Báo cáo Đề tài Nghiên cứu chiết tách hợp chất polyphenol trong lá chè xanh trồng tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu và nghiên cứu ứng dụng trong dược mỹ phẩm

g 6 chủng vi khuẩn nghiên cứu (S. aureus, Y. enterocolica, L. monocytogens, H. alvei, B. cereus và E. coli O157:H7) thì S. aureus tỏ ra nhạy cảm nhất đối với dịch chiết chè đen. 1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly Cacace và mazza [25] đã chỉ ra rằng, hiệu suất trích ly polyphenol được tăng cường khi tăng nhiệt độ trích ly. Nhiệt độ cao làm giảm độ nhớt của dung môi, tăng tính bán thấm của thành tế bào, tăng độ hòa tan và hệ số khuếch tán của chất cần chất ly. Do đó có thể cải thiện được năng suất chiết [32]. Tuy vậy, polyphenol rất không ổn định và bị phá hủy ở nhiệt độ cao.[37] Perva- Uzunalic và cộng sự [55] đã chỉ ra rằng, hiệu suất chiết tách catechin chè với nước đã giảm khi tăng nhiệt độ chiết từ 80 lên 950C. Thời gian chiết thích hợp với hai mức nhiệt độ trên là 20 phút và 10 phút tương ứng. Ngoài ra, quá trình oxi hóa và epimer hóa các catechin chè cũng diễn ra ở nhiệt độ trích ly cao.[36] Điều này cho thấy, yếu tố nhiệt độ không những ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol chiết tách được mà còn ảnh hưởng đến thành phần polyphenol và có thể cả hoạt tính sinh học của nước chiết. Nhìn chung trong trích ly polyphenol, nhiệt độ trích ly thường phải giới hạn dưới nhiệt độ sôi của dung môi (hữu cơ) còn trong trích ly bằng nước, nhiệt độ khuyến cáo thường nằm trong khoảng 80 - 950C.[55][62] 1.4.3. Ảnh hưởng của thời gian trích ly Đây là một trong các yếu tố không những ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi polyphenol mà còn ảnh hưởng đến chất lượng của dịch chiết và hiệu quả kinh tế của quá trình. Thời gian trích ly ngắn sẽ làm giảm hiệu suất, ngược lại nếu thời gian quá dài sẽ gây tốn kém và có thể làm tăng nguy cơ oxi hóa các hợp chất polyphenol.[50] Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 31 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Perva-Uzunalic và cộng sự [55] cũng chỉ ra rằng, với dung môi nước, hiệu suất thu hồi catecchin chè giảm mạnh khi kéo dài thời gian chiết quá 20 phút ở nhiệt độ 80 0 C và quá 10 phút ở 95 0C. Ngược lại, trong dung dịch ethanol 40% được acid hóa bằng 2% phosphoric acid, Choung và Lee [29] không nhận thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hiệu suất chiết tách catechin tổng số cũng như EGCG trong thời gian từ 0,5 h đến 24 h (chiết ở 25 0C). Ngoài ra, Labbé và cộng sự [43] còn cho thấy, cặp nhiệt độ và thời gian trích ly có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất tách các catechin thành phần. Cụ thể, nhiệt độ 500C trong 20 - 40 phút cho kết quả tốt nhất để thu hồi EGC và EC, 90 0C trong 80 phút là tối ưu với nhóm C, EGCG, GCG và ECG và để trích ly cafein, nhiệt độ 70 – 80 0C trong 20 - 40 phút là thích hợp hơn cả. 1.4.4. Ảnh hưởng của pH Việc acid hóa dung môi chiết có thể có tác dụng đến độ ổn định của các hợp chất phenol như anthocyanin,[61] ảnh hưởng đến độ hòa tan của các polyme có thể thủy phân như lignin, hydroxycinnamic và procyanidin.[50] Bên cạnh đó nó cũng có thể làm yếu cấu trúc thành tế bào, từ đó giúp quá trình hòa tan các hợp chất phenol được dễ dàng hơn. Ngoài ra, do polyphenol là các hợp chất khử mạnh nên trong môi trường acid thấp nó sẽ được bảo vệ tốt hơn. Tuy nhiên, Malgorzata và cộng sự [48] lại kết luận, hoạt tính kháng oxi hóa của cả 7 catechin chè xanh đều tăng cùng với sự tăng pH của môi trường (khoảng khảo sát pH từ 2 đến 10) và hoạt tính này của các catechin ở dạng ester gallate cao hơn dạng không có nhóm galloyl. 1.4.