Bài giảng Sinh học phân tử - Nguyễn Khánh Linh

chia tế bào, bộ gen phải được sao chép theo nguyên tắc bán bảo tồn semiconservation. Quá trình này được công bố đầu tiên vào năm 1958 do Mathew Meselson và Franklin Stahl II. Quá trình sao chép DNA ở Prokaryote - 1 replicon - 1ori C, 1 ter UKhởi đầu sao chép: xảy ra ở Ori C ƒDnaA + vùng oriC (9bp) ƒDnaB + DnaC + oriC ƒDnaB trượt tháo xoắn, DnaA phóng thích ra ngoài - Tổng hợp mồi: Enzyme primase + protein primosome - Tổng hợp DNA: DNA polymerase III là 1 holoenzyme, gồm tối thiểu 10 tiểu đơn vị -'1$SRO\PHUDVH,FRÛYDLWURÚVØÝDVDL'1$t-tH[RQXFOHDVHYDÚ loại bỏ phần mồi RNA khi sao chép -DNA polymerase II có vai trò chưa được hiểu chính xác - Nối phân đoạn DNA: enzyme ligase -&DÝORDĐL'1$SRO\PHUDVHt-tH[RQXFOHDVH - /RDĐL,WKHÄPt-tH[RQXFOHDVH *** Tốc độ sao chép ở E.coli là 1000 bp/s/chỉa 3 sao chép. Độ chính xác rất cao, chỉ 1/109-1010bp ở mỗi thế hệ . „Một bộ máy replisome : 2 bản DNA polymerase III ( dimer), 1 primosome và các protein tháo xoắn Mạch chậm tạo loop ** Hoạt động Topoisomerase I Vai trò tháo xoắn liên tục trước sao chép „ Kiểm soát sự siêu xoắn của DNA: Ở Prokaryote, topoisomerase II (DNA gyrase vai trò trong sao chép) III. Quá trình sao chép DNA ở Eukaryote …Thời điểm sao chép: pha S - Tốc độ sao chép: chậm hơn, cỡ 50 nucleotid/s ở 1 chỉa 3 sao chép - Replicon: Tuy chậm nhưng quá trình xảy ra ngắn là do có cấu trúc replicon - Đoạn okazaki: từ 100-200 nucleotid … Có 5 loại DNA polymerase - D ( khởi đầu sao chép cả mạch tới và mạch chậm) - E ( có vai trò sửa sai) - G ( = DNA polymerase III x kéo dài mạch sau đó, không dimer, kết hợp với PCNA x proliferating cell nuclear antigen) - H YDLWURÚH[RQXFOHDVHĨDÂXt-t - J (sao chép bộ gen ti thể) … Tương tự SSB là RPA (replication protein A) … Tách mồi RNA ra khỏi đoạn okazaki nhờ enzyme ribonuclease H … Quá trình sao chép DNA ở lục lạp ? **Hoạt động của Topoisomerase II: tách 2 mạch đã sao chép ** Vùng Telomere -¶½QJØƯÚLt77$***tFRSLHV ** Vấn đề gì xảy ra ở Telomere ? - 33EỴQKWKØƯÚQJĨDÂXtFKXRÅLPỬLVH×NKRÄQJĨØƯĐFKRDÚQWKDÚQK ngắn dần sau mỗi lần sao chép 125 lần sc mất Telomere Tế bào sinh dưỡng bình thường chỉ NP 1 số lần rồi dừng hẳn. Ngoại trừ 1 số loại tb đặc biệt Cần Telomerase ** Hoạt động của Telomerase „ Là ribonucleoprotein, xúc tác tổng hợp DNA từ khung RNA „ Tp RNA (TERC- telomer RNA component) tạo khung AAUCCC ( ở người) để tạo đoạn TTAGGG „ Tp protein ( TERT x telomere reverse transcriptase) xúc tác phản ứng „ Có mặt ở ( bất tử do duy trì được chiều dài Telomere): 9 Tế bào mầm ở phôi, trưởng thành ( germline) 9 Eukaryote đơn bào 9 Tb ung thư ( 85-90% tb tổng hợp lượng telomerase cao) hướng điều trị Telomerase và Telomere: yếu tố quyết định