Báo cáo Chọn tạo giống lúa kháng bạc lá trong hệ thống lúa lai hai dòng

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây lúa (Oryza Sativa L) là một trong những cây trồng cung cấp nguồn lương thực quan trọng nhất của loài người, với 40% dân số thế giới sử dụng lúa gạo làm thức ăn chính và có ảnh hưởng đến đời sống của ít nhất 65% dân số thế giới. Ở Việt Nam, việc áp dụng thành tựu về lúa lai đã có kết quả to lớn. Năng suất lúa lai so với lúa thường tăng từ 20% trở lên và diện tích lúa lai ngày càng tăng. Trước đây 10 năm, Việt Nam đã xuất khẩu được một lượng lúa gạo lớn đứng thứ hai trên thế giới (FAO, 2006). Sản xuất lúa lai hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều công nghệ và giống mới được tạo ra. Chọn tạo giống lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá”. Bệnh bạc lá lúa( Xanthomonas oryzae) là một loại bệnh hiện rất đang phổ biến và gây tác hại nghiêm trọng hầu hết ở các nước, trung bình giảm 6-60% năng suất, tăng tỷ lệ hạt lép. Ở nước ta bệnh cũng đã gây hại nghiêm trọng và đặc biệt trên các giống lúa lai. Vì thế một trong những định hướng về phát triển lúa lai ở nước ta là chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá. Chính vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Chọn tạo giống lúa kháng bạc lá trong hệ thống lúa lai hai dòng” 1.2. Mục đích - Nghiên cứu bệnh bạc lá giúp chúng ta hiểu rõ hơn tác hại của bệnh bạc lá với cây lúa. - Nghiên cứu các gen kháng bệnh bạc lá lúa nhằm mục đích chuyển gen kháng bệnh vào các giống lúa bằng phương pháp truyền thống hoặc có sự hỗ trợ của công nghệ sinh học. - Chuyên gen vào các dòng bố, mẹ làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống lúa trong hệ thống lúa lai hai dòng. B. NỘI DUNG I.CƠ SỞ LÝ LUẬN VỀ BỆNH BẠC LÁ LÚA (Xanthomonas oryzae. Pv.oryzae) I.1. Giới thiệu về bệnh bạc lá lúa Bệnh bạc lá lúa (Bacterial leaf blight of rice) được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka, Nhật Bản vào khoảng năm 1884 – 1885. Sau đó đã có báo cáo xuất hiện bệnh ở nhiều nước khác nhau, đặc biệt ở Châu Á (Nhật Bản, Trung Quốc, Philippin), Bắc Châu Úc, Mỹ Latin; Trung Mỹ và Caribê (1975); Pakistan (1976); …. Hiện nay, bệnh đã gây hại phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới . Ở nước ta, bệnh này đã gây hại từ lâu trên các giống lúa mùa cũ, nhưng đặc biệt từ năm 1965 – 1966 tới nay có năm bệnh phá hại một cách nghiêm trọng ở các vùng đồng bằng trên các giống lúa mới nhập nội có năng suất cao ở vụ xuân và nhất là trong vụ mùa . Theo số liệu thống kê của cục Bảo vệ thực vật, từ năm 1999-2003 diện tích lúa bị hại do bệnh bạc lá gây ra trong cả nước là 108.691,4 ha (miền Bắc là 86.429,2 ha; miền Nam là 22.262,2 ha), trong đó diện tích bị hại nặng nhất là 156,76 ha và diện tích mất trắng là 80 ha . I.2. Triệu chứng của bệnh bạc lá lúa Năm 1960, Goto đã chỉ ra rằng: vi khuẩn Xanthomonas oryzae. Pv.oryzae gây ra 3 triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa