Báo cáo Công nghệ thực hành vi sinh

Báo cáo: Công nghệ thực hành vi sinh Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S Báo cáo thực hành Trang 1 Công nghệ vi sinh là một bộ phận quan trọng trong công nghệ sinh học, là một môn nghiên cứu về những hoạt động sống của VSV nhằm khai thác tốt nhất khả năng kỳ diệu của VSV vào quy trình sản xuất ở quy mô công nghiệp, nhưng để đạt được điều đó ta phải đi từ những hiểu biết về VSV và những phương pháp cơ bản để phân lập, nhân giống, bảo quản giống VSV ở quy mô phòng thí nghiệm, Nội dung dưới đây sẽ trình bày một cách cụ thể quá trình phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu hình thái, ứng dụng của chủng vi khuẩn lactic trong sản xuất một số sản phẩm lên men truyền thống. Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S Báo cáo thực hành Trang 2 CHUẨN BỊ DỤNG CỤ NUÔI CẤY VI SINH VẬT: 1.Các loại hoá chất, dụng cụ, vật liệu ™ Hoá chất để rửa dụng cụ: - Dung dịch Sulfurbicromate. - Cồn 900 - Xà phòng. - Chlorine 3%. ™ Dụng cụ, vật liệu: Dụng cụ, vật liệu Số lượng Dụng cụ, vật liệu Số lượng Ống nghiệm 27 Đĩa petri 18 Pipet(1-10-20ml) 18(1 ml), 2 20 ml) Bình tam giác(100-250 ml) 2(100 8(250 2(500 ml) Đũa thuỷ tinh 4 Que cấy vòng 4 Cối, chày sứ 2 Que gạt 4 Phiến kính Lá kính Bình định mức (100- 1000 ml) 1(100 1(500 1(1000 ml) Cốc thuỷ tinh (100- 1000 ml) 2(100 2(500 2(1000ml) Phễu thuỷ tinh 6 Ống đong (100-1000 ml) 1(100ml) 1(1000ml) Bông không thấm nước Giấy báo Bóp cao su 4 Rổ nhựa 4 Tủ sấy 1 Dao nhỏ 2 2.Chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật ™ Nguyên tắc chung - Các loại dụng cụ dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, thật sạch và trong, không bị nứt mẻ. - Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo thật sạch và khô. - Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng phải đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng. - Sau khi khử trùng cần phải đảm bảo sự vô trùng cho các dụng cụ. ™ Tiến hành: ¾ Các ống nghiệm, đĩa petri, pipet cũ đã bị nhiếm khuẩn phải hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút sau đó rửa lại thật kỹ sau mới mang ra bao gói. ¾ Phương pháp bao gói dụng cụ gồm 2 khâu : -Làm nút bông cho các ống nghiệm, bình tam giác, pipet -Bao gói cho hầu hết các dụng cụ thuỷ tinh. ¾ Cách làm nút bông: *Với các ống nghiệm: -Lấy 1 miếng bông không thấm nước cuộn lại -Dùng ngón tay ấn vào giữa cuộn bông . Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S Báo cáo thực hành Trang 3 *Yêu cầu: nút có kích thước dộ chặt vừa phải -Đầu nút tròn, phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm -Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng. *Với các bình tam giác, chai lọ có kích thước lớn, làm tương tự với ống nghiệm nhưng lượng bông sử dụng phải nhiều hơn. ¾ Cách bao gói dụng cụ: Tất cả các dụng cụ sau khi làm nút bông đều phải được bao gói cẩn thận, phần có nút bông bằng giây dầu hay giấy A4 cũng được để khi hấp khử trùng nút bông không bị ướt đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn. Cách làm: Cắt các bao giấy hinh chữ nhật tuỳ theo kích thước dụng cụ cần bao gói Gấp 1 cạnh của băng giấy, quấn băng giấy quanh đầu có nút bông đặt đầu gấp vào trong phía thành miệng dụng cụ, gấp