghi bằng tay thì thông thường người ta dùng một 1 phần mềm hình ảnh để scan các băng, điều chỉnh, chọn lựa và chuyển sang dạng số liệu nhị thức. Vd phần mềm CrossChecker (miễn phí): Vd phần mềm GelcomparII (thương mại): Hình. Biến dị allele trong phân tích microsatellite đối với nấm đạo ôn lúa (Pyricularia oryzae. (Prondani et al. 2000). Một ví dụ về mô hình băng điện di đơn giản Hình Đa dạng gen trong phâ tích rep-PCR đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae (Cruz et al 1996). Một ví dụ về mô hình băng điện di phức tạp. Các bước chính trong phân tích đa dạng dựa trên băng điện di Mô tả sự đa dạng Việc mô tả sự đa dạng có thể được thực hiện giữa các cá thể trong quần thể, giữa các quần thể trong một khu vự với nhau, thậm chí giữa các đơn vị quần thể lớn hơn nhiều (ví du gữa các vùng thuộc các lục địa khác nhau). Locus Cá thể /quần thể 1 2 3 4 5 6 Số liệu marker A 1 0 1 1 0 1 B 1 0 0 0 1 1 C 0 1 1 0 1 0 D 1 0 0 0 1 1 E 0 0 1 1 0 0 F 1 1 1 0 0 0 G 1 0 1 0 1 1 Tính toán mối quan hệ giữa các đơn vị được phân tích ở bước trên Bước này chủ yếu tính khoảng cách di truyền giữa các cặp đơn vị phân tích. Ví dụ. Khoảng cách di truyền giữa các cá thể 1 2 3 4 5 6 1 0 2 0.56 0 3 0.33 0.33 0 4 0.47 0.26 0.50 0 5 0.32 0.43 0.37 0.28 0 6 0.33 0.56 0.56 0.37 0.46 0 Biểu diễn mỗi quan hệ Biểu diễn mối quan hệ bằng các phương pháp khác nhau (ví dụ vẽ cây phả hệ…) Cá thể 5 Cá thể 3 Cá thể 6 Cá thể 4 Cá thể 2 Cá thể 1 Hình. Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ giữa các cá thể ở trên. Lượng hóa mức đa dạng: đo đa dạng trong quần thể Dựa trên số lượng biến dị Mức đa hình hay tỷ lệ đa hình (Pj) Một gen được xem là đa hình nếu tần số của một trong các allele của nó ≤ 0.95 hoặc 0.99 Pj = q ≤ 0.95 hoặc Pj = q ≤ 0.99 Trong đó, Pj = tỷ lệ đa hình q = tần số allele Pj chủ yếu được sử dung với các marker đồng trội vì các marker trội có thể bỏ qua các biến dị hợp tử. Một gen đa hình thường là gen mà allele phổ biến nhất của nó có tần số ≤ 0.95 . Các allele hiếm của nó có thể có tần số ≤ 0.005. Đặt giới hạn tần số 0.95 hay 0.99 là tùy ý. Tỷ lệ các locus đa hình (P) Tỷ lệ locus đa hình được tính theo công thức đơn giản sau: Trong đó, P = tỷ lệ các locus đa hình npj = số lượng các locus đa hình ntotal = tổng số locus nghiên cứu P biểu diễn phần trăm các locus đa hình trong quần thể, được tính toán dựa trên đếm trực tiếp các locus đa hình và tổng số locus nghiên cứu. P chủ yếu được sử dụng cho các loại marker đồng trội Số allele trung bình trên locus Số allele trung bình trên locus cung cấp thông tin về mức độ đa dạng của quần thể. Nó được tính bằng công thức đơn giản sau: Trong đó, n = số allele trung bình trên locus K = tổng số locus ni = tổng số allele phát hiện thấy ở locus thứ i Số allele trung bình trên locus được sử dụng với các marker đồng trội vì marker trội không cho phép phát hiện