ở nhiệt đới: bạc lá, héo xanh ( Kresek hay Wilt) và vàng nhợt. Những nghiên cứu trong nhà lưới chứng tỏ: hiện tượng héo và bạc lá khác nhau một cách rõ ràng và độc lập. Héo và bạc lá những triệu chứng do ảnh hưởng ban đầu của sự nhiễm bệnh, triệu chứng vàng nhợt là ảnh hưởng sau . Theo Lê Lương Tề thì ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa phát sinh phá hại suốt từ thời kỳ mạ đến chín nhưng có triệu chứng điển hình là ở thời kỳ lúa cây trên ruộng từ sau đẻ - trỗ, chín sữa. Trên mạ, triệu chứng thể hiện không đặc trưng như ở trên lúa, do đó cũng dễ nhầm lẫn với các triệu chứng khác. Chủ yếu vi khuẩn hại mạ gây ra triệu chứng ở mút lá hoặc mép lá mạ những vết dài ngắn khác nhau màu xanh vàng rồi nâu bạc, lá dễ bị khô . Trên lá lúa, triệu chứng bệnh thể hiện rõ hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều tuỳ theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng nói chung vết bệnh có những đặc điểm điển hình sau đây: - Vết bệnh ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá hoặc lan thẳng xuống gân chính, ở một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá. - Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng hoặc thẳng, mô bệnh xanh tái, vàng lục, cuối cùng cháy khô có màu nâu xám. - Thông thường ranh giới giữa mô bênh với mô khỏe trên phiến lá rất rõ rệt., có giớ hạn theo đường gợn sóng vàng hoặc không vàng, có khi chỉ một đường viền màu nâu sẫm, đứt quãng hay không đứt quãng. Có thể căn cứ vào những đặc điểm triệu chứng trên để phát hiện bệnh. Tuy nhiên nhiều khi vết bệnh quá cũ hoặc biến đổi quá nhiều theo giống và điều hiện bên ngoài, nhất là ở mạ do vậy có thể nhầm lẫn với những hiện tượng khô đầu lá sinh lý . I.3. Nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa I.3.1 Nguồn gốc của bệnh bạc lá lúa Khi mới xuất hiện ở Nhật Bản, người ta cho rằng bệnh có nguồn gốc sinh lý, do đất chua gây nên. Đến khi Takaishi (1908) và Boukara (1911) đã tìm thấy vi khuẩn trong giọt dịch và lây bệnh lại được cho cây thì nguyên nhân gây bệnh đã được giải đáp . Vi khuẩn gây bệnh bạc lá đã được nhiều tác giả nghiên cứu và đã từng được đặt nhiều cái tên khác nhau: Pseudomonas oryzae Uyeda et Ishiyama hoặc Phytomanas oryzae Magrou Xanthomonas campeitris p.v. oryzae Xanthomonas kresek Schure Xanthomonas oryzae (Ishiyama) Dowson Hiện nay vi khuẩn này được biết đến với cái tên Xanthomonas oryzae. Pv.oryzae (Ishiyama). I.3.2. Nguyên nhân gây bệnh I.3.2.1. Đ ặc điểm vi khuẩn bạc lá Vi khuẩn hình gậy hai đầu hơi tròn, có một lông roi ở một đầu, kích thước 1-2 x 0,5-0,9 µm, sống trên môi trường có khuẩn lạc hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, vi khuẩn nhuộm gram âm, không có khả năng khử NO3, không có dịch hoá gelatin, không tạo ra NH3, indol, có khả năng tạo H2S. Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trưởng 26 – 30oC, nhiệt độ tối thiểu 0 – 5oC, tối đa 40oC. Nhiệt độ gây chết là 53oC trong 10 phút, có thể sống trong phạm vi pH 5,7 – 8,5, thích hợp nhất ở pH 6,8 – 7,2. Vi khuẩn xâm nhiễm qua thuỷ khổng, lỗ khí ở trên mút lá và đặc biệt qua vết thương xây xát trên lá. Khi đã tiếp xúc với bề mặt có màng nước ướt, vi khuẩn dễ dàng di động tiến vào bên trong các lỗ khí, qua vết thương mà sinh sản nhân lên về số lượng qua các bó mạch dẫn lan rộng đi. Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho việc phát triển của vi khuẩn, trên mặt lá bệnh tiết ra những giọt keo vi khuẩn thông qua sự va chạm giữa các lá lúa nhờ mưa gió mà truyền lan tới các lá, các cây khác để tiến hành lây nhiễm lặp lại trong nhiều đợt sinh trưởng. Cho nên tuy là một loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan hẹp, song nó còn tùy thuộc vào mưa gió, giông bão xảy ra trong vụ mùa mà bệnh có thể truyền lan với phạn vi không gian khá rộng, giọt keo vi khuẩn với số lượng nhiều, đó chính là một nguyên nhân quan trọng làm bệnh sau những đợt mưa gió vào cuối vụ lúa xuân và trong suốt vụ mùa ở nước ta. I.3.2.2 Nguyên nhân gây bệnh Về nguồn bệnh bạc lá, các tác giả Nhật Bản cho rằng nguồn bệnh tồn tại chủ yếu trên một số cỏ dại họ Hoà thảo, nói cách khác một số cỏ dại là ký chủ phụ của vi khuẩn X. oryzae. Ở nước ta phát hiện thấy vi khuẩn hại trên lúa và trên các ký chủ cỏ dại, tàn dư rơm rạ của cây bệnh, lúa chét, cỏ môi, cỏ lồng vực, cỏ gừng bò,…(Lê Lương Tề, 1980) . Mỗi vùng khác nhau thì cũng có sự khác nhau về thành phần và số lượng chủng X.oryzae: Nhật Bản đã xác định được 5 chủng, Philippine đã xác định được 6 chủng, Indonesia đã xác định được 9 chủng, miền Bắc Việt Nam đã xác định được 4 chủng với nhiều Isolates . Về nguyên nhân gây bệnh có thể kể đến một sô nguyên nhân chính sau: - Một số giống mẫn cảm với bệnh bạc lá như một số giống tạp giao và một số giống chất lượng. - Do thời tiết nóng ẩm, mưa to gió lớn xảy ra trong thời kỳ lúa cần quang hợp cao. - Do biện pháp canh tác làm đất, cây lúa nhiễm bệnh vàng lá sau lập thu, bón thêm phân cấp cứu vàng lá, cây lúa ra lớp rễ mới phát triển lá non nên gặp mưa dông dễ nhiễm bệnh bạc lá. - Bệnh thường mẫn cảm với lượng đạm dư trong lá, những ruộng bón đạm nhiều, bón muộn, bón lai rai, bón không cân đối giữ đạm, lân và kaly, những ruộng trũng hẩu dồn đạm cuối vụ, do biện pháp thâm canh gieo cấy, chăm bón không đúng kỹ thuật. I.3.3. Tác hại của bệnh bạc lá: Giảm diện tích quang hợp của lá Giảm khối lượng 1000 hạt Tăng tỷ lệ hạt lép Giảm 20- 50% năng suất I.3.4. Con đường xâm nhập

 . I.4. Cơ sở khoa học của chọn giống kháng bệnh bạc lá lúa Theo Viện bảo vệ thực vật thì cải tiến chế độ canh tác như: sử dụng phân bón hợp lý, đảm bảo thời vụ gieo cấy, chế độ nước tưới hợp lý và sử dụng giống chống chịu được coi là những biện pháp có hiệu lực phòng chống bệnh này. Trong đó việc sử dụng giống chống chịu được coi là biện pháp hàng đầu và có hiệu quả nhất để phòng trừ bệnh bạc lá lúa. Bạc lá lúa xuất hiện ở tất cả các vùng trồng lúa trên thế giới. Tuy nhiên hình