đời sống tế bào IV. Sửa sai DNA Các loại tổn thương „ Mất purin: mất A hay G do lk giữa base purin và đường bị nước thủy giải. Đây là tổn thương xảy ra nhiều nhất. „ Khử amin: xảy ra không phổ biến tác động của nước lên liên kết nối nhóm amin với cystosin sẽ tạo thành uracil. Nếu không sửa thì sẽ thành lk AU trong lần sao chép DNA tiếp theo. „ Tác động tia tử ngoại hay tác nhân hóa học như benzopyren trong khói thuốc lá sẽ gây tổn hại DNA. Aûnh hưởng của tia tử ngoại sẽ làm 2 thymine kế cận nối lại với nhau tạo thành thymine dimer. Cѫ chӃ sӱa sai „ Cắt DNA: có 2 loại là cắt base và cắt nucleotide „ Trình tự sửa sai: enzyme nhận biết chổ sai, nơi tổn thương bị cắt, tổng hợp lại nucleotid đúng, enzyme nối lại vùng mới được chỉnh sửa „ Khi Cytosin bị thay thế bởi Uracil, U sẽ được nhận biết và chỉnh sửa bởi U-DNA-glycosidase. Enzyme này sẽ tạo một khoảng trống ở DNA tại vị trí base lk với nhóm deoxyribose. Enzyme AP endonuclease sẽ nhận biết khoảng trống rồi cắt nhóm đường nhờ phá lk phosphodiester „ Khi DNA tổn thương do mất purin thì AP endonuclease cũng cắt nhóm đường mà đã mất đi base purin. „ DNA polymerase I sẽ tổng hợp nucleotid mới và enzyme ligase nối lại với nhau CHƯƠNG 3 I. Các yếu tố quan trọng 1. RNA polymerase +ØỬQJSKLHÄQPD×tx t - Mã di truyền ( mã protein) - Mạch mã ( coding strand) 3. Liên kết DNA-protein Mối liên kết bền vững do tương tác kỵ nước, lk hydro, lk ion II. Quá trình phiên mã và điều hòa biểu hiện gen ở Prokaryote 1. Đặc điểm cấu tạo RNA polymerase w - Trọng lượng phân tử 450 kD w - 5 loại polypeptid: D, E, EtY, G (sigma) w - Ở E.coli, có nhiều loại , G70 cho phần lớn các gen, G32 cho gen sốc nhiệt, G28 cho gen tạo roi flagellin Holoenzyme 2. Cơ chế phiên mã ở E.coli ( tập trung vào phiên mã tạo mRNA và rRNA) - Cấu trúc Promotor ( 20-200 bp) có 2 vùng consensus sequence * vùng -10 (thường TATATT- Pribnow box) * vùng -35( thường TTGACA) * Quá trình khởi đầu w - RNA polymerase trượt đến vùng promotor - Đoạn ngắn DNA gần -10 được tháo xoắn ( với sự hổ trợ của vùng pribnow vì giàu AT nên chỉ có 2lk hydro), tạo thành phưcù hợp mở. - Bắt đầu phiên mã ở vị trí +1, khi được 10 ribonucleotid thì G sẽ bị phóng thích, kết thúc quá trình khởi đầu ( bắt đầu bằng việc lk giữa A hay G lên RNA polymerase, sau đó ribonucleotid khác sẽ đến để hình thành lk phosphodiester) - Khi yếu tố G tách khỏi thì ái lực giữa RNA polymerase và promotor bị giảm, quá trình kéo dài bắt đầu - Core enzyme trở thành phức hợp phiên mã, theo hướng t-t'1$SKÏDWÙỬFuWUDQVFULSWLRQEXEEOHv7%EDËW đầu tháo xoắn dần. Bọng phiên mã là vùng mà 2 mạch DNA tháo xoắn tạm thời, có kết hợp giữa DNA và RNA - Sự tháo xoắn của RNA polymerase làm cho vùng trước TB là xoắn