Bài giảng Sản xuất kháng sinh

benzylpenicillin – Lên men 1. Cung cấp oxy - Dưới dạng không khí lọc vô trùng - Tốc độ 0,5 – 1,2 vvm  Trang bị hệ thống cánh khuấy và gờ cản: • Thúc đẩy quá trình thông khí • Thúc đẩy sự trộn lẫn tế bào và môi trường Sản xuất benzylpenicillin – Lên men 2. Kiểm soát nhiệt độ - Quá trình sản xuất penicillin nhạy cảm với nhiệt độ - Duy trì nhiệt độ 26±1 oC  Trang bị hệ thống làm lạnh: • Kiểm soát nhiệt chuyển hóa • Giảm nhiệt độ của quá trình lên men • Làm nguội môi trường sau khi tiệt trùng Sản xuất benzylpenicillin – Lên men Hệ thống làm lạnh Nồi lên men Sản xuất benzylpenicillin – Lên men 3. Thiết bị và tác nhân khử bọt - Quá trình nuôi cấy vi sinh vật tạo bọt do sự thông khí và khuấy trộn mạnh  Dịch nuôi cấy VSV bị hao hụt theo đường khí thải  Cần trang bị hệ thống phát hiện bọt tự động  Xử lý: • Tạm thời: tạo áp suất ngược dòng  giữ dịch nuôi cấy trong nồi lên men • Dùng chất khử bọt vô trùng Sản xuất benzylpenicillin – Lên men 4. Các trang bị khác - Các thiết bị khác được trang bị nhằm kiểm tra các thông số như: nhiệt độ, pH, năng lượng tiêu hao của mô tơ điện, dòng khí, oxy hòa tan và phân tích khí thải - Bộ cảm biến cung cấp dữ liệu cho quá trình kiểm soát chất lượng thủ công hay bằng hệ thống máy tính Sản xuất benzylpenicillin – Lên men Một số thiết bị hỗ trợ quá trình lên men Sản xuất benzylpenicillin – Lên men 5. Bổ sung môi trường - Môi trường lên men không chứa tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết ngay từ đầu - Các chất bổ sung: • Được tiệt trùng từng lô hay tiệt trùng bằng hệ thống liên tục • Bổ sung trong suốt quá trình lên men bằng hệ thống tự động  có thể kiểm soát tốc độ hoặc ngừng cung cấp Sản xuất benzylpenicillin – Lên men 6. Hệ thống vận chuyển và lấy mẫu - Hệ thống vận chuyển vô trùng dùng để: • Chuyển giống vi sinh vật vào nồi lên men • Lấy mẫu thường qui trong quá trình lên men • Thu hoạch sản phẩm từng phần khi nồi lên men đầy do bổ sung môi trường • Chuyển sản phẩm của quá trình lên men sang giai đoạn chiết tách Sản xuất benzylpenicillin – Lên men 6. Hệ thống vận chuyển và lấy mãu - Hệ thống vận chuyển vô trùng do: • Thiết kế kỹ thuật • Hơi nước phải tiếp xúc được với toàn bộ bộ phận của nồi lên men và hệ thống ống dẫn Bất cứ khối không khí hay bề mặt thiết bị không tiếp xúc với hơi nước đều có thể là nguyên nhân gây ngoại nhiễm Sản xuất benzylpenicillin – Lên men 6. Hệ thống vận chuyển và lấy mãu - Quá trình lấy mẫu cần thiết nhằm theo dõi: • Tốc độ tăng trưởng • Động học của các chất dinh dưỡng • Nồng độ penicillin • Sự ngoại nhiễm Lên men benzylpenicillin – Kiểm soát - Độ thông khí: tốc độ tăng trưởng VSV trong giai đoạn lên men = giai đoạn nhân giống  mật độ VSV trong môi trường cao  không đủ thông khí để duy trì sản xuất penicillin - Nồng độ oxy: nồng độ oxy dưới ngưỡng tới hạn  quá trình sinh tổng hợp benzylpenicillin giảm mạnh mặc dù VSV vẫn tăng trưởng Sản xuất benzylpenicillin – Kiểm soát quá trình lên men Kiểm soát tốc độ tăng trưởng của VSV:  Duy trì tốc độ tăng trưởng nhanh chỉ đến khi mật độ VSV đạt tối đa so với công suất của nồi lên men  Tốc độ giai đoạn tăng trưởng tiếp theo được kiểm soát bằng cách kiểm tra nghiêm ngặt lượng chất dinh dưỡng cung cấp Benzylpenicillin được sản xuất với hiệu suất cao Lên men benzylpenicillin – Môi trường Môi trường lên men ban đầu chỉ cung cấp một lượng chất dinh dưỡng nhất định cho quá trình tăng trưởng VSV trong giai đoạn đầu 1. Nguồn nitơ: cao ngô (Corn Steep Liquor – CSL) • Là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất tinh bột ngô • Được dùng để nuôi cấy nấm sản xuất penicillin và nhiều loại nấm sản xuất kháng sinh khác • Cung cấp mốt số hợp chất carbon có ích như: acid, đường • Cung