thức sinh sản đơn giản nhưng vi khuẩn bạc lá vẫn luôn chịu ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh dẫn đến cấu trúc di truyền thay đổi, từ đó tạo ra rất nhiều bệnh cùng tồn tại trên đồng ruộng. Nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi cấu trúc di truyền của vi khuẩn là: - Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật không hợp lý, người nông dân vì thiếu hiểu biết đã sử dụng một loại thuốc với liều lượng lớn và liên tục trên một ruộng sản xuất, làm cho vi khuẩn lúc đầu có thể bị tiêu diệt nhưng sau đó chúng trở nên nhờn thuốc và hình thành nòi mới kháng lại loại thuốc trên. - Công tác nhập nội giống cây trồng thực hiện hậu kiểm dịch không chặt chẽ làm cho vi khuẩn tồn tại trên hạt giống di chuyển từ vùng này sang vùng khác, tạo ra sự đa dạng nòi và gây ra những khó khăn khôn lường. - Hình thức canh tác đa dạng trồng nhiều giống lúa khác nhau (bao gồm cả lúa thường và lúa lai) trên một vùng rộng lớn trồng lúa đã tạo ra môi trường ký chủ phong phú, là điều kiện hình thành nên nhiều nòi vi khuẩn. Ngoài ra, điều kiện thời tiết thay đổi với những diễn biến phức tạp cũng là một nguyên nhân gây ra hiện tượng này. Do vậy, việc chọn giống chống bệnh bạc lá là rất khó. Những năm 80 của thế kỷ XX, Viện nghiên cứu lúa Quốc tế đã xác định bản chất di truyền tính chống bệnh là do gen quy định. Điều này được khẳng định chắc chắn nhờ vào những nghiên cứu của các nhà khoa học cùng những kỹ thuật hiện đại. Tính kháng của cây trồng là khả năng của cây làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của ký sinh sau khi có sự tiếp xúc của ký sinh với ký chủ được khởi phát. Trong tính kháng của cây trồng có tính kháng dọc (kháng chuyên nòi) do đơn gen kiểm soát và tính kháng ngang (kháng nhiều nòi) do một hoặc đa gen quyết định. Giải thích cơ chế kháng, Flor (1956) đã đưa ra thuyết “gen đối gen”: mỗi một gen quy định tính kháng của ký chủ thì có một gen đặc thù quy định tính gây bệnh của ký sinh, trước hay sau thì nó cũng thắng gen của ký chủ và cây trồng tiếp tục tiến hoá. Khi nghiên cứu bệnh bạc lá người ta nhận thấy hiện tượng ban đầu giống biểu hiện tính kháng rất tốt ở một vùng trồng nhưng sau đó một vài năm thì giống này lại trở nên nhiễm bệnh - người ta gọi đây là sự phá vỡ tính kháng (breakdown of resistance) của một giống mà nguyên nhân là sự xuất hiện của chủng vi khuẩn mới có độc tính cao hơn. Để kiểm soát sự phá vỡ tính kháng, một vài chiến lược chọn tạo giống đã được đề xuất ví dụ sự đề xuất của Ezuka và Sakaguchi (1978) như sau: - Sử dụng giống chứa gen có tính kháng ngang. - Tổ hợp tính kháng ngang từ tính kháng dọc bằng cách: Sử dụng giống nhiều dòng (multiline) bao gồm một hỗn hợp các dòng đẳng gen, mỗi dòng có một gen kháng dọc khác nhau nhưng đồng nhất về thời gian sinh trưởng, hình thái và các thuộc tính khác; sử dụng luân chuyển các giống có các gen kháng dọc khác nhau. Sự luân chuyển có thể diễn ra theo không gian hay theo thời gian; tập