Bài giảng Sinh học phân tử và tế bào thực vật - Cơ sở phân tử của sự phát triển thực vật

CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA SỰ PHÁT TRIỂN THỰC VẬT Sự điều hịa biểu hiện gen ở Eucaryote Phát triển là quá trình kiểm sốt sự biểu hiện gen, quá trình điều hịa phức tạp về cơ chế, cơ bản cĩ 5 mức độ: 1- Sự xoắn của NST (Chromatin Packing) 2- Kiểm sốt sự phiên mã (Transcriptional Control) 3- Điều hịa hậu phiên mã (Posttranscriptional) [Nhân tế bào (Nuclear levels)] 4- Kiểm sốt sự giải mã (Translational Control) 5- Điều hịa hậu giải mã (Posttranslational Control) [Cytosol (Cytoplasmic levels)] 2 3 4 5 Sự điều hịa phiên mã bởi những phân tử protein,yếu tố phiên mã (transcription factors -TF). Các phân tử protein này luơn hiện diện trong tế bào và bám vào enhancer của DNA khi phân tử DNA cĩ tín hiệu phiên mã. 6 Điều hịa sau phiên mã (Posttranscriptional control) - Loại bỏ introns - mRNA rời khỏi nhân tế bào - Cĩ thể kiểm sốt tốc độ di chuyển của mRNA ra cytosol (điều hịa số lượng và sản phẩm) 7 Processing of mRNA Transcripts 9 Điều hịa giải mã (Translational Control) Quá trình kiểm sốt và xác định mức độ mRNA được mã hĩa thành protein bao gồm kiểm sốt sự hiện diện của 5’-CAP, 3’-polyA và ảnh hưởng của sự hoạt động protein sản phẩm trong quá trình giải mã. 10 11 12 Summary of Gene Expression (Eukaryotes) 13 Mô hình hormon (động vật) 14 Thông tin thứ 2 của hormon (động vật) 15 Thông tin thứ 2 của hormon thực vật • Yếu tố đáp ứng (RE: responsive element) của hormon thực vật: GARE, ABRE, ERE (GCCGCC)… 16 Mơ hình hoạt động của auxin Biểu hiện gen trong quá trình sinh phơi Nguyên tắc nghiên cứu sự biểu hiện gen trong quá trình sinh phơi là thu thập các biểu hiện đột biến và phân tích theo mơ hình của Arabidopsis thaliana). Cĩ khoảng 3.500 gen cần cho sự phát triển phơi hồn chỉnh, trong đĩ khoảng 40 gen liên quan trực tiếp quá trình, (nếu đột biến sẽ cĩ biểu hiện khiếm khuyết của phơi). 18 Các kiểu đột biến theo trục dọc cây mầm 19 20 Cây hoang dại: hợp tử kéo dài, phân chia lần 1 cho tế bào ngọn nhỏ (phôi) và tế bào gốc lớn (dây treo), sau đó luôn theo các hướng xác định. Đột biến gnom: hợp tử ít kéo dài, phân chia lần 1 cân xứng, sau đó không theo hướng xác định. Phôi hoang dại có 2 tầng ở giai đoạn 8 tế bào: tầng trên cho tử diệp + chồi; tầng dưới cho trụ hạ diệp + rễ. Đột biến monopteros (mp): 4 tầng phân chia kiểu tầng trên của phôi dại  thiếu trụ hạ diệp & rễ  gen mp kiểm soát tạo trụ hạ diệp & rễ. • Vì sao đột biến gnom khôngcó rễ? • Gene gnom •  • Sản phẩm X (?) •  • Gene mp hoạt động •  • Phần gốc cây mầm Nhận xét về quá trình sinh phôi: (1) Sự biểu hiện gene xảy ra theo một trình tự xác định: gnom  mp  stm (2) Kéo dài tế bào theo hướng và vị trí đúng của mặt phẳng phân chia tế bào là những yếu tố đầu tiên kiểm soát sự phát sinh hình thái. (3) Phôi có cấu trúc phân tầng (phân đoạn) ở các giai đoạn sớm. (4) Quá trình sinh phôi được kiểm soát chính xác theo thời gian và không gian. • (5) Nhờ sự điều hòa (theo thời gian và không gian), các tế bào dẫn xuất từ hợp tử phân hóa, mất tập tính phân chia và lần lượt cho những cấu trúc hình thái chuyên biệt. • (6) Mỗi tế bào soma thừa hưởng toàn bộ thông tin di truyền của hợp tử, nhưng chỉ có một phần thông tin được biểu hiện trong tế bào phân hóa. • (7) Tiềm năng sinh phôi của tế bào bị đàn áp bởi các tương quan trong cơ thể nguyên vẹn. • (8) Sự tương quan (thuận & nghịch) xuất hiện sớm trong quá trình sinh phôi (tế bào ngọn đàn áp khả năng sinh phôi của tế bào gốc) và có thể giải thích ở mức phân tử (liên hệ gnom / mp). Sự nuôi cấy tế bào và thu nhận cây chuyển gen • Nuơi cấy mơ và tế bào thực vật (Plant cell and tissue culture) là sự nuơi cấy in vitro tế bào và mơ thực vật. • Kỹ thuật này cĩ tính ứng dụng cao trong việc tạo các mẫu chuẩn sử dụng cho các nghiên cứu sinh lý, sinh hĩa, di truyền hay cấu trúc thực vật. • Đây là phương tiện hữu hiệu trong vi nhân giống theo qui mơ cơng nghiệp (micropropagation). Chuyển gen thực vật (Transgenic Plant) là một trong những lĩnh vực đang được đầu tư và phát triển. Sự kết hợp sử dụng các thể chuyển như vi khuẩn, súng bắn gen cùng với nuơi cấy tế bào (hay đồng nuơi cấy) đã