cấp một số ion vô cơ và yếu tố tăng trưởng • Rẻ tiền Lên men benzylpenicillin – Môi trường 1. Nguồn nitơ: cao ngô (Corn Steep Liquor – CSL) • Là chất dinh dưỡng phức tạp, thành phần hóa học chưa được xác định rõ • Là hợp chất tự nhiên • Thành phần khác nhau giữa các lô mẻ sản xuất Lên men benzylpenicillin – Môi trường Không có hai lô mẻ lên men hoàn toàn giống nhau Chuyển sang sử dụng nguồn nitơ có thành phần xác định Lên men benzylpenicillin – Môi trường 2. Nguồn nitơ phụ trợ và một số chất dinh dưỡng cần thiết khác: • Canxi: dưới dạng CaCO3 để trung hòa pH acid tự nhiên của cao ngô • Magie, sulfat, phosphat, kali và các kim loại vi lượng Lên men benzylpenicillin – Môi trường lên men 3. Tiệt trùng môi trường: - Ở 120 oC - Trong nồi lên men hoặc trong thiết bị đi kèm - Có thể tiệt trùng liên tục Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng - Môi trường tiệt trùng được khuấy trộn, thông khí, điều chỉnh pH, nhiệt độ - Cấy giống và bắt đầu pha tăng trưởng - Nguồn carbon ban đầu: • Chỉ đủ cung cấp cho giai đoạn tăng trưởng ban đầu • Không đủ :  Cung cấp năng lượng cho quá trình sản xuất penicillin  Đảm bảo duy trì sinh khối cần thiết trong các giai đoạn còn lại của quá trình lên men Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng - Nguồn carbon được bổ sung liên tục để có thể kiểm soát tốc độ tăng trưởng của VSV - Nguồn carbon thường được sử dụng: sucrose hoặc glucose. Để giảm chi phí có thể sử dụng dạng không tinh khiết: mật đường hoặc dịch tinh bột thủy phân - Nguồn carbon khác: nhiều nhà sản xuất sử dụng lactose Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng - Khi nồng độ đường còn dư trong môi trường quá thấp  không đo được  tốc độ bổ sung nguồn carbon quyết định dựa trên kinh nghiệm và quan sát hệ thống - Kiểm soát tỉ lệ cung cấp nguồn carbon  sử dụng lactose  tốc độ thủy phân lactose thành hexose hạn chế  lượng carbon cung cấp chậm và ổn định Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng - Canxi, magie, phosphat và các kim loại vi lượng được cung cấp từ đầu  đủ dùng cho cả quá trình lên men - Nitơ và lưu huỳnh cần bổ sung để cân bằng với nguồn carbon • Bổ sung nitơ dưới dạng khí amoniac • Bổ sung sulfat dưới dạng kết hợp với đường Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng - Tỉ lệ cân bằng giữa nitơ và carbon giúp: • Đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của VSV • Duy trì lượng dự trữ ion amoni • Cân bằng pH môi trường: quá trình chuyển hóa carbon tạo pH acid sẽ được cân bằng pH kiềm của amoniac Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng - Pha tăng trưởng nhanh chóng chuyển sang pha sản xuất penicillin  pH và nhiệt độ tối ưu của pha tăng trưởng không phải là tối ưu của pha sản xuất penicillin  thay đổi pH và nhiệt độ - Acid phenylacetic (PAA) là chất bổ sung cuối cùng sẽ được cung cấp liên tục Lên men benzylpenicillin – Chất dinh dưỡng - Các chất dinh dưỡng được tiệt trùng trước khi đưa vào nồi lên men - Hiếm khi xảy ra nhiễm vi khuẩn đề kháng kháng sinh - Ngoại nhiễm gây ảnh hưởng đến chất lượng quá trình lên men. VD: vi khuẩn sản xuất β-lactamase gây: • Phá hủy penicillin • Sử dụng chất dinh dưỡng của môi trường • Mất kiểm soát pH môi trường • Ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất Sản xuất benzylpenicillin – Lên men Yêu cầu quan trọng của quá trình lên men là điều kiện vô trùng  duy trì sự tăng trưởng của VSV sản xuất kháng sinh, không có sự phát triển của VSV ngoại nhiễm Lên men benzylpenicillin – Kích thích bằng PAA - PAA cung cấp nhánh bên cho penicillin - Không có PAA, hiệu suất sản xuất penicillin giảm mạnh - PAA ức chế sự tổng hợp các penicillin không mong muốn khác - Nồng độ PAA cao gây độc - PAA có giá thành cao Kiểm soát