hợp một lượng đủ lớn các gen kháng dọc trong một giống đơn . Thực hiện chiến lược này, nhà chọn giống cần có thông tin chính xác về nguồn bệnh cũng như thông tin về sự di truyền tính kháng của vật liệu tạo giống. I.5. Chuyển gen kháng bệnh bạc lá I.5.1. Nghiên cứu về gen kháng bệnh bạc lá Cho đến tháng 6/2005 các nhà khoa học đã tìm ra 30 gen kháng bệnh bạc lá. Các gen kháng được ký hiệu Xa1, Xa2, … Tính kháng bệnh có thể được quy định bởi một gen đơn trội: Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, ...; một gen đơn lặn xa5, xa8, xa13, xa26, xa28, …; hoặc do hai gen kết hợp với nhau như Xa1/Xa4, Xa4/Xa7, ... Hiện nay trong nghiên cứu đã sử dụng tới 10 dòng đẳng gen (dòng chỉ thị) là: IRBB1, IRBB2, IRBB3, IRBB4, IRBB5, IRBB7, IRBB10, IRBB11, IRBB14, IRBB21 chứa lần lượt các gen đơn chống bệnh Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa1, Xa11, Xa14, Xa21 [12].Các gen kháng nằm trên các nhiễm sắc thể (NST) khác nhau: gen Xa1, Xa2, Xa12 nằm trên NST số 4, gen lặn xa5 nằm trên NST số 5, gen Xa7 nằm trên NST số 6, gen Xa15 nằm trên NST số 8, gen Xa9 nằm trên NST số 10 và các gen Xa10, Xa21,Xa23, Xa3, Xa4 nằm trên NST số 11 R-gene  Donor  Chrom  R-gene  Donor  Chrom   Xa1  Kogyoku  4  Xa16  Te-tep  -   Xa2  Tetep  4  Xa17  Asominori  -   Xa3  Wase Aikoku  11  Xa18  IR24, Toynishiki  -   Xa4  TKM6  11  xa19  XM5  -   Xa5  DZ192  5  xa20  XM6  -   Xa7  DV85  6  Xa21  O. longistaminata  11   Xa8  PI231129  7  Xa22(t)  Zhachanglong  -   Xa10  CAS 209  11  Xa23  Oryza rufipogon  -   Xa11  IR8  -  xa24(t)  DV86  -   Xa12  Kogyoku  4  xa25  Nep Bha Bong To  -   Xa13  BJ1  8  Xa26  Arai Raj  -   Xa14  TN1  -  xa27  Lota Sail  -   Xa15  XM41  -  Xa?  Oryza minuta  -   Tại Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI phát hiện gen kháng bệnh bạc lá Xa21 ở loài lúa dại Oryzae longistaminata ( Khush et al 1989). Khác với sự nhận diện của một gen khác, gen trội Xa21 kháng toàn bộ các chủng bạc lá tại Ấn Độ và Philippin khi thử kiểm tra tính kháng bệnh (Ikeda et al 1990) . Theo Khush và Kinoshita 1991, Kinoshita 1995, Lin et al 1996 cho rằng có 14 gen trội: Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, Xa7, Xa10, Xa11, Xa12, Xa14, Xa16, Xa17, Xa18, Xa21, và Xa22 và có 6 gen lặn xa5, xa8, xa15, xa18, xa19, xa20. Gen kháng bệnh bạc lá được nhận biết tính kháng khác nhau . Ở Trung Quốc đã chuyển gen kháng Xa21 vào dòng bố có khả năng phối hợp tốt, trong đó có dòng bố Minghui 63 mang gen kháng bệnh bạc lá . I.5.2 Đặc điểm di truyền tính kháng bệnh bạc lá Năm 1961, Nishimura nghiên cứu về gen kháng bệnh, trong nghiên cứu ông đã tìm ra tính kháng bạc lá do một gen trội kiểm soát. Năm 1968, Hen và cộng sự đã nhận xét gen kháng bệnh bạc lá được kiểm soát bởi một gen trội không hoàn toàn. Murty và Khush (1972) đã cho rằng gen kháng bạc lá được kiểm soát bởi một gen lặn và đối với giống DZ192 gen kháng bệnh được kiểm soát bởi 2 gen lặn . Sidhu et và cộng sự (1978) đã phân tích 