tạo một điều kiện thích hợp cho sự tái tổ hợp DNA trong cơ thể thực vật. Hiện tượng chuyển gen xảy ra trong tự nhiên, con người chỉ phát hiện và cải tiến theo hướng thực dụng. • Các kiểu nuôi cấy in vitro •  Nuôi cấy đoạn thân (plant culture) •  Nuôi cấy phôi (embryo culture) •  Nuôi cấy cơ quan (organ culture) •  Nuôi cấy mô hay mô sẹo (tissue or callus culture) •  Nuôi cấy dịch treo tế bào hay nuôi cấy tế bào (cell suspension or cell culture) •  Nuôi cấy TBT (protoplast culture) •  Nuôi cấy thể đơn bội (haploid culture): • hạt phấn, bao phấn, noãn, bầu noãn Mô sẹo Dịch treo tế bào Một cách tổng quát, sự thu nhận phôi thể hệ qua 2 giai đoạn quan trọng Sự tạo tế bào sinh phôi trong mô sẹo hay dịch treo tế bào, giai đoạn này cần hiện diện của auxin (riêng rẽ hay phối hợp cyt). Tiến hoá phôi thể hệ với sự giảm hay loại bỏ auxin trong môi trường nuôi cấy. Auxin tỉng céng IAA 0 3 5 7 10 Thêi gian (ngµy) Giai đoạn tiến hóa phôi Giai đọan tạo tế bào sinh phôi (mô sẹo, dịch treo tế bào) Phôi hình cầu Phôi hình chùy Phôi trưởng thành Các giai đoạn tiến hoá phôi thể hệ ở mô sẹo lá Đinh lăng g h b 20m f 200m e 300m d 400m c 140m Phơi ở giai đoạn hai tử diệp Cây con phát triển từ phơi 3. Sự chuyển gen ở thực vật DNA tái tổ hợp + Agrobacterium (với plasmid biến đổi) Nuôi cấy và tuyển chọn với chất kháng sinh Súng DNA The Golden Rice • Vitamin A deficiency is a major health problem • Causes blindness • Influences severity of diarrhea, measles • >100 million children suffer from the problem • For many countries, the infrastructure doesn’t exist to deliver vitamin pills • Improved vitamin A content in widely consumed crops an attractive alternative -Carotene Pathway Problem in Plants IPP Geranylgeranyl diphosphate Phytoene Lycopene  -carotene (vitamin A precursor) Phytoene synthase Phytoene desaturase Lycopene-beta-cyclase ξ-carotene desaturase Problem: Rice lacks these enzymes Normal Vitamin A “Deficient” Rice The Golden Rice Solution IPP Geranylgeranyl diphosphate Phytoene Lycopene  -carotene (vitamin A precursor) Phytoene synthase Phytoene desaturase Lycopene-beta-cyclase ξ-carotene desaturase Daffodil gene Single bacterial gene; performs both functions Daffodil gene -Carotene Pathway Genes Added Vitamin A Pathway is complete and functional Golden Rice 4. Cô lập, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần Tế bào trần cô lập từ lá Khoai tây (Solanum tuberosum L.) Hỗn hợp enzym celulaz 0,05%, Pectolyaz 0,025% trong dung dịch sorbitol 6%. Phát sinh phơi thể hệ từ sự nuơi cấy tế bào trần ở cây Chuối • Phân tích di truyền • Bộ gen nhân: Phần lớn cây lai không bền nhiễm sắc thể; một số nhiễm sắc thể bị loại. • Bộ gen lục lạp: Cây lai chỉ có một kiểu lục lạp [thay bộ gen lục lạp]. • Bộ gen ti thể gồm nhiều dưới phân tử có nguồn gốc từ 2 tb cha-mẹ Sơ đồ hệ thống điện xung (gene pulser) Tuyển chọn ở mức tế bào Nhuộm sống tế bào trần: fluorescin cho tế bào này và rhodamin cho tế bào kia. Dùng tế bào A kháng chất A, tế bào B kháng chất B và tuyển chọn tb kháng đồng thời A và B. Tuyển chọn ở mức cây tái sinh Đối với bộ gen nhân, có thể dựa vào các chỉ thị hình thái, sinh hóa (isoenzym), phân tử (dò phân tử, RFLP, RAPD...) và tế bào (quan sát nhiễm sắc thể ở metaphase)... •Tuyển chọn các sản phẩm dung hợp • Thí dụ về sự lai thể hệ ở khoai tây • Dòng BF 15 nhạy virus & tuyến trùng. • Điện dung hợp: BF 15 * Aminca (kháng) • Nuôi cấy: mô sẹo và thu nhận cây tái sinh Kiểu isoenzym malat dehydrogenaz của cây lai BF 15 x Aminca • Triển vọng và khó khăn trong sự dung hợp tế bào trần • * Loại trừ tính bất thụ hữu tính, chuyển đặc tính có ích vào cây trồng. • * Ít phương tiện, ít tốn kém, nhanh và trực tiếp. • [Thành công ở khoai tây, cà chua, bắp cải, thuốc lá, đậu, lúa, bắp…] • * Cần hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy TBT • * Tuyển chọn phức tạp Thí dụ ở colza Vài đột biến gen ti thể gây vô sinh đực tế bào chất (SMC): hạt phấn không hoạt động. SMC được dùng để sản xuất hột giữ đặc tính mẹ (không phải ngắt nhị bằng tay). SMC được đưa vào colza nhờ sự giao với radis: cây lai khiếm khuyết diệp lục tố. Lai thể hệ colza bình thường X colza SMC (nhờ giao với radis).