Bài giảng Nguyên lý phương pháp chọn giống cây trồng - Chương 5: Phương pháp tạo biến dị di truyền trong chọn giống cây trồng

ng; Không xác định đƣợc vị trí, số lƣợng gene đột biến; Phần lớn các đột biến là những biến dị có hại, tỉ lệ biến dị có lợi thấp (10-6). Ngày nay, công nghệ gene có thể khắc phục đƣợc những khó khăn này. 5.2.2. Phân loại đột biến a) Đột biến ở mức phân tử ADN Đột biến làm thay đổi cấu trúc phân tử ADN đƣợc gọi là “đột biển điểm” hay “đột biến gen” ở nhiều mức khác nhau: Đột biến điểm (Point Mutation) là đột biến làm thay đổi một cặp cơ bản trên phân tử ADN, thay một nucleotide này bằng một nucleotide khác. Đột biến mất đoạn (Deletion mutation) là đột biến làm mất một hay nhiều hơn các nucleotide trên gen hoạch nhiễm sắc thể. Đột biến chèn đoạn (Insertion mutation) là đột biến lồng thêm ít nhất một nucleotide và chuỗi ADN. Ngoài ra còn có các đột biến tạo ra gen chức năng hoặc không có chức năng, đột biến gây ra sắp xếp ADN trở dạng hoang dại của chúng, đột biến phá vỡ gen quyết định dẫn đến gây chết cơ quan sông đang phát triển 7/18/15 6 b) Đột biến ở mức độ nhiễm sắc thể: Bao gồm thay đổi cấu trúc NST và số lƣợng NST Đột biến thiếu đoạn, đảo đoạn, đổi đoạn, lặp đoạn. Dạng đột biến này đƣợc gọi là “đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể”. Mức độ thay đổi số lƣợng nhiễm sắc thể nhƣ tăng hay giảm số lƣợng nhiễm sắc thể tạo ra các thể đa bội, đơn bội hay lệch bội. Dạng đột biến này đƣợc gọi là “đột biến số lƣợng nhiễm sắc thể”. c. Đột biến thể khảm (Chimaras): Theo R. Daniel Lineberger: “Một cây đƣợc gọi là đột biến thể khảm khi các tế bào có trên một kiểu gen đƣợc tìm thấy ở các mô sinh trƣởng liền kề nhau của cây”. Các cây có đốm màu khác nhau có thể là dạng chung nhất để nhận biết đột biến thể khảm. Thể khảm có ý nghĩa quan trọng trong chọn tạo giống cây sinh sản vô tính, cây hoa, cây cảnh. Phân loại đột biến thể khảm: Đột biến thể khảm ra ở đỉnh sinh trƣởng phát triển ở các lớp khác nhau và phân thành 3 loại khảm chính là: Khảm từng phần Khảm quạt Khảm vòng. Hình 5.15. Hình thành và phát triển của khảm 5.2.3. Các tác nhân gây đột biến a) Tác nhân vật lý Tác nhân Đặc điểm Tia X Bƣớc sóng ngắn λ = 0,05 - 10Å, sức đâm xuyên mạnh từ vài mm đến vài cm Tia Gamma (γ) Bƣớc sóng rất ngắn λ < 0,05Å, sức xuyên mạnh hơn tia X nhƣng không mang điện nên chỉ có tác dụng điện ly gián tiếp nhờ hiệu ứng quang điện. Trong sinh học thƣờng sử dụng tia γ là đồng vị phóng xạ Co60 và Ce137 Neutron (nhanh, chậm, nhiệt) Tạo ra từ lò phản ứng nhiệt hạch, rất nguy hiểm, mức đâm xuyên mạnh. Tia alpha (α) Đƣợc hình thành từ hạt nhân của nguyên tử helium (He), gồm 2 proton và 2 nơtron. tia α có khả năng xuyên sâu 0,07mm trong mô sinh vật. Tia tử ngoại UV Bƣớc sóng 200 – 400nm (nanomet). Photon của tia UV có năng lƣợng thấp, không xuyên sâu nên không tác động đến tế bào nằm sâu trong cơ thể sinh vật nhƣng có tác dụng khi xử lý hạt phấn và noãn. Tần số gây đột biến của tia này khá cao vì bƣớc sóng của nó trùng với bƣớc sóng DNA hấp phụ (từ 260 – 265nm). b) Tác nhân