74 giống lúa trồng và tìm ra 3 giống DV85, DV86 và DZ275 mang một gen lặn là xa5 có tính kháng tốt như các gen trội Quy mô rộng lớn và lâu dài của các giống trồng với một gen đơn có thể phát sinh mầm bệnh gây bệnh trở lại và làm cho tính kháng của đơn gen kháng giảm dần. Như vậy nhóm gen kháng có thể làm cản trở sự xâm nhiễm của vi khuẩn bằng nhóm gen kháng đặc hiệu xa5, xa13 và Xa21 trong trồng lúa. Ở quần thể vi khuẩn có khả năng phát sinh những biến đổi chất độc từ hai hoặc nhiều nhóm nòi mới đã làm ảnh hưởng đến nhóm gen kháng đặc hiệu. Khi chúng ta sử dụng một gen đơn trội, nhóm gen kháng đặc hiệu đã được sử dụng trong phương pháp chọn giống từ sử dụng đơn gen trội đến một nhóm gen kháng đặc hiệu . Như vậy khi sử dụng nhiều gen kháng trong một giống lúa sẽ tạo nên tính kháng ngang ổn định, trên qui mô rộng hơn so với khi chúng ta sử dụng một gen kháng đơn lẻ. - 1956 Flor đưa ra thuyết “gen đối gen” giữa vật chủ và nguồn bệnh Đây là cơ sở để giải thích tính kháng bạc lá. One pair of loci  Pathogen genotypes    AA  Aa  aa   Host genotypes  rr  +  +  +    Rr  -  -  +    RR  -  -  +   I.5.3 Chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp chọn lọc truyền thống Dựa trên nguyên lý của phương pháp lai trở lại (Backcross) là một phương pháp chọn lọc bởi vì toàn bộ quá trình lai bao hàm chọn lọc những cây theo kiểu hồi quy (những tính trạng mong muốn của bố mẹ) . I.5.4 Chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng ứng dụng công nghệ sinh học Chuyển gen kháng vào một dòng lúa bố, mẹ triển vọng. Xu hướng hiện nay là tạo ra các dòng đẳng gen ( Near Isogenic Line) có mang gen kháng sau đó lai quy tụ gen kháng đó vào một nguồn vật liệu Chọn lọc cá thẻ mang gen kháng bằng chỉ thị phân tử dòng đẳng gen mang gen kháng và lai quy tụ gen kháng (Pyramid). I.6 Phương pháp đánh giá tính kháng bạc lá - Đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá: Sau 18 ngày lây nhiễm bệnh tiến hành đo chiều dài vết bệnh (cm) (từ vị trí cắt đến hết vết cháy lá), sau đó đánh giá phản ứng với vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp đo chiều dài vết bệnh của Satoru.Taura (Nhật Bản) đề xuât mứcđộ kháng của các dòng giống theo bảng sau : Chiều dài vết bệnh (cm)  Phản ứng   <4  Kháng cao - High resistant (HR)   4 – 7,9  Kháng - Resistant (R)   8 – 11,9  Kháng vừa – Moderately resistant (MR)   12 – 17,9  Nhiễm - Suscepptible (S)   > 18  Nhễm cao - High susceptible (HS)   I.7. Định hướng nghiên cứu chọn tạo giống lúa lai kháng bệnh bạc lá tại Việt Nam I.7.1. Những thành tựu trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc tại Việt Nam - Chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc lá ở Miền Bắc của Trường Đại học nông nghiệp Hà Nội dùng phương pháp thu thập mẫu bệnh, ứng dụng công nghệ sinh học phân lập, nuôi cấy và phân biệt gen kháng bệnh bằng PCR đã xác định 16 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzea gây bệnh khác nhau. Các dòng chỉ thị