dương, còn sau TB là xoắn âm. Vì vậy phải cần có topoisomerase - Tiểu đơn vị E gắn lên các ribonucleotid, vai trò xúc tác tạo lk phosphodiester khi trượt trên khuôn DNA - Tiểu đơn vị EtJLXÛSHQ]\PHJDËQFKDÍWOHÄQNKXRÄQ'1$ - Hai tiểu đơn vị D giúp tổ hợp enzyme gắn lên promotor ở giai đoạn đầu * Quá trình kéo dài w* Quá trình kết thúc -RNA polymerase sẽ ngừng phiên mã khi gặp trình tự kết thúc ( là trình tự có 2 vùng giàu G, C, cách nhau một đoạn khoҧng 10 bp), theo sau là một đoạn giàu A -Khi đoạn này được phiên mã, thì ở RNA sẽ tạo thành cấu trúc kẹp tóc giữa 2 vùng này với nhau -Cấu trúc này làm cho phức hợp RNA polymerase chậm và dừng hẳn -Đồng thời, lk giữa A và U trên RNA rất lỏng lẻo, quá yếu để duy trì TB, nên cả RNA sẽ phóng thích ra ngoài, kết thúc phiên mã, cấu trúc xoắn kép DNA hình thành trở lại Hình thức kết thúc không phụ thuộc vào yếu tố rho. -Vài gen ở E.coli có vùng kết thúc khác, được nhận biết bằng protein rho, làm giải phóng phức hợp RNA-DNA ( là enzyme xúc tác tháo xoắn giữa RNA và DNA, cần có ATP hổ trợ), nó gắn lên RNA, không phải RNA polymerase Hình thức kết thúc phụ thuộc yếu tố rho. -mRNA là polycistronic - Chẳng hạn operon chứa nhiều gen rRNA polycistronic dài, được metyl hóa Rnase cắt rRNA trưởng thành 16S, 23S, 5S, một vài tRNA 3. Cơ chế điều hòa biểu hiện gen a. Operon cảm ứng Lactose -Vùng kiểm soát gồm promotor, CAP site, operator - Gồm 3 gen cấu trúc Z ( E-galactosidase x xúc tác thủy giải lactose tạo đường đơn là galactose và glucose), Y(lactose permease x là chất mang chuyển lactose vào trong tb), A (thiogalactoside transacetylase) ** Gen i repressor gắn lên operator ** Allolactose + repressor tách repressor ra operator khởi động phiên mã - Operon lac còn được kiểm soát bởi protein CAP -( catabolite activator protein) -Glucose là nguồn carbon ưa chuộng đối với E.coli -Các enzyme của operon lac chỉ được cảm ứng phiên mã với tốc độ nhanh khi không còn glucose. Cơ chế này được điều hòa bởi 1 phân tử truyền tin nội bào gọi là cAMP (cyclic adenosine monophosphat) -Khi nồng độ glucose giảm, nồng độ cAMP tăng cAMP kết hợp CAP, phức hợp này gắn lên vùng CAP site quá trình phiên mã xảy ra càng hiệu quả Đây là cơ chế điều hòa dương do phức hợp CAP- cAMP b. Operon kìm hãm Tryptophan ƒ Gen Tryp R giải mã cho protein kìm hãm ở dạng bất hoạt gl aporepressor. Khi tryp gắn lên pro này thì mới trở thành dạng hoạt động gl corepressor ƒ Phức hợp này gắn lên vùng operator của operon, ngăn cản không cho RNA polymerase gắn lên vùng promotor khởi động phiên m㠃 Khi lượng tryptophan trong tế bào giảm, phức hợp trên không được hình thành nên sẽ phiên mã sẽ được xúc tiến, kết quả tạo ra các enzyme tổng hợp tryptophan Đây là dạng điều hòa feedback âm III. Quá trình phiên mã và điều hòa biểu hiện gen ở Eukaryote 1. Đặc điểm và cấu tạo RNA polymerase - Có 3 loại RNA polymerase: 9RNA polymerase I ở hạch nhân ( rRNA) 9RNA polymerase II tạo mRNA và snRNA 9RNA polymerase III tạo tRNA và 5S rRNA - Có sự kết hợp với nhiều yếu tố khác như TBP, TFIIF, . . . 