tất cả các allele. Dựa vào tần số biến dị Số lượng allele hiệu quả (Ae) Số lượng allele hiệu quả cho biết số allele có thể có mặt ở một locus trong quần thể và được tính theo công thức sau Trong đó, pi = tần số của allele thứ i ở một locus h = 1 – Σpi2 (mức dị hợp tử (heterozygosity) tại một locus) Số lượng allele hiệu quả có thể được sử dụng với các marker đồng trội Giá trị của nó bị ảnh hưởng bởi kích thước mẫu thử, do vậy nó có ý nghĩa trong chọn lựa cách lấy mẫu. Ví dụ, chúng ta tính Ae trong một mẫu, sau đó ta tính Ae của một mẫu thứ 2 hoặc toàn bộ mẫu. Nếu số liệu lần thứ 2 nhỏ hơn lần thứ nhất thì có lẽ chúng ta phải lấy lại mẫu. Ví dụ tính số lượng allele hiệu quả Ae Locus (A, B, C) Quần thể 1 Quần thể 2 Cá thể 1 A1 A1 B1 B1 C1 C1 A1 A1 B1 B3 C1 C1 Cá thể 2 A1 A2 B1 B2 C2 C2 A1 A1 B2 B3 C1 C1 Cá thể 3 A1 A1 B1 B1 C1 C3 A2 A2 B1 B4 C1 C1 Cá thể 4 A1 A3 B1 B3 C2 C3 A2 A2 B1 B1 C1 C1 Cá thể 5 A3 A3 B3 B3 C3 C3 A1 A2 B4 B4 C1 C1 Số allele 3 3 3 2 4 1 Tần số allele 1 0.60 0.60 0.30 0.50 0.40 0.10 Tần số allele 2 0.10 0.10 0.30 0.50 0.10 0.00 Tần số allele 3 0.30 0.30 0.40 - 0.20 0.00 Tần số allele 4 - - - - 0.30 - Mức dị hợp tử (h) 0.54 0.54 0.66 0.50 0.70 0.00 Số allele hiệu quả (Ae) 2.17 2.17 2.94 2.00 3.33 1.00 Mức dị hợp tử kỳ vọng trung bình (H = mức đa dạng di truyền Nei (D) Mức đa dạng di truyền Nei là xác suất để 2 allele bất kỳ tại một locus được lấy ngẫu nhiên trong quần thể là khác nhau. Có 3 cách tính : (khi một locus chỉ có 2 allele) (khi một locus thứ j có i allele) (khi tính trung bình cho tất cả các locus Trong đó, hj = mức dị hợp tử (heterozygosity) trên locus p và q = các tần số allele H = mức dị hợp tử (heterozygosity) trung bình trên nhiều locus L = tổng số locus H là một ước lượng mức độ biến dị di truyền trong quần thể, được tính bằng cách lấy 1 trừ tần số đồng hợp tử tại 1 locus. Quá trình được lặp lại cho tất cả các locus và được lấy trung bình. H có thể được áp dụng cho cả 2 loại marker (trội và đồng trội). H có giá trị từ 0 đến 1 H đạt giá trị tối đa khi tất cả các allele có tần số bằng nhau. Để đảm bảo ý nghĩa thống kê, nên phân tích khoảng 30 locus / 20 cá thể /quần thể. Ví dụ tính đa dạng di truyền trong quần thể dùng 1 marker đồng trội Ví dụ Nửa trên của hình là một sơ đồ gel với 30 cá thể được phân tích với môt marker đồng trội (ví dụ RFLP hoặc SSR). Marker này phát hiện 5 locus là A, B, C, D và E. Trong số các locus này, chỉ có 3 locus là đa hình (A, B và E). Để đơn giản, chúng ta giả sử chỉ có tối đa 2 allele / locus. Nửa dưới của hình là kết quả ghi điểm các băng cho mỗi cá thể và mỗi locus. Chú ý là các băng thuộc locus C và D cũng được ghi điểm mặc dù điều này không cần thiết vì chúng không tạo ra sự đa dạng. Ví dụ cá thể 1 và 2 sẽ có số liệu sau: Cá thể 1: 1101101001 Cá thể 2: 0101101011 Các bước tính (bảng dưới) Đầu tiên, chúng ta để ý thấy rằng