mép dưới của băng giấy cho kín, gập ống giấy sát vào nút bông ở mặt trước và hai bên, gập phần giấy còn lại và cài sâu vào trong. Dùng 1 tờ giấy báo lớn bao gói các ống nghiệm (khoảng 20-50 ống 1 bọc) Đối với các dụng cụ như: pipet, que gạt, đũa thuỷ tinh, cối chày sứ phải dùng giấy báo bao kín toàn bộ Với các đĩa petri bao gói 5-10 đĩa cùng kích cớ trong 1 bọc bằng giấy báo *Yêu cầu: Phần giấy bao ngoài phải chặt, kín ¾ Phương pháp khử trùng: Sử dụng phương pháp khử trùng bằng sức nóng khô( dùng tử sấy) Cho các dụng cụ được bao gói trên vào tủ sấy, đóng tủ, bật công tắc để tủ hoạt động Xoay các núm để điều chỉnh kim chỉ trên đồng hồ nhiệt độ và kim chỉ trên đồng hồ thời gian với chỉ số nhiệt độ 165oC (hoặc 170oC), trong 2h( hoặc 1,5h). Sau khi sấy, phải để nguội tới 60oC mới lấy dụng cụ ra, tránh lấy dụng cụ ra khi nhiệt độ tủ còn cao các dụng cụ thuỷ tinh dễ nứt vớ. Các dụng cụ sau khi sấy mà giấy bao có màu hơi vàng là được. *Yêu cầu với các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật: Các dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, thật sạch và trong không bị nứt mẻ. Dụng cụ bao gói phải đảm bảo thật sạch và khô. Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng phải đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng. Sau khi khử trùng cần phải đạt được sự vô trùng tuyệt đối cho các dụng cụ bằng cách bảo quản trong tủ sấy ở 30oC, khi cần dùng mới lấy ra dùng. Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S Báo cáo thực hành Trang 4 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG ĐỂ PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN GIỐNG VI KHUẨN LACTIC 1.Mục tiêu: Chuẩn bị môi trường để tuyển chọn, phân lập chủng vi khuẩn lactic Môi trường đặc thù: Môi trường cà chua Khử trùng môi trường bằng áp suất cao trong nồi hấp. *Dụng cụ thiết bị: • Tủ vô trùng. • Nồi hấp áp lực. • Cân kỹ thuật, cân phân tích • Bếp điện. • Đèn cồn. 2. Môi trường phân lập: 500ml môi trường có CaCO3 Môi trường nuôi cấy: 600ml môi trường không có CaCO3 Thành phần 1l trường Môi trường phân 500ml)( có CaCO3 ) Môi trường cấy (600ml) Glucose(g/l) 10 5 6 Cao nấm men(g/l) 10 5 6 CaCO3(g/l) 5 2.5 0 Nước ép cà chua(lọc kỹ)(ml 400 200 240 Dung dịch muối A(ml): − K2HPO4: 2,5g − KH2PO4: 2,5g − nước cất 250m 5 2.5 3 Dung dịch muối B(ml): − MgSO4: 10g − NaCl: 0,5g − FeSO4: 0,5g − MnSO4: 0,5g − Nước cất: 250m 5 2.5 3 Nước cất 600 300 360 Thạch 20 10 12 pH 6.9 6.9 6.9 *Môi trường được chuẩn bị theo trình tự: Cà chua quả đem thái lát, băm nhỏ, dùng vải lọc vắt lấy nước, lấy phần nước đun trên bếp điện hoặc lò vi sóng, sau đó dùng bông thấm nước lọc lấy nước trong, đong lượng nước ca chua cần thiết cho mỗi loại môi trường. Với 1 cốc thuỷ tinh khác, cho thạch vào thêm nước cất, khuấy đều, đun sôi trên bếp điện, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều cho thạch tan hết. Song song đó dùng cốc thuỷ tinh khác cho một ít nước cất vào và cho các thành phần còn lại, đun trên bếp điện và đun cho tan hết. Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S Báo cáo thực hành Trang 5 Chú ý: tổng nước cất dùng ở trên là nước cất đã chuẩn bị ở phần chuẩn bị hoá chất (tuỳ theo môi trường đã kê theo bảng) Hoà trộn các thành phần trên, ta được môi trường cần dùng. Nhanh chóng phân phối môi trường dinh dưỡng vào các ống nghiệm có nút bông đã vô trùng bằng phễu để tránh môi trường bám vào ống nghiệm( lượng môi trường cho vào khoảng 1/3 ống nghiêm- không cho quá nhiều môi truờng) đối với môi trường có CaCO3 thì phân phối vào 3 bình tam giác loại 250ml có nút bông đã vô trùng. Chú ý: môi trường cà chua là môi trường cung cấp khoáng, vitamin, và có độ pH thích hợp với đa số VSV (pH ≈ 6,9 ) nên không cần phải chuẩn pH, còn đối với các môi trường khác như khoai tây tuy dinh dưỡng nhiều hơn nhưng không có độ pH thích hợp nên không được sử dụng nhiều, nếu sử dụng phải chuẩn pH môi trường đến 6,9 * Chuẩn bị nước cất để pha loãng mẫu thí nghiệm: Dùng pipét 10 – 20ml, hút chính xác vào các ống nghiệm đã vô trùng mỗi ống 9ml nước cất. Đậy chặt bằng nút bông không thấm nước Dùng ống đong cho vào 2 bình tam giác loại 250ml có nút bông đã vô trùng mỗi bình 99ml nước cất. * Khử trùng môi trường, làm thạch nghiêng và thạch đĩa: *Phương pháp khử trùng môi trường: Sử dụng nồi hấp áp lực cao, cách tiến hành như sau: − Bật công tắc nguồn nồi hấp − Mở nắp nồi cho nước vào nồi hấp đến mức quy định ( ngang thanh ngang dưới đáy nồi là được) − Xếp các dụng cụ chứa môi trường vào giỏ và đưa vào nồi hấp. − Đóng chặt nắp nồi hấp. − Gạt cần sang chế độ Lock. − Cài đặt chế độ hấp khử trùng ở mode 2( 1210C trong 25phút) − Để nồi tự động, khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 600 có thể lấy môi trường ra làm thạch nghiêng hoặc thạch đứng chờ thạch nguội cho vào tủ ấm bảo quản để sử dụng dần − Các ống nghiệm chứa môi trường đặc thì được làm thạch nghiêng để cấy chuyền và bảo quản giống. *Cách làm thạch nghiêng: Các ống nghiệm được khử trùng xong được đặt ở tư thế nghiêng góc sao cho mặt nghiêng và phần thạch sâu dạt yêu cầu Có thể dùng các pipét lớn nhỏ khác nhau đặt trên mặt phẳng bàn để làm bề mặt nghiêng tuỳ theo lượng môi trường trong ống nghiêm nhiều hay ít. Để yên cho đến khi môi trường đặc lại, bề mặt thạch nghiêng phải nhẵn, phẳng, không gồ ghề và liên tục, thạch không được dính nút bông. Đối với môi trường thạch đứng thì ống nghiệm sau khi lấy ra khỏi nồi hấp, dựng thẳng đứng cho đến khi thạch đông cứng là đượcoảmoi trường khoảng 1/3 ống nghiệm) Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S PHÂN LẬP GIỐNG VI KHUẨN LACTIC: Mẫu: nem chua ™ Chuẩn bị mẫu: Nem chua bóc vỏ, chỉ lấy phần không có ớt , tỏi hay tiêu, vì những loại này có chứa các chất kháng sinh thực vật( như fitoxit có trong tỏi chẳng hạn) sẽ ảnh hưởng có thể gây ức chế VSV cần phần lập. Cân 1g nem trên cho vào cối sứ, nghiền mịn, càng mịn càng tốt. ™ Pha loãng mẫu thập phân: Qúa trình pha loãng mẫu được tiến hành trong tủ cấy vô trùng, Thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn, trong điều kiện vô trùng. -Chuẩn bị các dụng cụ cho vào tủ cấy: Đèn cồn Đĩa petri, Pipet Ống nghiệm chứa môi trường và ống nghiệm chứa nước cất đã thanh trùng kỹ. Giá ống nghiệm, Bình tam giác -Bật đèn tử ngoại trong tủ cấy cấy vô trùng khoảng 30-60 phút( thao tác này lặp lại trước mỗi lần cấy chuyền). Nhớ che chắn cẩn thận vì tia tử ngoại rất có hại. -Sau khi tắt đèn tử ngoại, bật quạt gió, một lúc sau mới tiến hành cấy. Cho toàn bộ nem trong cối vào ống nghiệm đầu tiên (chứa 9ml nước cất đã chuẩn bị trên) lắc nhẹ ống nghiệm bằng cách một tay cầm nghiêng ống nghiệm, lắc nhẹ đáy ống lên lòng bàn tay kia, khoảng 2-3 phút cho đều, ta được mẫu pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng mẫu ở các nồng độ tiếp theo 10-2 , 10-3, 10-4, 10-5, 10-6- dựa vào sơ đồ dưới: Dùng pipet loại 1ml hút 1ml mẫu ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm chứa nước cất vô trùng thứ hai, . Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên rồi thổi xuống 3-5 lần nhờ bóp cao su gắn trên đầu pipet., ta có độ pha loãng 10-2 -Tiếp tục thao tác tương tự để có các độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 Báo cáo thực hành Trang 6 Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S Báo cáo thực hành Trang 7 ™ Cách gieo cấy mẫu để tách khuẩn lạc vi khuẩn: Phương pháp tạo hộp đổ: -Lấy các ống nghiệm có độ pha loãng 10-3, 10-5, 10-6, mỗi ống lấy 1ml, (dùng pipet 1ml) cho lên bề mặt đĩa petri, Tương ứng với mỗi độ pha loãng sẽ thực hiện trên 3 đĩa petri. -Việc phân phối mẫu và môi trường vào đĩa petri phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. -Đĩa petri phải hoàn toàn vô khuẩn -Tiến hành song song với các kỹ thuật vô trùng -Dùng thạch trơ đã chuẩn bị trong bình tam giác (sau khi đã đun nóng, làm nguội đến khoảng 500C) rót trực tiếp môi trường phân lập( môi trường có CaCO3 ) ra đĩa petri vừa cấy mẫu xong, đổ một lớp mỏng vừa phải, để cho bề mặt thạch thật khô. -Lưu ý nắp đĩa chỉ được mở 1 phần khi cho môi trường vào đĩa. -Đậy nắp lại, xoay đĩa tròn theo1 hướng nhẹ nhàng để tránh môi trường dấy lên thành và nắp đĩa, đồng thời cũng nhằm phân bố vi sinh vật đều trong môi trường về sau sẽ dễ quan sát, tách khuẩn lạc. -Để yên cho đến khi môi trường nguội và đặc lại. -Dùng giấy báo gói các đĩa petri thật kỹ, ghi đầy đủ tên mẫu, độ pha loãng, ngày cấyrồi đem lật ngược nuôi trong tủ ấm ở 37oC, sau khoảng 24-48 giờ. TUYỂN CHỌN, CẤY CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN GIỐNG VI KHUẨN LACTIC. ™ 1.Mục tiêu Tuyển chọn giống vi khuẩn lactic có hoạt lực mạnh Cấy chuyền và bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng ™ 2.Tuyển chọn và cấy chuyền giống vi khuẩn lactic: *Tuyển chọn: Sau khi nuôi trong tủ ấm 24-48 giờ thì các khuẩn lạc xuất hiện. Môi trường cà chua đã dùng là môi trường tập trung nên có thể có khuẩn lạc của cả vi khuẩn lactic lẩn khuẩn lạc của những loài vi khuẩn khác, như acêtic(hình giọt-núi lứa-nhăn nheo), hay của nấm mốc Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic là khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO3 , hình giọt, hoặc hình dẹt, trơn nhẵn, màu trắng đục. Tiến hành tuyển chọn các khuẩn lạc mọc tách biệt và có vòng phân giải CaCO3 lớn để cấy chuyền vào các ống nghiệm thạch nghiêng, hay các đĩa petri nhằm để cho các thí nghiệm tiếp theo. Nhận xét chủng lactic phân lập từ nem có hoạt lực mạnh hơn chủng lactic phân lập từ mẫu giá, sữa chua và nước dưa cải. Do ở các đĩa mẫu nem khuẩn làc lactic mọc nhiều ngay cả ở dộ pha loãng 10-6-, các khuẩn lạc mọc to, vòng phân giải CaCO3 lớn, môi trường hầu như trong suốt ở đĩa petri có độ pha loãng 10-3 *Cấy chuyền giống sang ống nghiệm thạch nghiêng: Chuẩn bị