IRBB5 (có gen Xa5), IRBB7 (Xa7), IRBB21 (Xa2) có tính kháng đa số các chủng vi khuẩn gây bệnh. - Chọn tạo giống lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá của Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội  với phương pháp lai giữa dòng bất dục 103s và dòng phục hồi chứa gen kháng bệnh bạc lá tạo ra các tổ hợp lai như Việt lai 24(103s/IRBB21), Việt Lai 24 so với đối chứng là Bồi Tạp Sơn Thanh, thời gian sinh trưởng ngắn hơn từ 7-10 ngày, năng suất chấp nhận, thuộc nhóm cây bán lùn, đặc biệt mang gen kháng bệnh bạc lá Xa21. Như vậy, vấn đề giải quyết hạn chế tối đa sự gây hại của bệnh bạc lá bằng phương pháp chuyển gen kháng bệnh vào dòng bố, dòng mẹ là hiệu quả nhất. Chuyển gen trong chọn tạo giống lúa lai sử dụng các gen kháng trội Xa7, Xa21, Xa3/7 và Xa4/5/13/21, dựa trên cở sở các gen này kháng được nhiều chủng bạc lá tại vùng núi Trung du phía Bắc, Đồng bằng Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ. I.7.2 Phương hướng sử dụng gen kháng bệnh bạc lá trong chọn tạo giống lúa lai hai dòng ở Việt Nam Theo kết quả nghiên cứu của Bùi Trọng Thuỷ, các gen đơn trội Xa7, Xa21 và gen lặn xa5 có phản ứng kháng (R), kháng vừa (M) với tất cả 10 chủng vi khuẩn X. oryzae gây bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam. Đây là ba gen Xa - gen kháng rất có ý nghĩa trong việc sử dụng lai tạo, chọn lọc các giống lúa chống bệnh bạc lá. Gen Xa4 kháng được các chủng Y3, Y4, Y5 và Y7. Gen Xa3 có phản ứng kháng (R) chủng Y1. Gen Xa10 kháng được chủng Y2 và kháng vừa (M) chủng Y3. Sự khác biệt lớn của các nhóm gen kháng bao gồm IRBB7, IRBB5, IRBB4 và IRBB21. IRBB7 kháng được các chủng nổi bật, IRBB5 kháng được hầu hết các chủng đại diện. Kết quả nghiên cứu các dòng đẳng gen thu được các dòng chứa gen Xa7, xa5 chống được hầu hết các chủng phân lập, tiếp đến Xa21, Xa4. Kết quả cho thấy vai trò quan trọng của việc sử dụng các gen này trong chương trình chọn giống lúa chống bệnh bạc lá cho miền Bắc Việt Nam . Như vậy khi chúng ta cần sử dụng gen trội Xa7, Xa21 có mặt trong dòng bố hoặc mẹ, con lai F1 sẽ được thừa hưởng tính kháng bệnh 100%. Trường hợp sử dụng gẹn lặn xa5 sẽ dùng trong chọn tạo giống lúa thuần. II. SỬ DỤNG GEN KHÁNG TRONG CHON GIỐNG II.1. Để chuyển gen kháng vào bố, mẹ Ta thực hiện lai quy tụ sử dụng dòng đẳng gen Dòng đẳng gen được tạo từ phương pháp chuyển gen kháng vào gen nền của IR24. Một gen nền cần đảm bảo các điều kiện: + Không mang bất kì gen kháng bạc lá nào + Có đầy đủ các tính trạng tốt để cung cấp cho các nơi +Nằm trong mô hình cấu trúc kiểu cây tương đối lý tưởng Kí hiệu dòng đẳng gen của viện nghiên cứu lúa Quốc tế: IRBB1 = IR24 +Xa1 IRBB21 = IR24 + Xa21 IRBB7 = IR24 +Xa7 + gen kháng Xa21 phát hiện trong lúa dại O.nivara. Vì vậy dùng O.nivara như một thể cho và gen nền là IR24 Tổ chức lai: Mẹ IR24 x Bố O.nivara F1 Tự thụ F2 BC1F2(có 75% gen của IR24) MAS +BC Cứ tiến hành như vậy cho tới đời BC6F2 khi đã có 99% gen của IR24 thì cho tự