Báo cáo Đề tài Nghiên cứu chiết tách cao neem từ lá cây neem ấn độ bằng các hệ dung môi khác nhau và bước đầu nghiên cứu ứng dụng trong thuốc bảo vệ thực vật

flavonoid. Có một số phương pháp khác nhau để thực hiện quá trình này, chủ yếu dựa trên kỹ thuật chiết lỏng lỏng hoặc kỹ thuật chiết pha rắn (SPE: solid phase extraction). Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị nhưng có nhược điểm là hiệu quả thu hồi thấp, dễ gây sai số, tốn thời gian và dung môi. Ngày nay, SPE được sử dụng phổ biến vì tốn ít thời gian, cho kết quả nhanh, tiện lợi, hiệu quả về mặt kinh tế và có thể hoàn toàn tự động.[24] 1.8. Hoạt tính kháng oxi hóa của cao Neem [21] Một phương pháp xác định lực kháng oxy hoá tổng (total antioxydant capacity) khác dựa theo mô hình phospho molybdenum bằng phép đo quang phổ trên cơ sở việc khử Mo (VI) thành Mo (V) bằng chất phân tích mẫu và sự hình thành tiếp theo của phức chất atacidic photphat/Mo (V) màu xanh lá cây. Phương pháp này đã được tối ưu hóa và đặc trưng theo khoảng cách tuyến tính, độ lặp lại và độ tái lập và hệ số hấp thụ mol để định lượng một số chất chống oxy hóa. Phương pháp này phù hợp với quy mô và thiết bị của phòng thí nghiệm trường Đại Học Bà Rịa Vũng Tàu nên chúng tôi quyết định sử dụng phương pháp này để xác định lực kháng oxy hóa của cao Neem. 1.9. Một số phương pháp định tính, định lượng cao Neem 1.9.1. Phương pháp định tính bằng các phản ứng và thuốc thử 1.9.1.2. Định tính Steroid – triterpenoid Đặc điểm: Steroid là những alcol thể rắn được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, cấu trúc tổng quát vòng cyclopentanopentanoperhyrophenantren hoặc một vài trường hợp hiếm gặp là dạng biến đổi của hệ thống vòng nói trên. Steroid có nguồn gốc sinh tổng hợp như triterpen với chất liệu cơ bản là pharnesyl pyrophosphat. Sterol thuộc nhóm steroid, phân bố rộng rãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặc saponinsteroid. Chúng có nguồn gốc động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, β – sitosterol, ergosterol, stigmasterol,). Sterol có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu dưới dạng tự do hoặc các ester. Sterol là chất không phân Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 26 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu béo, carotene. Tan nhiều trong các dung môi không phân cực như petroleum ether, benzen, chloroform, nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol. Sản phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp các ester sterol kết hợp vớ i lipid, carotene, lecitin. Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn. Một số thuốc thử nhận biết Steroid – triterpenoid: - Thuốc thử Liebermann – Burchard: - Anhidrid acetic 1 ml - H2SO4 đậm đặc Nếu xuất hiện màu lục, hồng, cam hoặc đỏ và bền là phản ứng dương tính. Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc, nếu xuất hiện màu đỏ đậm, xanh, xanh tím là phản ứng dương tính. Phản ứng Rosenthaler để phát hiện Steroid – triterpenoid: - Vanilin 1% ethanol 2 giọt, 10 ml nước cất. - Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất. Nếu có Alkaloid sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt. 1.9.1.3. Định tính Alkaloid Đặc điểm: Alkaloid là những hợp chất hữu cơ chứa dị vòng nitơ, có tính base, thường gặp ở nhiều loại thực vật, đôi khi còn tìm thấy trong một số loài động vật. Alkaloid tồn tại ở hai trạng thái rắn và lỏng. Đa số chúng không tan trong nước (trừ nicotin và coniine), hầu hết tan trong dung môi hữu cơ như benzen, ether, chloroform, Các alkaloid đa số không mùi và có vị đắng, một số ít có vị cay (piperine). Đặc biệt alkaloid có hoạt tính sinh lý cao đối với cơ thể người và động vật, nhất là đối với hệ thống thần kinh. Với một lượng nhỏ, alkaloid có thể là chất độc gây chết người (như thuốc phiện, heroin), nhưng nó có khi lại là thần dược trị bệnh đặc hiệu hay thành phần quan trọng trong một số thực phẩm (như cacao, cà phê,). Alkaloid có chứa lưu huỳnh thường có độc tính rất mạnh, có nhiều trong các loại nấm độc. Một số thuốc thử Alkaloid: Thuốc thử Mayer: Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 27 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu - Dung dịch 1: Hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 mL nước cất. - Dung dịch 2: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml nước cất. - Hỗn hợp hai dung dịch và thêm đủ 100 ml nước cất. Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa trắng hoặc vàng nhạt. Thuốc thử Wagner: - I2 1,27g - KI 2 g - H2O vừa đủ 100 ml Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu. 1.9.1.4. Định tính Flavonoid Đặc điểm: Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên rất nhiều màu cho rau, quả, hoa,... Phần lớn chúng có màu vàng, một số ít có màu xanh, tím, đỏ hay không màu. Một số alkaloid tan trong nước, rượu, acid vô cơ loãng và base băng. Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 diphenylpropan, gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một dây 3 carbon, nên thường gọi là C6-C3-C6. Nếu dây C3 đóng thì đánh số bắt đầu từ dị vòng với dị nguyên tố oxygen mang số 1, rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B đánh số phụ. Nếu dây C3 hở, đánh số chính trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A. Một số thuốc thử Flavnoid: Với dung dịch FeCl3 bão hòa: Nếu tạo thành dung dịch màu xanh đen là phản ứng dương tính. Với dung dịch H2SO4 đậm đặc: Xuất hiện màu vàng đậm đến cam hoặc đỏ đến xanh dương, tùy vào loại hợp chất khác nhau mà có màu khác nhau. 1.9.1.5. Định tính saponin Định tính khả năng tạo bọt của saponin trong môi trường acid, base: Thuốc thử: - HCl 0,1N - NaOH 0,1N Nếu ống pH = 13 cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, có thể có saponin steroid. Dựa vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 28 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu Cơ sở phương pháp: Chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao 1 cm khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện quy định. Cách tiến hành: Cân 1 g bột nguyên liệu cho vào erlen 500 mL chứa sẵn 100 mL nước sôi. Tiếp tục cho nước trong erlen sôi thêm 30 phút nữa. Lọc, để nguội, thêm nước cất đến 100 mL. Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, đường kính 16 mm. Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mL dịch lọc. Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10 mL. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây. Mỗi giây 2 lần. Để yên 15 phút, sau đó đo xác định ống nghiệm có chiều cao 1 cm. Chỉ số tạo bọt được tính theo công thức: CSB = 100 × 10 𝑖 Trong đó: CSB: Chỉ số tạo bọt i: Ống nhiệm thứ i có bọt cao trên 1 cm Nếu cột bọt trong các ống nghiệm thấp dưới 1 cm (tức chỉ số tạo bọt dưới 100) thì coi như không có saponin. 1.9.1.6. Định tính Cacbonhyđrat Lấy 2 ml dịch chiết được xử lý bằng 2 giọt dung dịch α – Naphthol có cồn trong ống nghiệm và sau đó 1 ml axit sunfuric đậm đặc được thêm cẩn thận dọc theo hai bên thành ống nghiệm. Nếu lớp giữa xuất hiện màu tím cho thấy có sự hiện diện của Cacbonhyđrat. 1.9.2. Phương pháp phân tích trọng lượng Phương pháp phân tích trọng lượng là phương pháp phân tích định lượng dựa vào kết quả cân của khối lượng một chất tinh khiết hay ở dạng đơn chất có trong mẫu cần phân tích. Quá trình phân tích một chất theo phương pháp trọng lượng bao gồm các giai đoạn sau: - Chọn mẫu và gia công mẫu. - Tách trực tiếp chất cần xác định hoặc các hợp phần của nó khỏi sản phẩm phân tích dưới trạng thái tinh khiết hóa học. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp việc làm này rất khó khăn, nhiều khi không thực hiện được, do đó chất cần xác định Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 29 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu thường được tách ra thành kết tủa dưới dạng hợp chất có thành phần xác định. Để làm điều đó ta thực hiện như sau: đưa mẫu vào dung dịch (phá mẫu) và tìm cách tách chất nghiên cứu khỏi dung dịch. - Xử lý sản phẩm đã tách bằng biện pháp thích hợp (rửa, nung, sấy,) rồi đem cân để tính kết quả. - Mặc dù phải thực hiện với thời gian dài nhưng phương pháp này có độ chính xác cao nên được dùng để xác định hàm lượng các chất như kim loại, phi kim, thành phần của quặng, silicat, hợp chất hữu cơ, 1.9.3. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Bản chất GC – MS là sự kết hợp của sắc ký khí và khối phổ. Sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích. Thành phần hỗn hợp trong pha động tương tác với pha tĩnh theo một tỷ lệ khác nhau. Hợp chất tương tác nhanh sẽ thoát ra khỏi cột trước và hợp chất tương tác chậm sẽ ra khỏi cột sau. Đó là đặc trưng cơ bản của pha động và pha tĩnh. Quá trình chia tách có thể xảy ra bởi sự thay đổi nhiệt độ của pha tĩnh hoặc là áp suất của pha động. Khối phổ (MS) là phương pháp nghiên cứu các chất, bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử chất đó, dựa trên điện tích của ion, dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế. Ưu điểm của GC – MS là chỉ cần một lượng mẫu nhỏ 1 – 5 µ với ngưỡng phát hiện của là 1 picogram, kết quả thu được rất nhanh chóng (chỉ từ 1 – 100 phút). Vì vậy được ứng dụng để phân tách, định lượng, nhận dạng các chất. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống ở cửa này. Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 300c để mẫu trở thành dạng khí. Vỏ ngoài (oven): phần vỏ của hệ thống GC chính là lò nung đặc biệt. nhiệt độ của lò này dao động từ 40 – 320 oC. Cột (cloumn): Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 30 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu - Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này. - Sau đó đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ. ở đây chúng bị ion hóa. Sau khi khối phổ, chúng sẽ tới bộ phận lọc dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra kết qua gọi là khối phổ. Khối phổ là một biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc. Máy tính: bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đưa ra kết quả khối phổ. Ứng dụng của phương pháp sắc ký khí khối phổ Xác định công thức phân tử, dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị xuất hiện trong phổ đồ. Xác định công thức cấu tạo:dựa vào giá trị m/e, cường độ tương đối của các ion phân tử cũng như ion mảng. Định lượng thành phần nguyên tố của ion cần xác định. 1.9.4. Phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC – MS) Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry - MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó. Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-). Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn. Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 31 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ thuật hiện nay cũng đã cho phép tích hợp hai kiểu quét này thành một nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu, tuy nhiên thường độ nhạy không cao bằng từng kiểu quét riêng lẻ. Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng. Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện. Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB), đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập nhiên 80, mới có sự đột phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API). Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (continuous flow - fast atom bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích. Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS: - Ion hóa tia điện (electrospray ionization – ESI). - Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization – APCI). - Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photoionization – APPI). Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả. Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 32 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Địa điểm và nguyên vật liệu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu (cơ sở 3), 951 Bình Giã, phường Rạch Dừa, thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu Nguyên liệu sử dụng để chiết dịch chiết trong nghiên cứu này là lá Neem Ấn Độ được mua tại Công ty thảo dược An Quốc Thái, phường 11, quận Tân Bình, Thành phố Hồ Chí Minh. Hình 2. 1: Lá Neem tươi Hình 2.2: Lá Neem khô 2.1.3. Dụng cụ - thiết bị và hóa chất Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các thiết bị, dụng cụ và hóa chất được liệt kê như sau: 2.1.3.1. Dụng cụ - thiết bị Dụng cụ - Bộ Soxhlet. - Bình cầu 1 cổ, 2 cổ (250ml, 500ml). - Erlen (100ml, 250ml). - Becher (100ml, 250ml, 500ml). - Phiễu chiết (250ml). - Ống đong (5ml, 10ml, 250ml, 500ml). - Nhiệt kế. Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 33 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu - Pipet (2ml, 5ml, 10ml). - Ống nghiệm. - Đĩa petri. - Đũa thủy tinh. - Bình tia. - Gía đỡ ống nghiệm. - Bóp cao su. Thiết bị - Máy chiết cô chân không tuần hoàn. - Bếp điện. - Tủ sấy - Máy xay nguyên liệu - Cân phân tích, cân kĩ thuật. - Máy quang phổ UV - Vis Perkin Elmer. - Máy sắc khí phổ GC/MS. - Máy sắc khí phổ LC/MS. - Nồi hấp khử trùng. 2.1.3.2. Hóa chất - Ethanol 96o, Trung Quốc - Methanol, Trung Quốc - Ethyl Acetate, Trung Quốc - Chloroform, Trung Quốc - Hexan, Trung Quốc - AlCl3 10, Trung Quốc - FeCl3, Trung Quốc - KI, Trung Quốc - NaOH, Trung Quốc - Tween 80, Nhật - Amoniac, Trung Quốc - DMSO, Trung Quốc 2.2. Phương pháp nghiên cứu Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 34 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu 2.2.1. Lý thuyết Để đạt được mục đích đặt ra của đề tài, đề tài nghiên cứu dựa trên các bài báo nghiên cứu khoa học khác, nội dung nghiên cứu như sau: - Tiến hành quan sát, thu nhập những thông tin, dữ liệu liên quan đến cách mô tả hình thái. Dựa trên các tài liệu đó, bước đầu xác định tên khoa học của cây Neem - Tiến hành chiết xuất cao Neem bằng phương pháp chiết Soxhlet và ngâm dầm với các điều kiện khảo sát là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian chiết. - Tiến hành định tính thành phần hóa học chính trong cao Neem dựa trên kết quả các bài nghiên cứu khoa học khác, nghiên cứu phương pháp sắc ký khí khối phổ GC/MS, LC/MS. 2.2.2. Thực nghiệm Lá Neem sau khi mua chúng tôi cắt nhỏ (kích thước 1 x 2 cm), sau đó tiến hành chiết tách dịch chiết bằng hai phương pháp sau: - Ngâm dầm với các điều kiện khảo sát là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian. - Chiết tách bằng Soxhlet với các điều kiện khảo sát là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và thời gian. Sau khi chiết tách theo hai phương pháp trên thì thu được dung dịch chiết, đem dịch chiết đi cô quay chân không đến khi đuổi hết dung môi sẽ thu được sản phẩm ở dạng cao. Gửi mẫu cao Neem đi phân tích GC/MS, LC/MS. Lấy cao Neem thử hoạt tính kháng khuẩn, thử nghiệm trên sâu, định tính, khả năng chống oxi hóa. 2.2.3. Quy trình chiết tách dịch chiết lá Neem Từ các công trình nghiên cứu trước đây chúng tôi tiến hành chiết tách cao lá Neem bằng phương pháp ngâm dầm và phương pháp chiết tách bằng hệ thống soxhlet với các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau. Bảng 2. 1: Độ phân cực và nhiệt độ sôi của các hệ dung môi khác nhau Độ phân cực (δP) Nhiệt độ sôi (oC) Hexan 0.00 69 Chloroform 1.04 61 Ethanol 96o 1.69 79 Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 35 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu Methanol 1.70 65 Ethyyl acetate 1.78 77 Nước 1.80 100 2.2.3.1. Quy trình chiết tách lá Neem bằng phương pháp ngâm dầm Sơ đồ 2. 1: Quy trình chiết cao từ lá Neem bằng phương pháp ngâm dầm Thuyết minh quy trình - Bước 1: Lá Neem cắt nhỏ rồi cân chính xác 15 g (± 0,1g). Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm). - Bước 2: Lấy 300 ml dung môi (Hexan, Chloroform, Ethyl acetate, Ethanol 96o, Methanol, Nước) cho vào bình 1000 ml và ngâm trong 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày. - Bước 3: Lọc và thu được dịch chiết đem cô quay đến khi cạn hết dung môi. Sau đó đem bảo quản cao chiết trong lọ dung tích khoảng 5 – 10 ml, bịt kín bằng nút cao su, bảo quản trong tủ lạnh. - Bước 4: Lấy mẫu cao chiết đi phân tích GC/MS, LC/MS để xác định thành phần Xử lý nguyên liệu Dung môi Thời gian (1, 3, 5, 7 ngày) Tỉ lệ dung môi (1/20) Lá Neem Bột lá Neem Dịch lá Neem Cao lá Neem Nước Methanol Hexan Ethanol 96o Chloroform Ethyl acetat Gửi mẫu phân tích LC/MS – GC/MS Định tính Hoạt tính kháng khuẩn Thử nghiệm trên sâu Khả năng chống oxi hóa Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 36 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu Dung môi chiết Xử lý nguyên liệu hóa học và thử hoạt tính sinh học trên khuẩn Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa. 2.2.3.2. Quy trình chiết xuất lá Neem bằng hệ thống Soxhlet Sơ đồ 2.2: Quy trình chiết cao từ lá Neem bằng Soxhlet Thuyết minh quy trình - Bước 1: Lá Neem cắt nhỏ rồi cân chính xác 15 g (± 0,1g). Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm). - Bước 2: Lấy 300 ml dung môi (Hexan, Chloroform, Ethyl acetate, Ethanol 96o, Methanol, Nước) cho vào bình cầu 2 cổ và lắp hệ thống soxhlet. Đun nguyên liệu trong 4 giờ, 6 giờ, 10 giờ và 12 giờ. - Bước 3: Thu được dịch chiết đem cô quay đến khi cạn hết dung môi. Đem bảo quản cao chiết trong lọ dung tích khoảng 5 – 10 ml, bịt kín bằng nút cao su, bảo quản trong tủ lạnh. - Bước 4: Lấy mẫu cao chiết đi phân tích GC/MS, LC/MS để xác định thành phần Lá Neem Bột lá Neem (15 g) Dịch lá Neem Cao lá Neem Trích ly Thời gian (4, 6, 10, 12 giờ) Tỉ lệ (1/20) Chloroform Nước Hexan Ethyl acetat Methanol Ethanol 96o Gửi mẫu phân tích LC/MS – GC/MS Định tính Hoạt tính kháng khuẩn Thử nghiệm trên sâu Khả năng chống oxi hóa Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 37 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu hóa học và thử hoạt tính sinh học trên khuẩn Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa. 2.3. Mô hình chiết tách thực nghiệm tại phòng thí nghiệm 2.3.1. Ngâm dầm Hình 2.3: Mô hình ngâm dầm 2.3.2. Soxhlet Hình 2.4: Mô hình chiết tách tại phòng thí nghiệm 2.4. Phương pháp cô quay chân không tuần hoàn Quá trình hoạt động của máy cô quay chân không dựa theo nguyên tắc nhiệt độ sôi thay đổi khi thay đổi áp suất. Dựa theo các quá trình nhiệt động, khi giảm áp suất thì Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 38 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu nhiệt độ sôi chất lỏng sẽ giảm (đó là nguyên nhân tại sao nấu nước trên núi cao thì nước nhanh sôi hơn). Khi máy hoạt động, bình chứa mẫu dung dịch sẽ được để ngập trong bể gia nhiệt. Nước trong bể sẽ được gia nhiệt đến nhiệt độ xác định. Bơm chân không sẽ hút không khí ra khỏi bình chứa mẫu làm áp suất trong bình giảm. Khi áp suất giảm, nhiệt độ sôi dung dịch trong bình sẽ giảm, đến khi nhiệt độ sôi thấp hơn nhiệt độ trong bể thì dung dịch sẽ sôi. Trong quá trình hoạt động, bình chứa mẫu dung dịch được quay tròn liên tục nhằm tăng diện tích tiếp xúc giữa dung dịch và nguồn nhiệt, để nhiệt được phân bố đều trong dung dịch, tránh hiện tượng quá nhiệt cục bộ. Hơi dung môi bay ra khỏi bình cầu sẽ được làm lạnh trong hệ thống sinh hàn và thu lại ở bình thu dung môi. Hình 2.5: Thiết bị cô quay chân không tuần hoàn 2.5. Xác định thành phần hóa học từ cao lá Neem bằng phương pháp GC/MS, LC/MS Dịch chiết lá Neem được tiến hành thu hồi dung môi cho tới khi được chất rắn dạng cao. Gửi mẫu rắn này đến VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM, VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC (01 – Mạc Đĩnh Chi – Quận 1 – Tp. Hồ Chí Minh). 2.6. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chiết 2.6.1. Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết Thời gian chiết có vai trò quyết định lượng cao Neem thu hồi. Nếu thời gian quá ngắn thì lượng cao Neem thu được chưa hoàn toàn, ngược lại khi chiết quá lâu vừa tốn Trường Đại học Bà Rịa Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKTHH Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Phạm Thị Kim Hai 39 Hướng dẫn khoa học: ThS Tống Thị Minh Thu thời gian, tổn hao năng lượng và nghiêm trọng hơn là chất lượng cao Neem bị ảnh hưởng. - Các dung môi: Cồn 96o, methanol, ethyl axetate, chloroform, hexan, nước. - Tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 15:1. - Khảo sát các thông số thời gian ngâm 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày. Khảo sát thời gian chiết tách bằng soxhlet 4 giờ, 6 giờ, 10 giờ, 12 giờ. 2.6.2. Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/nguyên liệu Nếu tỉ lệ dung môi/nguyên liệu không phù hợp thì lượng cao Neem thu được chưa hoàn toàn hoặc gây tổn hao năng lượng vì dung môi quá nhiều. Khảo sát các thông số tỉ lệ dung môi/nguyên liệu gồm 10:1; 15:1; 20:1; 25:1. 2.7. Định tính một số hợp chất có trong lá Neem Theo Puri H. S. (1999) trong cây Neem còn chứa các hợp chất khác như: flavonoid, coumarin saponin flavonoglycoside, dihydrochalcon, cacbonhydrat, triterpenoid và steroid, tannin, alkaloid.[39] 2.7.1. Định tính Flavonoid V