các dụng cụ bỏ vào tủ cấy: ƒ Đèn cồn ƒ Đĩa petri, Pipet ƒ Ống nghiệm chứa môi trường và ống nghiệm chứa nước cất đã thanh trùng kỹ. ƒ Giá ống nghiệm, Bình tam giác Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S -Bật đèn tử ngoại trong tủ cấy cấy vô trùng khoảng 30-60 phút( thao tác này lặp lại trước mỗi lần cấy chuyền). Nhớ che chắn cẩn thận vì tia tử ngoại rất có hại. Sau khi tắt đèn tử ngoại, bật quạt gió, một lúc sau mới tiến hành cấy. -Sát trùng tay kỹ với cồn trước khi vào cấy -Đốt đỏ que cấy trên ngọn lửa đền cồn. Dùng tay trái hé mở nắp đĩa petri vừa đủ cho que cấy vào, tay phải cầm que cấy chạm vào bề mặt thạch cho nguội đi và lấy một ít giống trên vòng que cấy. Đậy nắp đĩa petri lại. Tay trái cầm ống nghiệm thạch nghiêng, tay phải mở nút bông bằng các kẻ ngón tay và hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đền cồn, đưa que cấy có giống vào tận đáy ống nghiệm. Nhẹ nhàng để đầu que cấy tiếp xúc với bề mặt thạch rồi đưa từ dưới lên trên theo đường zích zắc hoặc cấy theo đường vệt thẳng. Thao tác phải nhanh, chính xác, chú ý trong suốt quá trình cấy luôn luôn để ống nghiệm nghiêng 1 góc khoảng 450 để tránh các vi sinh vật khác rơi vào ống nghiệm. Các thao tác thực hiện trước ngọn lửa đèn cồn Hơ lại miệng ống nghiệm và nút bông trên ngọn lửa đèn cồn. Ghi tên mẫu, ngày cấy chuyền, nhóm thực hiện trên giấy bao gói nút bông của ống nghiệm. Chuyển các ống nghiệm vào nuôi trong tủ ấm 370C, sau 24-48 giờ giống phát triển và đem bảo quản trong tủ lanh hoặc để trong tủ ấm đến lần thí nghiệm tiếp theo nếu thời gian ngắn. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH LÝ, SINH HOÁ CỦA VI KHUẨN . 1.Mục đích: Làm tiêu bản giọt ép vi sinh vật. Nhuộm Gram, phân biệt tế bào gram âm, gram dương. Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng lactic đã phân lập. 2.Quan sát đặc điểm hình thái: 2.1 Tiêu bản giọt ép: Dùng que cấy hoặc pipet vô trùng lấy 1 lượng nhỏ tế bào vi khuẩn trong ống giống để làm vết bôi. Làm vết bôi trên hiến kính: Cho giọt dịch chứa vi khuẩn trên đầu que cấy lên mặt của 1 phiến kính sạch, nếu vi khuẩn ở trạng thái sinh khối phải hoà sinh khối này với 1 giọt nước cất vô khuẩn để tạo được huyền phù. Đặt lá kính lên giọt huyền phù vi khuẩn sao cho không tạo bọt khí Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi điện tử. 2.2 Nhuôm Gram: ™ Nguyên tắc: Khi nhuôm Gram, vi khuẩn Gram dương có lớp vỏ dày tạo bởi peptidoglican sẽ giữ được phức chất tạo thành giữa tím gentian và iot có màu tím cộng thêm màu thuốc nhuôm bổ sung sẽ có màu tím hồng. Vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ mỏng hơn, không giữ được phức chất nên sẽ chỉ có màu hồng của thuốc nhuộm bổ sung. Báo cáo thực hành Trang 8 Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S Báo cáo thực hành Trang 9 ™ Hoá chất: -Dung dịch a: Tím gentian 1g Rượu etylic96% 10ml -Dung dịch b: Phenol đã tinh chế lại 5g Nước cất 100ml Trộn 2 dung dịch a và b với nhau -Dịch lugol: KI 2g Iot tinh thể 1g Hoà 2g KI vào 5ml nước cất, sau đó cho thêm 1g iot, chờ cho iot tan hết mới thêm nước cho đủ 300ml. -Thuốc nhuộm :lấy 1ml thuốc nhuộm fuchsin trộn với 9ml nước cất ™ Tiến hành: ¾ Chuẩn bị mẫu: Lấy 1 ống giống vi khuẩn lactic đã có sinh khối tương đối