lượng PAA không đạt tới giới hạn gây độc  giảm lượng PAA ngay trước khi quá trình lên men kết thúc Lên men benzylpenicillin – Kích thích bằng PAA - PAA hiện diện trong cao ngô: do hệ vi khuẩn tự nhiên biến đổi từ phenylalanin có trong hạt ngô Nhánh acyl Acid 6- aminopenicillanic PAA Lên men benzylpenicillin – Kích thích bằng PAA + PAA Sinh tổng hợp và bán tổng hợp các penicillin Sản xuất benzylpenicillin – Nguyên liệu Môi trường nuôi cấy sản xuất penicillin: Thành phần Tỉ lệ [% (w/v)] Nước Cao ngô 2,0 Lactose 4,0 NaNO3 0,3 K2HPO4 0,05 MgSO4 0,025 CaCO3 0,4 Β- phenylethylamin 0,25 Chất chống tạo bọt 3 giọt/100 ml Lên men benzylpenicillin – Kết thúc - Kết thúc quá trình lên men phụ thuộc nhiều yếu tố và là một quyết định phức tạp - Ngừng quá trình lên men khi bắt đầu giảm hiệu suất biến đổi các nguyên liệu thô đắt tiền thành penicillin Lên men benzylpenicillin – Kết thúc Động học quá trình lên men penicillin Sản xuất benzylpenicillin – Chiết xuất 1. Loại bỏ tế bào Bezylpenicillin và các chất chuyển hóa khác hòa tan ngoại bào cùng với các thành phần môi trường dinh dưỡng  Bước đầu tiên sau lên men là loại bỏ tế bào VSV khỏi môi trường lỏng: dùng phương pháp lọc hoặc ly tâm Tuyệt đối tránh ngoại nhiễm VSV có khả năng sản xuất β-lactamase – là nguyên nhân gây thất thoát sản phẩm Chiết xuất benzylpenicillin – Chiết tách 2. Tách bezylpenicillin - Thường tách bằng dung môi. Ngoài ra có thể dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion, kết tủa - Ở pH 2-2,5, penicillin có hệ số tách cao trong các dung môi hữu cơ như amyl acetat, butyl acetat, metyl isobutyl keton Thực hiện chiết tách nhanh vì benzylpenicillin không bền ở pH thấp - Tách penicillin trở lại pha nước bằng hệ đệm pH 7,5 - Kết tinh và sấy khô bezylpenicillin Chiết xuất benzylpenicillin – Xử lý sản phẩm thô 3. Xử lý bezylpenicillin - Bezylpenicillin được sản xuất dưới các dạng muối khác nhau, tùy mục đích sử dụng: • Là nguyên liệu bán tổng hợp các kháng sinh nhóm β-lactam • Dùng trong lâm sàng - Gồm ba bước cơ bản: 1.Tạo muối thích hợp 2.Loại bỏ chí nhiệt tố 3.Tiệt trùng: lọc hay nhiệt khô Chiết xuất benzylpenicillin – Xử lý sản phẩm thô 3. Xử lý bezylpenicillin - Bào chế:  Dùng đường tiêm: kháng sinh được đóng gói trong lọ vô trùng dưới dạng bột đông khô hay huyền dịch  Dùng đường uống: được bào chế dưới dạng viên bao phim hay các dạng khác - Kiểm nghiệm: Lấy ngẫu nhiên số lượng thích hợp mẫu thành phẩm kiểm tra hoạt tính, độ tinh khiết, chí nhiệt tố và độ vô trùng Sản xuất penicillin V Cung cấp các chất cho acyl khác nhau Tổng hợp các penicillin khác nhau Chất cho acyl Penicillin PAA Phenoxyacetyl Benzylpenicillin Penicillin V Sản xuất penicillin V Chủng VSV: P. chrysogenum  Dùng một chủng đột biến để sản xuất hai kháng sinh  Dùng các chủng đột biến khác nhau để sản xuất hai loại penicillin Penicillin V Penicillin V: - Sử dụng trong lâm sàng - Là nguyên liệu bán tổng hợp các penicillin khác không sản xuất trực tiếp được bằng phương pháp lên men Sản xuất penicillin Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn sản xuất penicillin Sản xuất penicillin Sơ đồ tóm tắt dây chuyền sản xuất penicillin Sản xuất penicillin Dây chuyền sản xuất penicillin của nhà máy Pfizer Sản xuất cephalosporin C Benzylpenicillin, penicillin V Cephalosporin Mở vòng VD: sản xuất cephalosporin thế hệ 1: cephalexin Đa số cephalosporin được bán tổng hợp từ sản phẩm lên men cephalosprin C Lên men cephalosporin C – Giống - Chủng gốc Acremonium chrysogenum (trước đây có tên Cephalosporium acremonium): được phân lập ở bờ biển Sardinian (Địa Trung Hải), năm 1945 - Cephalosporin C được phân lập năm 1952 - Sau một thập kỷ, các cephalosporin bán tổng hợp mới được sử dụng trong lâm sàng Lên