thụ để chọn ra những cây có kiểu gen gần tới giống hoàn toàn IR24 Sau đó cho lây nhiễm nhân tạo để đánh giá, chú ý luôn sử dụng IR24 làm đối chứng . Sau khi đã tạo ra dòng đẳng gen có thể sử dụng trực tiếp hoặc kết hợp với các gen khác, - dòng đẳng gen lai với dòng mong muốn chuyển gen kháng vào( sử dụng trực tiếp). ví dụ:chuyển gen Xa21 vào dòng TGMS-103S 103S x IRBB21 Như chúng ta đã biết dòng TGMS có khả năng kết hợp rộng được làm mẹ của nhiều giống lúa lai sản xuất ở Việt Nam, giống lúa lai quốc gia đầu tiên ở Việt Nam là việt Lai 20 được lai giữa dòng 103s với giống R20, cho ra con lai có năng suất cao và thời gian sinh trưởng ngắn, nhưng không kháng được bạc lá do bố mẹ của nó không mang gen kháng bạc lá. Mục đích việc nghiên cứu là cải thiện tính kháng bạc lá của dòng mẹ 103s bằng việc đưa vào gen Xa21.Là 1 gen trội biểu hiện tính kháng với 1 dãy rộng các chủng bệnh bạc lá nhờ có MAS trong quá trình lai lạ Sơ đồ tạo dòng 103S mang gen kháng bạc lá TGMS 103S x IRBB21 ( tms-103s) (Xa21) TGMS 103S x F1 TGMS 103S x BC1F1 MAS và lai lại TGMS 103S x BC2F1 MAS và lai lại BC3F1 MAS và tự thụ BC3F2 MAS và tự thụ BC3F3 lây nhiễm thử BB TGMS-103S có gen Xa21 Nhờ có sơ đồ lai này mà đã tạo ra giống R20 kháng bạc lá tại Việt Nam. Kết hợp với các gen khác: IRBB7 x IRBB21 IRBB 21/7 có tính kháng rộng hơn II.2. Một số dòng đẳng gen hiện có trên thế giới:
 Các dòng đẳng gen đã được ứng dụng ở Việt Nam: NILs và lai quy tụ  Xa-gene  Isolaions     HAU02008-1  HAU02009-2  HAU020010-2  HAU01043   IRBB2  Xa1/Xa2  MS  HR  HR  HR   IRBB3  Xa3  S  HR  HR  HR   IRBB4  Xa4  S  HR  HR  HR   IRBB7  Xa7  R  HR  HR  HR   IRBB10  Xa10  S  HR  HR  HR   IRBB11  Xa11  MR  HR  HR  HR   IRBB14  Xa14  R  HR  HR  HR   IRBB21  Xa21  HR  HR  HR  HR   IRBB3/7  Xa3/Xa7  MR  HR  HR  HR   IRBB4/7  Xa4/Xa7  MR  HR  HR  HR   IRBB3/10  Xa3/Xa10  MR  HR  HR  HR   Nguồn: PGS.TS Nguyễn Văn Hoan 2003 II.3.Xu hướng sử dụng các dòng đẳng gen và lai quy tụ Kết hợp nhiều gen trong 1 dòng. Lai quy tụ các gen Xa4, Xa7, xa5, xa13 và Xa21 NIL/ Pyramid  Race    1  3  9  10   IR24  S  S  S  S   Xa4  R  S  S  R   xa5  R  R  R  Thị R   Xa7  I  R  I  R   Xa 21  R  R  R  R   Xa4/xa5/Xa7  R  R  R  R   Xa4/Xa7/Xa21  R  R  R  R   xa5/Xa7/Xa21  R  R  R  R   Xa4/xa5/Xa7/xa13/Xa21  R  R  R  R   II.4.Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc cá thể Để chọn lọc cá thể mang gen kháng một cách chính xác và nhanh chóng chúng ta phải dùng chỉ thị phân tử xác định sự có mặt của gen kháng và kiểm tra hệ gen trong con lai
 Đối với việc chuyển gen kháng bạc lá vào dòng TGMS (103s) ta cũng sử dụng Maker phân tử: Chỉ thị phân tử của Xa21 có các đoạn mồi đặc trưng là M1Xa21, M2Xa21, M3X21 + M1X21: 5’- GGTGTTTTCTGCTCTACACTGC-3’ và 5’-CGAATCCTGTTTGTGTTCATTG-3’ + M2Xa21, 5’ TCCAGCCTTTGCATCTATCA 3’ và 5’-CCCAACGCCATA-3’ +M3Xa21,5’-TGGAGCAATAAAA-3’ và 5’-TACCGATGGTCAATTGCAGA-3’. M1 Xa21 là chỉ thị đồng trội, sử dụng để chọn lọc cây dị hợp mang gen Xa21.