2.Cơ chế phiên mã ( chủ yếu tạo mRNA) và quá trình chỉnh sửa sau phiên mã ** Promotor 9Lớn và phức tạp 9Promotor của RNA polymerase II có trình tự consensus, gl TATA box ( -25 đến -30) 9Có những gen không có TATA box, những gen này mã hóa cho các protein cần thiết ở mọi tế bào đgl housekeeping gen. Promotor của những gen này gl GC box 9Hoạt động của nhiều promotor còn bị ảnh hưởng bởi trình tự enhancer x khi được một protein đến kết hợp (transcription factor) ** Chế biến sau phiên mã - *DËQtFDS -Gắn đuôi poly-A -Splicing - Cắt chọn lọc 3. Cơ chế điều hòa biểu hiện gen „ Một trong những yếu tố điều hòa biểu hiện gen là qt methy KRÛD'1$ƯÝF\WRVLQƯÝYXÚQJt-CG-tODÚPQJØQJSKLHÄQPD× và acetyl hóa histon ( gắn acetyl và chuỗi nhánh của lysin ở histon H3, H4 làm ái lực giữa histon và DNA giảm, vì vậy kích hoạt phiên mã) „ Euchromatin là chromatin ít nén, thấy ở kỳ interphase, là vùng sẽ được phiên mã. Tuy nhiên, ở 1 số tb thì 1 phần euchromatin sẽ nén chặt hơn ( không bằng heterochromatin), đây cũng là 1 cơ chế để điều tiết biểu hiện 1 số gen nhất định a. Điều hòa biểu hiện gen ở cơ xương b. Điều hòa bởi glucocorticoid - Hai phức hợp thụ quan gắn lên DNA như 1 dimer. Là do enhancer HRE là palindrome ( mạch trên, dưới có trình tự như QKDXNKLĨRĐFWØÚt- AGAACA -txMỗi đoạn ở 1 mạch gl motif, 2 motif cách nhau khoҧng 3bp. Mỗi phức hợp thụ quan sẽ đến gắn ở 1 motif „ Những chất hóa học tiết ra từ 1 tế bào, làm thay đổi cách biểu hiện ở các tb khác thì đgl transmitter x chất truyền tin ( trong đó có glucocorticoid). Các tế bào ở sv đa bào khởi động hay dừng phiên mã khi có dấu hiệu của các chất hóa học ngoại bào. „ Không như hormon steroid, có những chất truyền tin không dc được qua màng tế bào, vì vậy chúng phải kích hoạt hệ thống truyền thông tin nội bào (intracellular messenger system) để chuyển chúng từ màng vào nhân. CHƯƠNG 4 I. Mã di truyền - Vì có 4 loại nucleotid nên sẽ có 43 = 64 codon, tạo thành bộ mã di truyền - Mã di truyền trên mRNA sẽ quy định trình tự aa trên mạch polypeptid qua quá trình dịch mã. Codon do 4 loại A, U, G, C ** Việc xác định bộ 3 mã hóa cho 1 aa được phát hiện vào năm 1961 ƒMarshall Nirenberg và Heinrich Mathew thực hiện một loạt các thí nghiệm sử dụng hệ thống tổng hợp protein nhân tạo chứa dịch chiết E.coli đã bị phá vỡ tb ƒCác polymere RNA tổng hợp đã biết trình tự và 20 aa, ATP, GTP được bổ sung vào ƒKhi RNA là poly