hoá học Trình tự tác động của các tác nhân hoá học: Trước hết, chúng đi vào các bộ phận tế bào, gây chấn thương ở mức phân tử; Sau đó, tác nhân hoá học tương tác với các sản phẩm trung gian trong tế bào và cùng với sản phẩm của tương tác tác động vào ADN. Đây là giai đoạn tiền đột biến. Cuối cùng, các liên kết hoá học làm sai lệch thông tin đã gây ra đột biến. Các tác nhân gây đột biến gồm: Các chất oxy hoá khử và các gốc tự do: H2O2, HNO2, các aldehyd, các muối kim loại nặng. Các chất alkyl hoá: ethylmethan sunfonat (EMS), nitrozoethyl-urea (NEU), nitrozomethylurea (NMU), ethylenimin (EI), diethylsulphat (DES), dimethylsunphat (DMS), Các chất đồng đẳng của base nitơ: cafein, 5-bromuaraxin (5-BU), aminopurin, các hợp chất chứa halogen Các chất cảm ứng với base: ethylurethan, 5-aminouracin, teobromin Các chất nhóm acridin (C13H9N): proflavin đƣợc dùng nhiều trong nghiên cứu đột biến gene. Ngoài ra còn một số chất hóa học: H2S2O7, Na2CO3, Na3PO4, ... 7/18/15 7 c) Tác nhân sinh học: Virus là nhóm sinh học có thể mang gen lạ, xâm nhập vào cơ thể cây trồng để gây đột biến. Đây là một trong những công cụ của phƣơng pháp chuyển gen. 5.2.4. Vật liệu và phƣơng pháp xử lý đột biến a) Vật liệu xử lý là những bộ phận có khả năng hoạt động sống Các bộ phận xử lý: cây, hạt khô, hạt ƣớt, mầm, bộ phận sinh dƣỡng, hạt phấn, tế bào, phôi, calus trong nuôi cấy mô. b) Phƣơng pháp xử lý Phƣơng pháp xử lý tuỳ thuộc vào tính chất của các tia, liều lƣợng, loại hoá chất, nồng độ. Khi xử lý đột biến cần chú ý đến đặc tính sinh lý của cây, thời gian và bộ phận cây trồng đƣợc xử lý. Liều lƣợng và nồng độ hoá chất căn cứ vào liều lƣợng gây chết (lethal dose) - giá trị LD50. LD50 đƣợc xác định bằng nghiên cứu cụ thể với loại tác nhân và vật liệu xử lý. Liều lƣợng xử lý bằng TNVL đƣợc đo bằng các đơn vị Rad, Kr hay Gray. Đơn vị tiêu chuẩn thống nhất là Gray viết tắt là Gy (Gray (Gy) = 1 Joule = 100rad, rad = 100erg/g vật chất), Nồng độ xử lý bằng tác nhân hóa học có đơn vị là mM hoặc ppm. Bảng 5.3. Liều lƣợng và thời gian xử lý đột biến đối với hạt lúa khô Tác nhân đột biến Liều lƣợng và thời gian xử lý Neutrons nhanh 3 - 8 Gy X-rays X-rays 95 - 250 Gy Tia gamma gamma rays 100 – 350 Gy MNH (MNU) MNH (MNU) (0,7–1,5 mM) x (3 – 5 h) ENH (ENU) ENH (ENU) (1,7–2,5 mM) x (3 - 5 h) EMS EMS (0,2 – 0,5%) x (8–20 h) NaN3 NaN3 (0,5 – 2 mM) x (3-5 h) c) An toàn trong xử lý đột biến Phải tuân thủ các quy tắc, quy định an toàn và đảm bảo hiệu quả xử lý. Việt Nam đã ban hành luật “Luật năng lƣợng nguyên tử” năm 2008. Một số nguyên tắc cơ bản là: Phải có phòng thí nghiệm chuyên dụng đủ tiêu chuẩn an toàn, hoặc khu vực xử lý an toàn. Cán bộ thực hiện phải đƣợc đào tạo Phải đầy đủ trang thiết bị bảo hiểm an toàn cho ngƣời thực hiện Sau khi sử lý phải có phƣơng pháp đảm bảo phân rã hết phóng xạ hay độc tố mới đƣợc sử dụng Hình 5.16. Cánh đồng xử lý đột biến ở Viện Đột biến tạo giống (IRB) quốc gia Nhật Bản 5.2.5. Chọn lọc sau đột biến Vật liệu xử lý đột biến là thế hệ M0 đƣợc gieo trồng và thu hoạch gieo trồng M1 và thu hoặc