Bài giảng Vi sinh thực phẩm - Chương 5: Những vấn đề kỹ thuật và phương pháp tạo giống vi sinh vật

NHỮNG VẤN ĐỀ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG VI SINH VẬT Chương 5 I. YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG GIỐNG - Sản lượng cao, thuần khiết, dễ tách - Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền, dễ tìm - Thuần chủng - Khỏe, phát triển nhanh - Có khả năng chống tạp nhiễm - Dễ bảo quản, ổn định - Có khả năng cải tạo I. YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG GIỐNG Các trung tâm giữ giống vi sinh vật • ABBOTT: Abbott Laboratories, North Chicago, III.60064, USA. • ATCC: American Type Cultur Collection, 12301, Parklawn Drive Rockvill Md 20852, USA. • CANAD – 212: Division Obioscience, National Research Council, Ottawa, Canada. • CC: CRISO Division of Plant Industry, Canberra City, A.C.T. Australia. • FERM: Fermentation Reseach institute, Agency of IndustrialScience and Technology, Ministry of Industrial Trade and industry, Chiba, Japan. • HIR: Food and Fermentation Division, Hokkaido Profectural Industrial Research Institute, Sapporo, Japan. • IMASP: Museum of Culture, Institute of Microbiology, Academy of Science of Republic of China Peking, China. II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG  Phân lập  Đột biến nhân tạo  Lai tạo gen II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP 1. Chọn hộp petri chứa: 45 colonies (thuộc ống nghiệm thứ 2). 2. Tổng độ pha lõang của ồng nghiệm thứ 2 là 1/102 (99+1) (ống nghiệm 1)x 1/10 (= 10/(10+90) (ống nghiệm 2) = 1/103 3. Lượng mẫu dùng để đổ đĩa là = 0.1ml = 1/10. Vậy lượng VSV có trong mẫu là: Tính lượng VSV sau khi pha lõang ml colonies /450000105.41045 10 1 10 1 45 53 3   II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP Bài tập II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP Đổ đĩa II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP Cấy ria II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – ÐỘT BIẾN Loại đột biến Bản chất các thay đổi Dấu hiệu phát hiện đột biến Không di động Mất tiên mao, hoặc tiên mao không hoạt động Các khuẩn lạc mọc dính vào nhau. Không tạo nha bào Mất hoặc thay đổi bề mặt màng nhầy Khuẩn lạc bé, xù xì thay vì lớn, tròn, bóng. Khuẩn lạc xù xì Mất hoặc thay đổi lớp bên ngoài lipopolysaccharide Khuẩn lạc nhiều hạt nhỏ, không đều Dinh dưỡng Mất một hoặc nhiều enzym trên con đường sinh tỏng hợp Không mọc trên môi trường tổng hợp tối thiểu Lên men đường Mất enzym phân giải các loại đường Không tạo ra sự biến đổi màu trên môi trường đặc trưng với chỉ thị màu đặc trưng. II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG – ÐỘT BIẾN Loại đột biến Bản chất các thay đổi Dấu hiệu phát hiện đột biến Kháng thuốc Thay đổi khả năng thẩm thầu, ngăn cản sự xâm nhập vào tế bào của các loại thuốc, hoặc phá hủy các thuốc. Mọc trên môi trường có thuốc ở nồng độ mà bình thường có thể gây ức chế phát triển của vi sinh vật. Kháng virút Mất điểm tiếp nhân virút Phát triển trên môi trường nuôi cấy khi có mặt virút ở nồng độ cao. Nhạy cảm với nhiệt độ bình thường Thay đổi một protein thiết yếu làm tăng sự nhạy cảm với nhiệt độ Có khả năng phát triển ở nhiệt độ thấp. Nhưng ở nhiệt độ bình thường không phát triển. Mất sắc tố Mất các enzym có khả năng tham gia tổng hợp sắc tố Khuẩn lạc có màu khác hoặc mất màu II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp cấy truyền định kỳ trên môi trường mới:  Sử dụng thạch nghiêng.  Nấm mốc: cấy truyền sau 3 – 6 tháng  Nấm men, vi khuẩn: cấy truyền sau 1 – 2 tháng  Ưu điểm: đơn giản, dễ làm.  Nhược điểm: tốn công sức, môi trường, thời gian. Không ổn định Coccidioides immitis II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp cấy truyền định kỳ trên môi trường mới:  Phương pháp làm:  Thuần khiết lại chủng vi sinh vật trên thạch đĩa.  Cấy vi sinh vật điển hình lên thạch nghiêng.  Nuôi trong tủ ấm.  Lấy ống giống ra và cho vào tủ lạnh bảo quản ở 40C.  Định kỳ cấy truyền lại.  Có thể cho thêm 1% dầu thực vật vào để tránh mất nước Actinomycetes II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng: Campylobacter jejuni  Sử dụng dầu khoáng như vaselin, parafin..  Ưu điểm:  Đơn giản, hiệu quả cao.  Môi trường không bị mất nước.  