U : sản phẩm là polyphenylalanin (UUU) ƒTương tự poly A, sf là polylysine ( AAA). Khung là C, sản phẩm là polyproteinlin (CCC) ƒMạch khung gồm CU lập đi lập lại : leucin (CUC)x serin(UCU) ƒTrong 64 codon, có 61 codon mã hóa aa, 3 codon vai trò kết thúc dịch mã ( UAA, UAG, UGA) . Trong 61 codon, có 1 codon (AUG) vừa quy đӏnh methionin, vừa có vai trò codon khởi động dịch mã ** Đặc tính của mã di truyền: „ Suy biến nhưng rất rõ ràng …Methionin và tryptophan là 2 aa duy nhất được tổng hợp từ 1 codon …Còn 18 aa còn lại được quy định bởi 2,3,4,6 codon. Vì vậy codon có tính suy biến …Không có codon nào giải mã cho hơn 1 aa, điều QDÚ\WKHÇKLHỈQWÏQKFKDÃWuUR×UDÚQJvFXÝDFRGRQ „ Không chồng lắp, không có chấm kết thúc 9 Trình tự codon trên mRNA được đọc bởi ribosome liên tục từ codon khởi đầu đến codon kết thúc 9 Một bộ gồm các codon liên tiếp trên mRNA được gọi là khung đọc reading frame 9Có thể xảy ra đột biến lệch khung, đột biến vô nghĩa, đột biến có nghĩa (missen mutation) 9 Trình tự thứ 2 hầu như luôn đồng nhất, ổn định nhất đối với cùng 1 aa. Aa tích điện, có chuỗi bên ưa nước (vị trí 2=purin, A hay G). Ví dụ ở vị trí thứ 6 ở globin trong phân tử hemoglobin, khi bị đốt biến đổi GAG sang GUG trêm mRNA (chuyển từ glutamat sang valin), làm thay đổi toàn bộ điện tích tổng thể mạch chuỗi của aa. Hұu quҧ „ Phổ quát 9 Codon có tính phổ quát cho tất cả sinh vật, từ E.coli cho đến con người 9 Ngoại lệ: UGA giải mã tryptophan (ti thể); UAA, UAG giải mã glutamine (1 số động vật đơn bào) II. Các yếu tố quan trọng a. Ribosome - Vai trò: nơi tổng hợp protein - Ribosome có vùng gắn vào khung mRNA, và vùng cho 2 tRNA tích điện. tRNA mang aa sẽ đến vị trí A, còn tRNA gắn vào chuỗi polypeptid đang được hình thành gắn ở vị trí P „ Ribosome Prokaryote và Eukaryote: khác kích thước và thành phần nhưng cùng chức năng và hình dạng ( 2 tiểu đơn vị khác nhau, dựa trên S x đơn vị lắng Svedberg) Vd: E.coli 70S = 30S ( 16S rRNA + 21 polypeptid) + 50S ( 5S rRNA + 23S rRNA + 34 polypeptid) Eukaryote 80S = 60S (5S, 5.8S, 28S rRNA + 49 polypeptid) + 40S ( 18S rRNA + 30 polypeptid) b. Tương tác giữa codon x anticodon „ tRNA là mấu chuyển tiếp ( adaptor) để dịch mã thông tin di truyền „ 0RÅLW51$PDQJDDFKX\HÄQELHỈWƯÝĨDÂXtYDÚ anticodon „ Năm 1966, Crick đã đưa ra giả thuyết Wobble giải thích vì sao chỉ có ít tRNA cần để dịch mã 61 codon, dựa vào các cơ sở sau: 9Thường aa thay đổi bộ 3 mã hóa ở vị trí thứ 3 9Mối liên kết giữa 2 nucleotid đầu giữa codon và anticodon xảy ra như lý thuyết A=U, G=C 9Tương tác ở vị trí 3 không như chuẩn hóa. Vì vậy chỉ cần có 1 tRNA cho 2 codon khác nhau 9Ngoài ra, tRNA anticodon ở vị trí 3 ( vùng wobble) có nucleotid khác gọi là nucleoside inosine (I)- có