trồng quần thể M2. Bắt đầu từ quần thể M2 phân thành hai khu chọn lọc, một khu vực tiếp tục chọn lọc các thế hệ phân ly, một khu vực khác đánh giá các dòng đã thuần để phát triển giống mới hoặc làm vật liệu khởi đầu cho phƣơng pháp tạo giống khác nhƣ lai, chuyển gen Chọn lọc sau đột biến đối với cây sinh sản sinh dƣỡng phân thành 2 nhóm, (i)Nhóm cây cần tách đột biến riêng rẽ ra khỏi thể khảm sử dụng nhân và ghép vô tính tạo thành các dòng vô tính ở thế hệ sau. Qua một số thế hệ chọn lọc đánh giá độ thuần và các đặc điểm nông sinh học khác để phát triển thành giống mới. (ii)Nhóm cây không cần tách đột biến ra khỏi thể khảm nhƣ hoa và cây cảnh đánh giá đột biến ổn định nhân vô tính phát triển thành giống mới. 7/18/15 8 Chọn lọc sau đột biến với cây sinh sản hữu tính: tƣơng tự nhƣ chọn lọc phân ly sau lai điểm khác biệt là có thể chọn lọc một quả, một bông để hình thành dòng ở thế hệ sau mà không nhất thiết từ một cây hay một khóm nhƣ chọn lọc sau lai. Yêu cầu chọn lọc quần thể phân ly lớn, ƣớc lƣợng độ lớn quần thể M1 theo Brock (1971). 1log(1 p )N log(1 )    Trong đó: N là số cá thể M1 sống sót để tạo gia đình M2; µ là tỉ lệ đột biến; p1 là xác suất ít nhất xảy ra một đột biến. Bảng 5.4. Yêu cầu số cá thể của gia đình M2 đảm bảo xuất hiện đột biến Tỉ lệ đột biến Số gia đình M2 p1 = 0,90 p1 = 0,99 10-2 233 465 10-3 2.326 5.652 10-4 23.260 46.520 10-5 232.600 465.200 5.3. ĐA BỘI THỂ 5.3.1. Khái niệm và ý nghĩa đa bội trong chọn giống Khái niệm: “Đa bội thể là những sinh vật trong tế bào sinh dƣỡng có số lƣợng nhiễm sắc thể tăng theo bội số nguyên lần của bộ nhiễm sắc thể đơn bội (từ 3n trở lên)”. - Một số dạng đa bội Bảng 5.5. Đa bội ở một số loài cây trồng Loài cây trồng Đơn bội (n) Đa bội Họ cà 6 hoặc 12 24, 36, 48, 60, 72, 96, 108 Lúa nƣớc 12 24, 48 Cải bẹ 8, 9, 10 16, 18, 20 Mía 40 80, 120 Đặc điểm dạng đa bội Sinh trƣởng, phát triển mạnh hơn nên khả năng thích ứng tốt nhƣ cây chuối Thân lá to nên năng suất xanh cao Bất dục đặc biệt dạng tam bội 3n. Nhiều trƣờng hợp bất dục hoàn toàn Hàm lƣợng các chất cao nhƣ đƣờng, methol bạc hà Những điểm hạn chế ở cây đa bội Đa bội thể cao (6n, 8n) có hiện tƣợng sinh trƣởng phát triển không bình thƣờng, cây thấp đi do tế bào dầy không phát triển chiều dài. Hiện tƣợng bất dục khó khăn đối với lấy hạt. Trong trƣờng hợp nhân giống hữu tính, quá trình sản xuất hạt giống rất khó khăn 5.3.2. Phân loại đa bội thể a) Đa bội cùng nguồn (autopoly ploidy) Đa bội cùng nguồn hay còn đƣợc gọi là đồng nguyên đa bội, tự đa bội là hiện tƣợng đa bội thể đƣợc tạo nên từ bộ nhiễm sắc thể giống nhau của cùng một loài - Tam bội - Autotriploidy (3x) - Tứ bội - Autotetraploidy (4x) - Ngũ bội - Autopentaploidy (5x) - Lục bội - Autohexaploidy (6x) b) Đa bội khác nguồn (Allopolyploidy) - Tứ bội khác nguồn - Allotetraploidy (2x1+2x2) - Lục bội khác nguồn - Allohexaploidy (2x1+2x2 + 2x3) - Bát bội khác nguồn - Allooctaploidy (2x1+2x2 + 2x3 + 2x4) Hình 5.17. Những con đƣờng chủ yếu hình thành đa bội 7/18/15 9 c. Đa bội lệch (aneuploid) Đa bội lệch là sự thay đổi bộ NST không bằng bội số mà từng NST riêng biệt Công thức tổng quát: 2n ± x (x: số NST) Đa bội lệch đƣợc phát hiện ở nhiều loài cây trồng: lúa mì, ngô, cà chua, bông, thuốc lá Các dạng đa bội lệch dẫn tới biến dị dị hình, sức sống kém do mất cân bằng bộ NST, không phân bào đƣợc nên bất dục, không hoặc ít có giá trị trong chọn giống mà chỉ có thể sử dụng để xác định nhóm gen liên kết. 5.3.3. Phƣơng pháp tạo đa bội thể Nguyên tắc xử lý đa bội: xử lý đa bội có thể dùng tác nhân lí, hoá học... tác động vào sơ thể sinh vật đặc biệt lúc tế bào đang phân chia dẫn đến phân chia không bình thƣờng và hình thành đa bội. Các phƣơng pháp xử lý Phƣơng pháp gây chấn thƣơng: có hiệu quả nhất ở cây họ cà. Phƣơng pháp thay đổi nhiệt độ đột ngột. Phƣơng pháp hoá học: xử lý bằng chất colchicine, idol axetic axit, sunfamit... Phƣơng pháp tạo đa bội thể bằng colchicine (C22H25NO6) Colchicine là một chất hoá học đƣợc chiết từ cây (Colchicum autumnale) có nhiều ở vùng Địa Trung Hải, colchicine dạng tinh thể, màu trắng tan trong rƣợu và benzen, không tan trong nƣớc. Nồng độ và thời gian xử lý tùy thuộc vào vật liệu và loài cây trồng, nồng độ dao động từ 0,01 – 1,6%, thời gian xử lý từ 30 phút đến 10 giờ. Một số loài cây trồng khi xử lý có bổ sung thêm hóa chất khác nhƣ DMSO (Dimethyl sulfoxide - (CH3)2SO). Khi xử lý trực tiếp lên đỉnh sinh trƣởng của cây trên đồng ruộng thời gian ngắn hơn và lặp lại một vài ngày. Sau khi xử lý phải rửa sạch bằng nƣớc vô trùng 30 phút Phƣơng pháp xử lý tuỳ thuộc vào từng trƣờng hợp cụ thể Tiêm vào đỉnh sinh trƣởng Dùng bông thấm đặt lên đỉnh sinh trƣởng cây con khi lá mầm mở Nhúng đỉnh sinh trƣởng hoặc đỉnh rễ vào dung dịch colchicine Phun dung dịch colchicine lên đỉnh sinh trƣởng của cây con Tạo đa bội thể bằng lai Các thể đa bội có thể tiến hành lai với nhau nhƣ lai giữa dạng tứ bội (4n) và nhị bội (2n) tạo ra dạng tam bội (3n). Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng thành công ở một số loài cây trồng nhƣ dƣa hấu tam bội, dâu tằm tam bội. Sử dụng các vật liệu đa bội theo các hƣớng sau: Chọn lọc sử dụng trực tiếp. Tạo giống lai làm vật liệu cho các tổ hợp lai. Khắc phục hiện tƣợng bất dục trong lai xa. 5.4. ĐƠN BỘI THỂ VÀ ĐƠN BỘI KÉP 5.4.1. Khái niệm Đơn bội (Haploid) là thực vật có bộ nhiễm sắc thể n = 1 nhƣ một giao tử đực là hạt phấn hoặc giao tử cái là tế bào trứng. Đơn bội kép (Double Haploid - DH) có bộ nhiễm sắc thể 2n giống hệt nhau do nhân lên từ bộ NST đơn bội và có thể hình thành từ tế bào trứng hoặc hạt phấn. Chawla (2002) khái niệm đơn bội kép (DH) là một kiểu gen đƣợc đƣợc hình thành khi các tế bào đơn bội trải qua quá trình nhân đôi nhiễm sắc thể. 5.4.2. Giá trị của cây đơn bội và đơn bội kép Để tiến hành nghiên cứu di truyền các tính trạng. Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn in vitro Đến nay, số lƣợng các cây đơn bội của hơn 247 loài thuộc 88 chi và 34 họ thực vật hạt kín đã đƣợc tạo ra từ nuôi cấy bao phấn và hạt phấn. H.H. Geiger và G.A. Gordillo (2010) cho rằng tiến bộ chủ yếu của dòng DH trong chọn tạo giống ngô lai là (i)biến di di truyền tối đa, (ii)đồng hợp hoàn toàn, (iii)nhanh thƣơng mại, (iv)đơn giản, (v)giảm chi phí (vi)(vi) tối ƣu cho ứng dụng marker. 