nhiều, lấy 1 ít nước cất cho vào ống, lắc đều tay cho tế bào vsv hoà vào nước, pha loãng mẫu tuỳ theo lượng sinh khối trong ống nghiệm sao cho khi làm tiêu bản tế bào vsv không quá nhiều. Dùng đũa thuỷ tinh lấy 1 giọt vsv đã pha loãng dàn đều trên phiến kính tạo vết bôi, chiều dày vết bôi không nên vượt quá chiều dày của 1 tb vi khuẩn. Cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn., tránh vết bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa. Nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên vết bôi vsv, giữ khoảng 1-2 phút. Đổ thuốc nhuộm thừa trên phiến kính đi, có thể rửa bằng nước cất, nhỏ dịch lugol lên vết bôi giữ từ 1,5-2 phút, (hoặc có thể quan sát khi vết gentian bi bong ra khỏi phiến kính nổi lên trên dịch lugol )rồi đổ đi. Dùng cồn rửa bản mẫu trong khoảng 30s, rửa quá lâu có thể làm tế bào vsv biến dạng, khó quan sát. Rửa tiêu bản lại bằng nước cất sau đó làm khô trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ thuốc nhuộm bổ sung (fuchsin)lên chỗ vết bôi và giữ khoảng 2 phút. Rửa nước sau đó đợi khô, đem quan sát dưới kín hiển vi. Tế bào gram dương bắt màu tím và gram âm bắt màu tím hồng. 2.1.Kết quả: Các tế bào vi khuẩn lactic có màu tím hồng đậm, có hình que, hình hạt đậu, có những tế bào đang phân chía, nhưng hầu hét đều có thành tế bào màu Tím hồng Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S 3.Xác định các đặc điểm sinh lý,sinh hoá: 3.1Hoạt tính catalaza: Hoạt tính catalaza là đặc điểm đặc trưng của đa số các vsv hiếu khí, vsv kị khí bắt buộc và nhiều loại vsv ưa khí không sinh catalaza. Catalaza phân huỷ H2O2 thành O2 và nước: H2O2 →H1O2 +O2 Nhỏ 1 giọt oxy già (H2O2 10%) lên trên khuẩn lạc vi khuẩn lactic, dùng khuẩn lạc ở các đĩa petri nuôi cấy thí nghiệm trước. Kết quả: Có nhiều bọt khí trong giọt ỗy già phí trên khuẩn lạc làm giọt dịch như có màu trắng, chứng tơ vi khuẩn lactic có enzym catalaza trong tế bào vk lactic. 3.2. Quan hệ với ôxy: Dùng môi trường thạch đứng cấy vk lactic vào bằng cách cấy, quy trình tương tự như thạch nghiêng nhưng dùng que cấy đầu nhọn cấy theo kiểu chích sâu trên thạch đứng, đưa que cấy sát thành ống nghiệm nhưng chú ý không để dính thành ống, đưa que cấy thọc sâu xuống thạch phần sát thành ống nghiệm xuống sâu dưới đáy ống nghiệm, lần lượt thọc ở 4 vị trí dối xứng quanh ống thạch. *Kết quả: Sau 2 ngày, sinh khối vsv xuất hiện trên các đường cấy dưới dạng là những vệt trắng, từ trên bề mặt thạch xuống dưới đáy ống nghiệm dọc theo cả chiều dày môi trường, chứng tỏ lactic là vsv kỵ khí không bắt buộc. Báo cáo thực hành Trang 10 Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S ỨNG DỤNG LÊN MEN LACTIC TRONG QUÁ TRÌNH MUỐI CHUA DƯA CẢI: ¾ Vật liệu hoá chất: -Dưa cải bẹ. -NaCl -Đường -Dung dịch KmnO4 2% -Dung dịch H2SO4 10% -Dung dịch AgNO3 trong amoniac ¾ Các bước tiến hành: *Quy trình nhân giống: Giống gốc: 8 ống nghiệm. Giống cấp1: 4 bình tam giác 250ml +Thành phần môi trường nhân giống cấp 1: Môi trường rau cải Nước rau cải: 1000ml Đường kính: 20g Cải muỗng cắt nhỏ, cân 300g cho vào 1 lít nước, đun sôi, lọc lấy nước trong, có thể lọc bằng bông thấm nước. Sau đó bổ sung thêm nước đến 1000ml. Phân môi trường vào 4 bình tam giác 250ml, cấy vào mỗi bình 2 ống giống