base là purin hypoxanthin, có thể gắn với U, C, A ở codon 9Có tối thiểu 31 tRNA khác nhau để dịch mã 61 codon thành 20 loại aa. Tính thêm tRNA khởi đầu sẽ là 32 loại tRNA 9Bộ gen ty thể ( 24 tRNA) và lục lạp (30tRNA) ở Eukaryote thì giải mã tRNA ít hơn bộ gen trong nhân c. Quá trình gắn acid amin vào tRNA tương ứng - Thực hiện bởi enzyme aminoacyl tRNA synthase, enzyme này thực hiện 2 phản ØÛQJĨHÇJDËQDDYDÚRĨDÂXtFXÝDW51$WØƯQJ ứng: 9Aa được nối với AMP qua nhóm carboxyl, tạo phức hợp aminoacyl-AMP bằng cách thủy giải phóng thích pyrophosphat 9 Chuyển aa từ AMP sang tRNA, tạo lk ester giữa QKRÛPFDUER[\OYDÚFDÝtYDÚt-OH của nhóm đường ở A trong trình tự CCA ở cuối mỗi tRNA để tạo thành phức hợp aminoacyl-W51$1KØQJFKÈFRÛt- aminoacyl ester mới được dùng trong dịch mã. Bước này được xem như bước hoạt hóa aa vì năng lượng từ liên kết phosphodiester này sẽ được dùng để tạo liên kết peptid sau đó 9 Pứ: Acid amin + ATP + tRNA Aminoacyl-tRNA + AMP + Pi -tRNA được nối với aa tương ứng: tRNA tích điện ( charged tRNA) - Có ít nhất 20 ezyme aminoacyl tRNA synthase, mỗi enzyme thực hiện cho mỗi aa với tRNA tương ứng - Enzyme này có khả năng nhận biết chính xác cấu trúc của tRNA tương ứng để dịch mã. Ví dụ giữa valin và leucin với aminoacyl-tRNA tương ứng. tRNA có khả năng chỉnh sửa aa sai do vùng proof reading II. Sinh tổng hợp protein ở Prokaryote - Tốc độ nhanh, mỗi ribosome dịch mã khoảng 15-20aa/s - Liên kết peptid được hình thành tại 1 vùng chuyên biệt ở tiểu đơn vị lớn ribosome 9Hình thành phức hợp khởi động gồm ribosome, mRNA, tRNA 9IF1, IF3 + tiểu đơn vị nhỏ 30S. IF1 gắn lên vùng A-site, chốt vùng này lại trong suốt quá trình khởi động toàn bộ sẽ gắn lên mRNA 9Trình tự để định vị mRNA gắn YDÚRULERVRPt- GGAGG-tQDÊPXSVWUHDPtFDÛFK codon AUG từ 8-13 nucleotid (Shine-Dalgarno ) 96KLQH'DOJDUQRONERÇVXQJYỬLt- CCUCC-tƯÝWLHÇXĨƯQYƠQKRÝ6 ĨDÂXt- 1 phân tử 16S rRNA) tiểu đơn vị nhỏ ở vị trí đúng để dịch mã ** Khởi đầu 9Sau đó IF2 ( GTP) sẽ đến phức hợp tiểu đơn vị nhỏ, xúc tiến việc gắn tRNA khởi đầu với codon tương ứng trên mRNA. tRNA khởi đầu ở Prokaryote là formylmethionin-tRNA (fmet- W51$IPHWW51$QDÚ\FRÛDQWLFRGRQt- CAU-tW51$QDÚ\PDQJDDVH×JDËQƯÝ P-site ở tiểu đơn vị 30S 9Quá trình khởi đầu kết thúc khi GTP ở IF2 bị thủy giải thành GDP và Pi, làm tiểu đơn vị lớn đến gắn vào, sau đó tất cả IF sẽ được phóng thích 9Như vậy phức hợp 70S đã được hình WKDÚQKFKXDÇQEƠGƠFKPD×WØÚĨDÂXt-t trên mRNA 9Gồm 3 bước: định vị aminoacyl-tRNA trên vùng A- site, hình thành liên kết peptid, chuyển vị. Quá trình này cần có các EF (elongation factor) 9Aminoacyl-tRNA thứ 2 đến vùng A-site, E= peptidyl transferase xúc tác hình thành liên kết peptid ( ở phần 23S rRNA ở tiểu đơn vị lớn ribosome) 9 Hai acid amin này sẽ gắn lên tRNA ở vùng A-site( aminoacyl-tRNA gắn với EF- tu và GTP). Khi gắn được vào A-site, GTP sẽ bị thủy giải 9Sau đó, EF-ts tách GDP ra khỏi EF-tu, khi GTP khác đến sẽ tách EF-tu ra khỏi phức hợp ** Kéo dài 9tRNA ban đầu ở P-site không còn aa, sẽ bị phóng thích ra ngoài và có thể tái sử dụng 9Ribosome di chuyển dọc theo mRNA sang phải để tRNA mang 2 peptid trên di chuyển qua vùng P-site, A- site sẽ trống để aminoacyl- tRNA thứ 3 đến tiếp tục. Sự di chuyển này gọi là sự chuyển vị (translocation), cần có EF-G-GTP 9Quá trình kéo dài kết thúc khi codon kết thúc vào vùng A-site polysome Quá trình phiên mã x dịch mã xảy ra song song ở Prokaryote ( ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử) ** Kết thúc 9Quá trình bắt đầu khi codon kết thúc đến vùng A-site ( UAA, UAG, UGA) 9Khi đó thay vì vùng này sẽ gắn với aa-tRNA tương ứng thì vùng này sẽ bị lấp bởi RF (release factor) gồm RF-1, RF-2, RF-3. Khi đó chuỗi polypeptid sẽ được phóng thích khỏi ribosome, còn mRNA, tRNA, các tiểu đơn vị cũng được giải phóng 9 RF-1 phóng thích polypeptid từ codon UAA, UAG; RF-2 cho codon UAA, UGA. RF-3 chưa biết rõ, vai trò dường như hổ trợ 2 loại trên ** Chỉnh sửa sau dịch mã Ở Prokaryote, gồm các thay đổi như: 9Cắt protein: loại bỏ formylmethionin, trình tự tín hiệu (thường nằm gần aa cuối cùng, có vai trò quyết định điểm đến của protein) 9Methyl hóa 9Phophoryl hóa 9Nối với một số nhóm chức như: lipoprotein, glycoprotein. ** Cơ chế kiểm soát dịch mã 9Ở Prokaryote, cc kiểm soát dịch mã xảy ra ở mức độ phiên mã 9Chính biến thể của trình tự Shine-Dalgarno giúp làm thay đổi tốc độ dịch mã ở các gen khác nhau ( vd sản phẩm thứ 3 trong operon lac chỉ được tạo thành khoảng 1/5 so với sản phẩm thứ 1) IV. Sinh tổng hợp protein ở Eukaryote 1. Một số điểm khác biệt quan trọng 9 Giai đoạn kéo dài và kết thúc không khác biệt 9 Giai đoạn khởi đầu phức tạp hơn. Aa khởi đầu là methionin, với tRNA met tương ứng 9 Sau dịch mã, methionin thường bị loại bỏ 9 mRNA không có trình tự Shine-Dalgarno để ribosome gắn vào 9 'RP51$ƯÝĨDÂXtFRÛJDËQFDS-methylguanosine nên sẽ có 1 số protein gắn vào tiểu đơn vị nhỏ 40S để gắn lên cap này. Khi gắn vào tiểu đơn vị nhỏ sẽ trượt dọc mRNA để tìm codon AUG 9 Tất cả mRNA ở Eukaryote đều có trình tự tương tự t-CCACC-tSKÏDWÙỬFƯÝNHÃEHÄQFRGRQ$8* Kozak), giúp ribosome biết đã đến codon khởi đầu. Quá trình này cần tối thiểu 9 protein hổ trợ 2. Quá trình chế biến protein sau dịch mã ¾ Thủy giải protein: là thủy giải cắt liên kết peptid nhờ protease. Là quá trình thường xảy ra ở tế bào Eukaryote. cắt bỏ methionin ở đầu N hay loại bỏ trình tự tín hiệu chuyển protein tiền chất bất hoạt ( pro- protein) thành dạng hoạt động. ¾ Đường hóa ở lưới nội chất: Đa số protein Eukaryote đều sẽ bị đường hóa, là quá trình gắn nhóm saccharid vào protein, là quá trình chỉnh sửa đồng dịch mã hay sau dịch mã ở Eukaryote Xảy ra ở protein tiết, protein bào quan . . . ¾ Phosphoryl hóa: giúp tương tác protein-protein ¾Hydroxyl hóa: gắn -OH ¾Metyl hóa: gắn -CH3 do methyltransferase xúc tác ¾Liên kết lipid: Việc nối hóa trị với nhóm lipid với protein giúp tăng khả năng gắn vào màng tế bào cũng như tương tác protein-protein ¾Tạo liên kết disulfid: liên kết disulfid thường chỉ thấy ở các protein tiết ( insulin) và 1 số protein màng). Liên kết thường được tạo thành ở môi trường không khử ¾Cắt ghép protein: xảy ra sau dịch mã. Kết quả tạo ra đoạn intein không hoạt động và extein hoạt động 3. Định hướng protein ™ Trình tự tín hiệu ( signal sequence): Vị trí: đầu N đầu C giữa mạch polypeptid ** Ví dụ: Sự vận chuyển protein qua RER: -Cần SRP ( signal recognition particle) khi đoạn polypeptid đủ dài, cỡ 70 aa Quá trình này được gọi là chuyển vị đồng dịch mã. ™Đối với trường hợp chuyển vị sau dịch mã polypeptid được chuyển qua màng là nhờ protein hsp70 có gắn ATP. Sau đó, trình tự tín hiệu sẽ được cắt bởi enzyme signal peptidase. 4. Gấp khúc protein Chaperon: Hsp70 Chaperonin 9 Sự rối loạn gấp khúc protein là nguyên nhân của 1 số bệnh ở người như Alzheimer (mất trí nhớ), Creutzfeld- Jacob (neurodegenerative disease) . . . 5. Cơ chế kiểm soát dịch mã ở Eukaryote 9 mRNA di chuyển ra ngoài: phiên mã và dịch mã tách biệt, giúp có thời gian điều hòa biểu hiện gen. Sự di chuyển qua lỗ màng nhân là quá trình cần năng lượng, FDÂQFRÛPDÍWFXÝDtFDSYDÚtSRO\$- tail 9 Tính ổn định của mRNA 9 Kiểm soát dịch mã âm: quá trình dịch mã đôi khi bị dừng lại do có 1 protein kìm hãm gắn lên trình tự gần ĨDÂXt9ÏGXĐSURWHLQIHUULWLQĨØƯĐFWRÇQJKƯĐSNKLQRÂQJ độ Fe tế bào lên cao 9 Phosphoryl hóa nhân tố khởi đầu eIF 9 Trượt khung dịch mã: thường gặp ở tế bào bị nhiễm retrovirus, kết quả sẽ tạo ra hơn 1 chuỗi polypeptid từ mRNA V.Aûnh hưởng của thuốc kháng sinh lên quá trình sinh tổng hợp protein 9 Chloramphenicol: ức chế hoạt động peptidyl transferase 9 Tetracyclin: ức chế gắn aminoacyl-tRNA lên A-site 9 Streptomycin: ức chế hình thành phức hợp 70S khởi đầu do không cho tRNAfmet gắn vào P-site 9 Puromycin: làm phóng thích sớm chuỗi polypeptid, tác động ở Prokaryote và Eukaryote. CHƯƠNG 6 I. Phương thức vận chuyển protein nội bào Có 3 cách: 1. Vận chuyển có cổng kiểm soát (gated transport): - Protein gấp khúc đến cấu trúc cuối cùng - Di chuyển đến điểm đích Vd: Sự vận chuyển Protein vào nhân 2. Chuyển vị xuyên màng ( transmembrane translocation): - Protein không gấp khúc hay gấp khúc 1 phần - Di chuyển đến điểm đích Vd: Sự v