7/18/15 10 5.4.3. Phƣơng pháp tạo đơn bội (Haploid) và đơn bội kép (DH) Phƣơng pháp 1: Tạo đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn Một số kỹ thuật tạo đơn bội nhƣ: Chiếu xạ hạt phấn Trì hoãn thụ phấn Sử dụng tế bào chất lạ hoặc tác nhân thụ phấn Lai xa Tạo đa phôi Ghép cây con Xử lý hóa chất Các bƣớc nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội: Bƣớc 1: Lựa chọn kiểu gen Bƣớc 2: Trồng và chăm sóc cây cho phấn Bƣớc 3: Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy Bƣớc 4: Thu bao phấn, khử trùng, bảo quản Bƣớc 5: Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây Bƣớc 6: Chuyển cây ra giá thể, ngoài đất và đánh giá chọn lọc dòng. Bƣớc 1: Lựa chọn kiểu gen Kiểu gen là dòng, giống thuần, giống thụ phấn tự do hoặc con lai F1 đƣợc chọn để trồng cây cho phấn. Bƣớc lựa chọn kiểu gen rất quan trọng, quyết định khả năng nuôi cấy thành công. Kiểu gen của mỗi loài cây trồng phản ứng khác nhau với nuôi cấy bao phấn. Nhiều nhà nghiên cứu khẳng định nuôi cấy bao phấn ở lúa (Ozyza sativa L.) gặp khó khăn là khả năng tạo calus của hạt phấn rất thấp và sai khác lớn khi tái sinh cây Loài phụ Japonica khả năng tạo calus tốt hơn loài phụ Indica Kết quả nuối cấy tạo ra cây đơn bội, cây lƣỡng bội và cây tam bội, sau nuôi cấy tiến hành đánh giá và chọn lọc cây đơn bội. Bƣớc 2: Trồng và chăm sóc cây Trồng và chăm sóc cây lấy bao phấn trong điều kiện phù hợp với loài, trong một số trƣờng hợp trồng trong nhà kính, nhà lƣới và trong chậu vại. Bƣớc 3: Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy bao phấn trên môi trƣờng MS cơ bản, một số loài cây trên môi trƣờng N6 của Chu (1978). Môi trƣờng nuối cấy bao phấn nghiên cứu cải tiến phù hợp với mỗi loài cây trồng và kiểu gen. Ví dụ đối với lúa loài phụ Indica môi trƣờng N6 bổ sung thêm galactose (0,1M), lactose (0,1M), nƣớc dừa (5%), caseine hydrolisate (0,05% w/v), L- glutamine (1,3mM), biotin (2mM), ascorbic acid (2,8mM) và các chất điều tiết sinh trƣởng Loài phụ Japonica môi trƣờng SK-I hiệu quả cao hơn. Môi trƣờng MS bổ sung thêm 2,4D và BAP hiệu quả đối nuôi cấy bao phấn cây họ thập tự. Các nhà khoa học Úc cho rằng môi trƣờng B5 + 2,4-D (2mg/l) + 9% sucrose phù hợp cho cây họ đậu. Bƣớc 4: Thu nụ hoa, khử trùng và tách bao phấn nuôi cấy Thu nụ hoa giai đoạn hình thành tiểu bào tử đơn nhân (lúa khi bông vẫn trong bẹ lá đòng, khoảng cách giữa lá đòng và tai lá cuối cùng là 3cm). Sau khi thu hoa, phƣơng pháp nhuộm màu để xác định thời điểm nuôi cấy phù hợp, một số hóa chất nhuộm màu sử dụng nhƣ iron - alum haematoxylin nhuộm màu bao phấn lúa, DAPI (4,6 diamidino 2-phenylindol dichloride) với bao phấn cây họ cam quýt. Thu hoa khử trùng và bảo quản trong nhiệt độ thấp Sau khi bảo quản, tách bao phấn ra khỏi hoa đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy trên đĩa petri Số lƣợng nuôi cấy tùy theo loài, cơ sở vật chất. Bình quân số lƣợng bao phấn nuôi cấy trên