Vi sinh vật sẽ được bảo quản lâu hơn so với phương pháp 01. II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng:  Cách bảo quản:  Khử trùng dầu khoáng (1210C, 2h).  Sấy khô (1700C, 1 – 2h)  Để nguội.  Đổ lên môi trường thạch nghiêng có VSV phát triển tốt khỏang 1cm. Đậy nút bông lại.  Trét parafin đặc lên miệng  Giữ ở điều kiện lạnh hoặc điều kiện thường. Serratia II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp giữ giống trên đất, cát:  Bảo quản các vi sinh vật tạo bào tử.  Thời gian bảo quản từ 1 - nhiều năm.  Trước khi dùng phải:  Cấy ria lên môi trường agar  Chọn các khuẩn lạc điển hình... Aspergillus II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp giữ giống trên đất, cát: Cách làm:  Đất hoặc cát đem rây kỹ, lấy hạt cùng cỡ.  Ngâm trong HCl hoặc H2SO4 đậm đặc 8 – 12h  Với đất chua thì trung hòa bằng CaCO3 1 – 2%.  Rửa đến pH trung tính.  Sấy khô, thanh trùng và giữ vô trùng.  Đổ cát vào ống nghiệm chứa VSV trên thạch (nhiều bào tử), lắc đều.  Rót cát lẫn vi sinh vật và bào tử sang ống nghiệm vô trùng khác.  Đậy nút bông giữ ở 400C trong 2 – 3 ngày.  Hàn kín ống nghiệm bằng paraffin.  Để trong phòng mát hoặc ở 40C. Clostridium II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp giữ giống trên hạt  Bảo quản các vi sinh vật có dạng hình sợi sinh bào tử hoặc không.  Thời gian bảo quản có thể lên tới 1 năm.. II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp giữ giống trên hạt  Phương pháp làm:  Hạt ngũ cốc được rửa sạch bằng nước nóng.  Cho vào các ống nghiệm.  Phủ trên các hạt này một lớp bông thấm nước  Nấu hạt ngũ cốc.  Thanh trùng hạt ở 1210C trong 40 phút.  Thanh trùng 3 lần, mỗi lần cách nhau 24h.  Cấy giống vi sinh vật trên lớp bông cho mọc thật dầy.  Hằng ngày lắc nhẹ.  Sau 8 – 10 ngày kiểm tra lại.  Gắn paraffin.  Giữ ở nhiệt độ 15 – 200C. II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Giữ giống trên giấy lọc:  Bảo quản các vi sinh vật có bào tử. Thời gian bảo quản nhiều năm. Cách làm  Giấy lọc cắt miếng 1-3 cm. Cho vào ống nghiệm.  Đậy nút bông, thanh trùng ở 1210C, 1 giờ.  Sấy ở 1000C, 3 giờ.  Vi sinh vật nuôi trong 3 – 5 ngày để có bào tử.  Cho vào mỗi miếng giấy lọc 1 giọt vi khuẩn. Nuôi thêm 2 – 3 ngày.  Phủ paraffin đặc đun chảy lên nút bông.  Để tủ lạnh hoặc nơi mát. Clostridium II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Giữ giống trên các miếng gelatin: • Môi trường gelatin:  nước thịt + 10% gelatin + 5% inosit  nước thịt + 10% gelatin + 0,25% acid ascorbic. • Cho vi sinh vật vào môi trường. Nuôi một thời gian. • Nhỏ môi trường chứa vi sinh vật lên giấy nến trong hộp petri. • Sấy khô trong tủ hút chân không, dùng P2O5 hấp thụ nước. • Bỏ trong ống nghiệm. • Giữ ở 50C. • Khi sử dụng nuôi trong broth thích hợp. Cấy vào agar, chọn khuẩn lạc. Yersina II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp lạnh đông:  Phương pháp làm đơn giản  Vi sinh vật giữ được lâu  Cách làm:  Trộn vi sinh vật và các chất bảo vệ vào lẫn với nhau  Cho vào ống nghiệm, làm lạnh từ từ.  Chất bảo vệ:  glycerin 10% + geletin 1% + pH trung tính  huyết thanh ngựa + geletin 1% + pH trung tính  saccharose 10% + geletin 1% + pH trung tính  dung dịch glucose 10%,  dung dịch lactose 10%). Sarcina II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp lạnh đông:  Nếu nhiệt độ trữ lạnh từ (-) 150C – (-) 200C : 6 tháng cấy truyền một lần.  Nếu nhiệt độ trữ lạnh là (-) 300C : 9 tháng cấy truyền một lần.  Nếu nhiệt độ trữ lạnh là (-) 400C : 1 năm cấy truyền một lần  Nếu nhiệt độ trữ lạnh từ (-) 500C – (-) 600C : 3 năm cấy truyền một lần  Nếu nhiệt độ trữ lạnh từ (-) 700C – (-) 600C : 10 năm cấy truyền một lần E. coli II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp đông khô:  Làm cho tế bào mất nước theo phương pháp thăng hoa ở áp suất thấp.  Làm giảm hoặc làm ngừng hẳn quá trình phân chia của vi sinh vật.  VSV không bị biến đổi về các đặc tính di truyền  Thời gian lưu giữ lâu lên tới vài chục năm.  Đuợc dùng nhiều trong sản xuất. Nấm men II. PHƯƠNG PHÁP GIỮ GIỐNG VI SINH VẬT Phương pháp đông khô:  Sau khi nuôi cấy, vi sinh vật được trộn với chất bảo vệ,  Phân vào ống nghiệm  Cho vào chậu lạnh ở nhiệt độ (-)70 – (-)800C, trong 1 – 5 phút.  Đưa vào thiết bị đông khô (p= 10-4Hg, 8 – 14 giờ ).  Sau khi làm khô, độ ẩm còn 1 – 4%.  Kiểm tra lại hàm lượng ẩm bằng giấy tẩm CoCl2 3%.  Hàn kín ống nghiệm khô.  Bảo quản ở nhiệt độ phòng. Vibrio