gốc. Sau đó nuôi trong tủ ấm 370C trong 48 giờ. *Muối chua dưa cải: Dưa cải bẹ rửa sạch, để héo, cắt khúc. Có thể làm chua nhanh bằng cách sử dụng dịch dưa cải lần trước. Cải bẹ: 1Kg. Pha 1000ml dung dịch nước muôi với thành phần : ƒ NaCl: 30g ƒ Đường kính 10g Xếp các khúc cải vào thẩu nhựa và ếm chặt Báo cáo thực hành Trang 11 Đổ từ từ dung dịch nước muối vào thẫu đến ngập cải. Lên men ở nhiệt độ phòng từ 2-3 ngày. *Định lượng acit lactic: Dùng dung dịch NaOH 0,1 với chất chỉ thị phenolphtalein 1%. Cho vào bình tam giác dung tích 100ml: 10ml dịch lên men vi khuẩn (nước dưa cải) thêm vào 2-3 giọt phenolphtalein 1%.và 20ml nước cất trung tính. chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi xuát hiện màu hồng nhạt bền vững. Ghi thể tích NaOH tiêu tốn V Thực hiện mẫu đối chứng là nước cất. Ghi thẻ tích NaOH tiêu tốn là Vo Kết quả: Tính kết quả theo công thức: 9,0)( 10 90)( ×−=×−=∑ VoVVoVa Kết quả thu được: V=6,5; Vo= 0,01 Thay số vào ta được hàm lượng acid tổng số lgVoVa /84,59,0)01,05,6(9,0)( =×−=×−=∑ Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S ỨNG DỤNG LÊN MEN LACTIC TRONG SẢN XUẤT SỮA CHUA Sơ đồ quy trinh : Báo cáo thực hành Trang 12 Sản xuất sữa chua quy mô gia đinh, dùng giống là sữa chua Sữa đặc được pha loãng theo tỷ lệ: 1 sữa:3 nước Cho 3 lon nước đun sôi vào chậu, cho sữa vào, khuấy đều, để cho sữa hơi nguội khoảng 45-50oC, cho giống là 1 hộp sữa chua vào, khuấy đều., phân phối vào hũ nhựa, nuôi ở nhiệt độ phòng, khoảng 10-12h ta có sản phẩm sữa chua ăn liền, sẽ ngon hơn khi ăn lạnh. Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT ™ Định lượng trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu (Goriaoep) Buồng đếm hồng cầu Gôriaep có tất cả 25 ô lớn, trong mỗi ô lớn lại có 16 ô nhỏ, diện tích mỗi ô nhỏ= 1/400m2 ¾ Chuẩn bị mẫu: Pha loãng mẫu nấm men tới 10-2 Lau lá kính thật sạch bằng 1 miếng bông thấm nước có tẩm ít cồn Lấy 1 miếng bông có thấm nước chùi sơ 2 khe của buồng đếm, để phiến kính dễ dính. Cho 1 ít dịch tế bào lên lá kính, dậy lá kính lên giữa 2 khe trên buồng đếm, sao cho không có bọt khí ở khu vực buồng đếm, lấy bông thấm dịch hoặc nước 2 bên buồng đếm nếu có. Đưa buồng đếm đặt lên khay kính hiển vi, quan sát ở vật kính x40, chỉnh vi ốc và ánh sáng để thấy rõ. Tế bào nấm men hiện lên trong buồng đếm hình cầu trong, sáng có màng tế bào bao quanh, nguyên sinh chất trong suốt. Có tế bào riêng biệt có tê bào đang nảy chồi đang còn dính với nhau Tiến hành đếm tế bào ở 9 ô theo 2 đường chéo của buồng đếm hình vuông. Quan sát ở vật kính x40 thì một ô lớn chiếm hầu hết diện tích vi trường nên rất khó xác định ô đếm, ta phải xác định ô đầu tiên là 1 trong 4 ô ở các góc, sau đó mới đi xác định các ô tiếp theo kề nó. f 7 6 1 2 3 4 5 8 9 ¾ Kết quả- xử lý kết quả: Số tế bào được tính theo công thức: Trong đó: a: số tế bào trên 5 ô lớn, a= 22 b: độ pha loãng mẫu , b= 10-2 c: số ô nhỏ có trong 5 ô lớn đã chọn , c=16x5=80 Vậy: mltbX /1100010004000 80 1022 2 =×××= − 10004000/ ×××= c baX mlTB ™ Định lượng gián tiếp – phương pháp MNP: Đếm khuẩn lạc, chỉ đếm được tế bào sống nên sai số rất lớn Báo cáo thực hành Trang 13 Báo cáo thực hành SVTH: Phan Thị Thảo Hiếu Môn: Công nghệ vi sinh Lớp: 06S Báo cáo thực hành Trang 14