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cũng ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi polyphenol. Tỷ lệ này càng cao tức nồng độ chất cần trích ly trên bề mặt pha rắn càng thấp. Do đó, chênh lệch gradient nồng độ giữa bên trong và bề mặt vật liệu rắn càng cao và làm tăng sự khuếch tán của chất tan từ vật liệu ra môi trường hay làm tăng hiệu suất trích ly. Tuy vậy, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu cao sẽ gây tốn kém và gây khó khăn cho quá trình tinh chế về sau. Trong trích ly các hợp chất polyphenol, các nghiên cứu thường được tiến hành ở tỷ lệ nguyên liệu/dung môi từ 1/10 đến 1/60.[37][65] Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 32 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé 1.4.6. Quy trình trích ly polyphenol từ chè xanh Nguyên tắc cơ bản là sử dụng dung môi hòa tan tốt polyphenol nhưng ít hòa tan các chất khác không mong muốn như chất màu, protein, chất sáp Nhìn chung, quy trình này gồm 4 công đoạn chính: - Sử dụng dung môi/nước trích ly polyphenol từ nguyên liệu chè đã được nghiền nhỏ. - Loại bỏ chất màu, cafeinbằng các dung môi thích hợp (chloroform, dichloromethan). - Chuyển pha ethyl acetate để thu hồi catechin. - Đuổi dung môi ethyl acetate và sấy đông khô để thu hồi bột polyphenol. Row và Jin [108] đã đề xuất quy trình sản xuất bột polyphenol chè xanh. Sơ đồ 1. 2: Quy trình tinh chế polyphenol Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 33 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé 1.5. Giới thiệu một số loài vi khuẩn và các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 1.5.1.Giới thiệu một số loài vi khuẩn Chúng tôi nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn ở các nồng độ khác nhau (100; 200; 400; 800 mg/ml) chống lại 5 chủng vi khuẩn gây bệnh bao gồm ba chủng Gram âm (Escherichia coli (E.coli) – ATCC 43895, Salmonella typhi - ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027); và hai chủng Gram dương (Staphylococus aureus - ATCC 6538, Bacillus cereus - VTCC 1005). 1.5.1.1. Escherichia coli Theodor Escherich là người đầu tiên phát hiện ra loài vi khuẩn này trong quá trình điều trị và nghiên cứu về các trẻ bị bệnh tiêu chảy vào năm 1885. Vì loài này kí sinh trong ruột già (tiếng Latinh là colum), nên ông đặt tên nó là Bacterium coli (vi khuẩn coli). Ông báo cáo phát hiện này vào năm 1885, trong thuyết trình của mình nhan đề “Vi khuẩn đường ruột ở trẻ sơ sinh” cho Hiệp hội Hình thái và Sinh lý học. Đến năm 1886, sau 18 tháng nghiên cứu, ông cho xuất bản cuốn sách với tựa đề "Darmbakterien des Säuglings und ihre Beziehungen zur Physiologie der Verdauung". Phân loại khoa học: Giới (Kingdom): Bacteria Ngành (Division): Proteobacteria Lớp (Class): Gammaproteobacteria Bộ (Order): Enterobacteriales Họ (Family): Enterobacteriaceae Giống (Genus): Escherichia Loài (Species): E.coli Escherichia coli là một loại vi khuẩn Gram âm, kỵ khí không bắt buộc, vi khuẩn có hình roi thường tìm thấy bên trong phần dưới của ruột của các động vật máu nóng. Chúng thường không gây bệnh, nhưng một số chủng có thể gây nên tiêu chảy và nhiễm trùng sinh mủ. Các chủng gây bệnh được phân loại bởi cơ chế sinh bệnh đặc biệt như các độ tố chẳng hạn. Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 34 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Hình 1. 