mỗi đĩa petri khoảng 30 bao phấn, nuôi cấy tổng số 100 bao phấn cho một kiểu gen. Bước 5: Nuôi cấy tạo calus và tái sinh cây Môi trường nuôi cấy bao phấn dựa trên môi trường MS hoặc N6 cải tiến phù hợp với mỗi loài cây trồng và kiểu gen. Môi trường cải tiến thường bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng và hóa chất khác (xem bước chuẩn bị môi trường). Điều kiện buồng nuôi cấy thường ở nhiệt độ 25 ± 1oC, thời gian chiếu sáng 16 giờ, cường độ ánh sáng 1000lux (đối với lúa). Một số loài cây trồng yêu cầu môi trường tạo calus và môi trường tái sinh cây khác nhau như: lúa sau khi tạo calus 3 tuần chuyển sang môi trường tái sinh cây là môi trường MS bổ sung thêm 1-2mg NAA (Naphthalene acetic acid), 4mg/l kinetin, 40mg/l adenine sulfat và 15% CM. Điều kiện nuôi cấy giống như nuôi cấy tạo calus nhưng cường độ ánh sáng tăng lên 2000lux. 7/18/15 11 Bƣớc 6: Chuyển cây ra ngoài giá thể hoặc ngoài đất đánh giá chọn dòng Trồng cây tái sinh ra chậu chứa đất và dinh dƣỡng phù hợp, hoặc ngoài đất trong nhà kính, nhà lƣới đánh giá các đặc điểm nông sinh học và xác định độ bội. Ví dụ đối với lúa: xác định độ bội bằng xử lý đỉnh rễ trong dung dịch 8- hydroxyquinoline tại 18oC trong 3 giờ, cố định trong dung dịch ethanol-acetic axít (3:1 v/v) qua đêm và nhuộm màu bằng kỹ thuật Feulgen squash và quan sát trên kính hiển vi. Những tiến bộ trong khoa học đã có các thiết bị mới có thể xác định độ bội nhanh và tiết kiệm chi phí hơn nhƣ máy đo độ bội hoặc sử dụng marker phân tử. Phƣơng pháp 2: tạo đơn bội bằng kích tạo đơn bội tự nhiên Phƣơng pháp kích tạo đơn bội tự nhiên hay còn gọi là phƣơng pháp tạo đơn bội kép (DH) in vivo. Geiger (2009) đã thông báo rằng nếu thụ phấn các cây ngô có kiểu gen đặc thù gọi là cây kích tạo (inducer), cây nhận phấn tạo ra một tỉ lệ hạt nhất định có phôi đơn bội (haploid embryo) và nội nhũ tam bội. Kỹ thuật sử dụng rộng rãi phát triển dòng thuần trong tạo giống ngô lai thƣơng mại. Các bƣớc tạo dòng DH ở ngô đƣợc trình bày trong hình 5.20. Sau khi thu hạt đơn bội có thể lƣỡng bội hóa tạo dòng đơn bội kép ngay từ thế hệ đầu tiên. Hình 5.20. Các bƣớc tạo dòng DH ở ngô băng Phƣơng pháp in vivo * Lƣỡng bội hóa cây đơn bội tạo cây đơn bội kép (DH): Phƣơng pháp lƣỡng bội hóa cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn hay kích tạo đơn bội (in vivo) phổ biến nhất là sử dụng colchicine. Chất alkaloid này hoạt động cản trở quá trình phân chia tế bào và dẫn đến không giảm số lƣợng nhiễm sắc thể khi phân chia. Colchicine có tính độc cao, ngày nay có thể sử dụng một số chất khác thay thế là thuốc trừ cỏ, pronamid, APM, trifluralin, oryzalin, Nitrous oxide gas (Kato, 2002), nhƣng những chất thay thế này không phù hợp xử lý một số lƣợng lớn. 5.4.4. Ứng dụng của đơn bội và đơn bội kép trong cải tiến giống cây trồng Phƣơng pháp phát triển dòng thuần truyền thống bằng thụ phấn cƣỡng bức của chính cây đó (tự phối) qua 8 - 10 thế hệ thu đƣợc dòng thuần, tuy nhiên không thể tạo đồng hợp hoàn toàn. Tỉ lệ đồng hợp tăng qua các thế hệ tự thụ phấn. Giả sử lai 2 bố mẹ đồng hợp AA x aa thu đƣợc con lai F1 (Aa), bắt đầu từ F1 cho thụ phấn hoàn toàn tỉ lệ đồng hợp và dị hợp thu đƣợc qua các thế hệ nhƣ sau: Bảng 5.6. Tỉ lệ đồng hợp qua các thể hệ tự thụ phấn Thế hệ tự thụ phấn Tỉ lệ (%) Đồng hợp Dị hợp F1 100 F2 50 50 F3 75 25 F4 87,5 12,5 F5 93,75 6,25 F6 96,88 3,12 F7 98,44 1,56 F8 99,32 0,78 5.5. TẠO BIẾN DỊ BẰNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO Nuôi cấy mô tế bào tạo ra một lƣợng lớn biến dị di truyền ở các loài thực vật, những biến dị di truyền này có thể sử dụng trong các chƣơng trình chọn tạo giống cây trồng. Bằng chọn lọc in vitro các đột biến về đặc điểm nông sinh học có lợi, chống chịu mặn, hạn và chống chịu sâu bệnh có thể phân lập đƣợc trong một thời gian ngắn. Biến dị soma tạo thành giống mới thành công ở một số cây trồng nhƣ cải, lúa và cây trồng khác (S. Mohan Jain, 2001). 7/18/15 12 5.5.1. Những thay đổi di truyền xảy ra trƣớc khi nuôi cấy mô in vitro Trong quá trình phát triển cá thể, phân hoá và già hoá của mô và tế bào, một số thay đổi di truyền xảy ra và đƣợc tích luỹ trong các tế bào soma. Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, cây đƣợc tái sinh từ tế bào soma sẽ là các đột biến. Nguyên nhân gây đột biến có thể do cấu trúc bình thƣờng của hạt và tế bào bị phá vỡ - các enzym tiếp xúc với các chất và tạo ra sản phẩm đột biến. Tuỳ theo phƣơng thức nuôi cấy tế bào soma, ngƣời ta phân biệt các loại biến dị dƣới đây: Biến dị dòng tế bào mô sẹo (calusoclonal variation): khi cây biến dị tái sinh từ mô sẹo (calus). Biến dị dòng tế bào trần (protoclonal variation) - khi cây biến dị tái sinh từ tế bào trần. Những biến dị di truyền xảy ra và đƣợc phát hiện trong quá trình nuôi cấy in vitro gọi chung là đột biến dòng tế bào. 5.5.2. Những thay đổi di truyền xảy ra trong quá trình in vitro Auxin gây ra đa bội hoá bên trong tế bào nuôi cấy. Mức độ đột biến tế bào soma lớn đến mức tần số đột biến do các chất đột biến gây ra. Có thay đổi số lƣợng, cấu trúc nhiễm sắc thể, đột biến gen. Thay đổi di truyền phổ biến nhất xảy ra trong tế bào nuôi cấy là đa bội thể. Đột biến tế bào soma xảy ra ở các gen trong tế bào chất (ty thể và lục lạp). Đột biến tế bào soma đã ứng dụng vào chọn giống hiệu quả ở nhiều cây trồng nhƣ mía, khoai tây, cà chua, thuốc lá, lúa và lúa mì. 5.5.3. Ứng dụng của biến dị tế bào soma Biến dị và chọn lọc các đột biến tế bào soma xảy ra trong nuôi cấy in vitro cung cấp một số lƣợng lớn biến dị và có thể ứng dụng rất đa dạng: Tạo ra dòng tế bào nuôi cấy có khả năng sản xuất các chất hoạt tính sinh học với năng suất cao (xem công nghệ bioreactor) Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý, Ví dụ, các nhà khoa học ở Đài Loan đã chọn tạo đƣợc giống chuối thấp cây, chống chịu bệnh thối rũ do nấm Fusarium gây ra. Ở nƣớc ta, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã tạo đƣợc giống lúa mới DR2 có khả năng chịu hạn, chịu lạnh bằng phƣơng pháp chọn lọc các biến dị tế bào soma in vitro kết hợp xử lý các điều kiện cực đoan từ một giống lúa không có khả năng chống chịu. 5.6. TẠO