men cephalosporin C - Chủng gốc Acremonium chrysogenum (trước đây có tên Cephalosporium acremonium): được phân lập ở bờ biển Sardinian (Địa Trung Hải), năm 1945 - Cephalosporin C được phân lập năm 1952 - Sau một thập kỷ, các cephalosporin bán tổng hợp mới được sử dụng trong lâm sàng Lên men cephalosporin C - Chủng gốc Acremonium chrysogenum (trước đây có tên Cephalosporium acremonium): được phân lập ở bờ biển Sardinian (Địa Trung Hải), năm 1945 - Cephalosporin C được phân lập năm 1952 - Sau một thập kỷ, các cephalosporin bán tổng hợp mới được sử dụng trong lâm sàng Lên men cephalosporin C Isopenicillin N Penicillin N Desacetoxycephalosprin C Desacetylcephalosprin C Cephalosprin C Cephamycin C Sinh tổng hợp penicillin Sinh tổng hợp cephalosporin C = Kháng sinh nhóm cephem Cephalosporin C Cephamycin C Lên men cephalosporin C - Quá trình lên men cephalosporin C tương tự như benzylpenicillin - Không cần tiền chất dinh dưỡng chuyên biệt cho quá trình lên men - Các chất chuyển hóa của sinh vật cung cấp đủ cơ chất mang nhóm acetyl cho phản ứng vận chuyển acetyl (acetyltransferase) Chiết tách cephalosporin C Chiết tách cephalosporin chủ yếu bằng phương pháp hấp phụ trên carbon hay resin, không sử dụng dung môi Qui trình sản xuất kháng sinh khác nhau ở giai đoạn phục hồi, không khác nhau ở giai đoạn lên men Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh Sản xuất Chiết tách Tinh chế Đóng gói GMP Đảm bảo chất lượng Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh Kiểm tra chất lượng Dạng chưa thành phẩm Dạng thành phẩm Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh Một số yêu cầu cơ bản của GMP: 1. Tất cả giai đoạn sản xuất phải được xác định rõ và nguyên vật liệu phải ổn định để đảm bảo chất lượng cũng như các tiêu chuẩn chuyên biệt 2. Các bước quyết định và những thay đổi lớn đến quá trình phải được xem xét Một số yêu cầu cơ bản của GMP: 3. Tất cả các yếu tố thuận lợi cần thiết cho GMP phải được chuẩn bị: • Đào tạo nhân lực • Nhà xưởng • Trang thiết bị • Nguyên vật liệu, bao bì, nhãn • Qui trình, tài liệu chuẩn • Kho và phương tiện vận chuyển phù hợp Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh Một số yêu cầu cơ bản của GMP: 4. Tài liệu và qui trình được viết rõ ràng, ngôn ngữ dễ hiểu 5. Người vận hành được đào tạo để thực hiện đúng qui trình 6. Ghi lại báo cáo từng giai đoạn sản xuất, những thay đổi và điều tra nguyên nhân 7. Báo cáo quá trình sản xuất và phân phối của từng lô mẻ Thực hành sản xuất tốt thuốc kháng sinh Một số yêu cầu cơ bản của GMP: 8. Giảm thiểu nguy cơ ảnh hưởng đến chất lượng trong quá trình phân phối 9. Có hệ thống sẵn sàng thu hồi bất cứ lô mẻ sản xuất nào từ nhà kinh doanh hay phân phối 10. Xem xét tất cả các ý kiến phản hồi Sản xuất erythromycin Sản xuất erythromycin từ Saccharopolyspora erythraea Xạ khuẩn Actinomyces: - Phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước - Cung cấp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp - 9.000 hợp chất, chiếm 70-80% chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học do Actinomyces sản xuất: • Chiếm 2/3 tổng số kháng sinh do VSV sản xuất • 60% chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học không phải là kháng sinh • 80% do vi khuẩn thuộc chi Streptomyces sản xuất Sản xuất erythromycin từ S. erythraea Xạ khuẩn Actinomyces: - Có thể sử dụng Actinomyces với qui mô công nghiệp để sản xuất hợp chất polyketide có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như chống ung thư, kháng sinh, ức chế miễn dịch, - S. erythraea có khả năng sản xuất kháng sinh nhóm macrolid erythromycin – là một polyketide nhóm I Sản xuất erythromycin từ S. erythraea - Erythromycin được phân lập từ S. erythraea (trước đây có tên l