các locus A, B và E là đa hình vì chúng có tần số allele nhỏ hơn 0.99. Trái lại, locus C và D là đơn hình (monomorphic) vì chúng có các tần số allele = 1. Chú ý các chữ viết tắt: exp. = expected value; obs. = observed value. Tỷ lệ các locus đa hình (P) = 3/5 = 0.6 hay 60%. Để tính mức dị hợp tử trung bình quan sát (Ho ), chúng ta: Đếm số locus dị hợp tử. Ví dụ: cá thể 1 có có 1 locus dị hợp tử (A), cá thể 2 có 1 locus dị hợp tử (E), cá thể 27 có 2 locus dị hợp tử (A và E),….Tổng số, chúng ta có 16 cá thể đơn hình (tức là chỉ có 1 băng ở tất cả 5 locus), 13 cá thể có 1 locus dị hợp tử và 1 cá thể có 2 locus dị hợp tử. Tính mức dị hợp tử quan sát (Ho = observated heterozygosity): Ho = [16(0/5) + 13(1/5) + 1(2/5)]/(30) = 0.1 Mức đa dạng gen trong nội bộ quần thể (hj) được tính cho mỗi locus theo công thức ở hàng trên của bảng (như vậy, có thể gọi hj là mức đa dạng gen trong nội bộ locus) . Kết quả, hj của của locus A = 0.23, của locus B = 0.41 và của locus E = 0.46. Mức đa dạng gen trung bình (Hi) (i = intrapopulation = nội bộ quần thể) được tính theo công thức là: Hi = (0.23 + 0.41 + 0.46)/5 = 0.22 Bang. Tính một số chỉ số đa dạng quần thể từ ví dụ trên Locus Số liệu phân tích Tần số allele hj = 1 – p2 –q2 Hi A Kiểu gen A1A1 A1A2 A2A2 Tổng p q 0.22 Tần số gen (exp.) p2 2pq q2 1 Số cá thể 2 4 24 30 Tần số gen (obs.) P11 = 0.07 P12 = 0.13 P22 = 0.80 1 0.13 0.87 0.23 B Kiểu gen B1B1 B1B2 B2B2 Tổng p q Tần số gen (exp.) p2 2pq q2 1 Số cá thể 7 3 20 30 Tần số gen (obs.) P11 = 0.23 P12 = 0.10 P22 = 0.67 1 0.28 0.72 0.41 E Kiểu gen E1E1 E1E2 E2E2 Tổng p q Tần số gen (exp.) p2 2pq q2 1 Số cá thể 15 8 7 30 Tần số gen (obs.) P11 = 0.50 P12 = 0.27 P22 = 0.23 1 0.63 0.37 0.46 Ví dụ tính đa dạng di truyền trong quần thể dùng 1 marker trội Ví dụ Nửa trên của hình là một sơ đồ gel với 30 cá thể được phân tích với môt marker trội (ví dụ AFLP hoặc ISSR). Marker này phát hiện 5 locus là A, B, C, D và E. Trong số các locus này, chỉ có 3 locus là đa hình (A, B và E). Tương tự như ở ví dụ marker đồng trội, để đơn giản, chúng ta giả sử chỉ có tối đa 2 allele / locus. Nửa dưới của hình là kết quả ghi điểm các băng cho mỗi cá thể và mỗi locus. Chú ý, vì là marker trội nên các băng sẽ được ghi điểm là 1 nếu có mặt hoặc 0 nếu không có mặt. Các băng ở locus C và D (locus đơn hình) có thể không cần ghi điểm hoặc nếu có ghi thì chúng nhận giá trị 1 cho tất cả các cá thể. Ví dụ cá thể 1 và 2 sẽ có số liệu sau: Cá thể 1: 100 (hoặc 10110) Cá thể 2: 001 (hoặc 00111) Các bước tính (bảng dưới) Đầu tiên, chúng ta thấy rằng các locus A, B và E là đa hình vì chúng có tần số allele nhỏ hơn 0.99. Trái lại, locus C và D là đơn hình (monomorphic) vì chúng có các tần số allele = 1. Chú ý các chữ viết tắt: exp. = expected value; obs. = observed value. Tỷ lệ các locus đa hình (P) = 3/5 = 0.6 hay 60%. Mức dị hợp tử trung bình He khôn