BIẾN DỊ DI TRUYỀN DỰA TRÊN CÔNG NGHỆ GEN Ứng dụng công nghệ gen tạo biến dị di truyền ở mức phân tử ADN, locus tính trạng số lƣợng (QTL) hay từng gen, sau đây gọi chung là kỹ nghệ di truyền. Chuyển gen là một kỹ nghệ di truyền và là một công cụ mới bổ sung cho chọn tạo giống truyền thống và có thể giúp cho việc mở rộng các nguồn gen có lợi từ các loài khác chuyển sang các loài cây trồng mong muốn. Kỹ nghệ di truyền chuyển gen có lợi thế là có thể chuyển một gen, một số gen hay một QTL mà phƣơng pháp truyền thống rất khó thực hiện. Khái niệm cây trồng chuyển gen theo J. Machex (1997): “Cây trồng chuyển gen là cây đƣợc chuyển một hay nhiều gen mới từ đó ta thu đƣợc thêm một hay nhiều đặc điểm mới. Các gen đƣợc chuyển vào cây không phải bằng con đƣờng lai hữu tính giữa hai bố mẹ mà đƣợc chuyển bằng kỹ thuật di truyền”. 5.6.1. Chuyển gen trực tiếp Là phƣơng pháp chuyển trực tiếp các gen đã đƣợc thiết kế trong plasmid vào tế bào thực vật có sự trợ giúp của yếu tố hoá học, vật lý và tác nhân cơ giới. Chuyển gen trực tiếp sử dụng một số kỹ thuật sau: a) Chuyển gen bằng xung điện Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trƣờng cực mạnh. Khi các tế bào trần (protoplast) trong điện trƣờng, sự dẫn điện và tính thấm của màng nguyên sinh bị thay đổi. Sự thay đổi này kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng hình thành lỗ hổng. Một loạt các lỗ hổng đƣợc hình thành, ADN đƣợc chuyển qua lỗ hổng vào tế bào gắn vào bộ máy di truyền. Tế bào chuyển gen đƣợc nuối cấy tạo calus, tái sinh cây và đánh giá cây chuyển gen. Một tế bào thực vật có thể tiếp thụ ADN nhờ xung điện mà không cần xử lý trƣớc nhƣ tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì. b) Chuyển gen nhờ phân tử PEG (polyethylene glycon) PEG là một phân tử lớn có phân cực, lợi dụng tính chất này ngƣời ta tách gen cần chuyển, đƣa vào dung môi cùng với phân tử PEG và tế bào trần. Các ADN bị hút vào các đầu phân tử PEG có điện cực trái dấu, sau đó PEG bị tế bào trần hút về phía nó. Các ADN trên đầu PEG đi vào tế bào trần theo cơ chế nuốt amip. Thuốc lá và hoa mào gà là hai đối tƣợng đầu tiên đƣợc sử dụng cho chuyển gen trực tiếp nhờ tác động của PEG. Nhƣợc điểm lớn nhất khi sử dụng phƣơng pháp chuyển gen bằng xung điện và nhờ xử lý PEG là việc tái sinh cây hữu thụ tốn rất nhiều thời gian, công sức mà kết quả phụ thuộc vào kiểu gen của loài cây trồng. Ngoài ra, vấn đề về các biến dị soma, có nhiều bản sao gắn trong hệ gen, tái sinh cây bạch tạng là những trở ngại cho việc chuyển gen khi sử dụng hai phƣơng pháp này ở cây hoà thảo (cây lúa). 7/18/15 13 c) Chuyển gen bằng vi tiêm Ngƣời ta sử dụng vi kim và kính hiển vi để tiêm một lƣợng nhỏ ADN vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào trần hay tế bào nguyên. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là ADN đƣợc đƣa vào tế bào một cách chính xác. Phƣơng pháp này cần thao tác khéo léo, yêu cầu trang thiết bị. Vật liệu chuyển gen là tế bào trần, hoặc qua ống phấn. Khi hạt phấn rơi trên đầu nhuỵ (quá trình thụ phấn), hạt phấn sẽ nảy mầm v