8: Vi khuẩn Escherichia coli dưới kính hiển vi Khi quan sát dưới kính hiển vi, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng vi khuẩn E.coli có hình que, chiều dài của chúng dao động từ 1 μm đến 5 μm. Một số loài có thể di chuyển bằng roi, một số ít thì ở yên một chỗ không có khả năng di động. Chúng không thể tạo bào tử như nhiều loại vi khuẩn khác. Sinh trưởng ở 15 – 40 ℃ nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 37 ℃, pH từ 6,4 – 7,4. Mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, trắng đục khoảng 2 – 3mm. Tính chất sinh hóa và đề kháng: - Có thể lên men chuyển hóa đường thành acid lactic. - Hầu hết các loại vi khuẩn E.coli đều có khả năng nitrat thành nitrit, sinh hơi. - Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun ở 100 ℃ trong 2 giờ. - Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%. - Bị hủy bởi formol 5%. - Rất độc, chỉ cần 0,05 mg có thể giết chuột nhắc trong vòng 24 giờ. Độc tố: Một số E. coli sản sinh ra độc tố có tên là độc tố Shiga gây tiêu chảy và có thể dẫn đến bệnh nặng. Các E. coli sản sinh ra độc tố Shiga này đôi khi được gọi là STEC (phát âm là "S-TECK"). Nhiễm STEC có thể gây ra hội chứng huyết tán tăng urê máu (HUS) có thể làm hư thận và các cơ quan khác. Hầu hết những người bị nhiễm STEC đều không tiến triển thành HUS, nhưng trẻ nhỏ và người cao tuổi thì lại có nguy cơ gia tăng. Các loại E. coli khác có thể gây ra nhiễm khuẩn thận, bàng quang và các bộ phận khác trong cơ thể. Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 35 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé 1.5.1.2. Bacillus cereus Bacillus cereus là loài vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955. Từ những năm1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều. Theo phân loại khoa học: Giới (Kingdom): Bacteria Ngành (Division): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Bacillales Họ (Family): Bacillaceae Giống (Genus): Bacillus Loài (Species): Bacillus cereus Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0,5 – 1,5 x 2 – 4 µ. Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động. Hình 1. 9: Vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm. Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mọc, hiếu khí và kị khí tùy nghi, sống ở nhiệt độ thích hợp 5 – 50 oC, tối ưu 35 – 40 oC, độ ph 4,5 - 9,3; thích hợp 7 - 7,2. - Trên môi trường NA hay TSB sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì. - Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng. - Trên môi trường MYP: khóm hồng chung quanh có vòng sáng. Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 36 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé - Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng. - Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn. Tính chất sinh hóa: Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không lên men mannitol. - Khử nitrat thành nitrit. - Phản ứng VP (+). - Phân giải Tyroxin. - Catalase (+), Citrate (+). - Mọc trên NB + 0,001% lyzozym. Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rauquả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng. Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày. Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn. 1.5.1.3. Salmonella Năm 1855 Slamon và Smith tìm được Salmonella từ lợn mắc bệnh dịch tả và gọi tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay gọi là Salmonella. Nhưng sau đó Schweinittz và Dorset 1903 đã chứng minh bệnh dịch tả là do một loài vi rút gây ra và đã xác định Salmonella cholerasuis là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn. Năm 1888 A.Gartner phân lập được mầm bệnh từ thịt bò và lách người bệnh, ông gọi vi khuẩn này là Bacilus enteritidis và ngày nay vi khuẩn này được gọi là Salmonella enteritidis. Phân loại khoa học: Giới (Kingdom): Bacteria Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 37 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Ngành (Division): Proteobacteria Lớp (Class): Gammaproteobacteria Bộ (Order): Enterobacteriales Họ (Family): Enterobacteriaceae Giống (Genus): Salmonella lignieres 1900 Salmonella là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi, không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi. Phát triển tốt ở 6 ℃ – 42 ℃, thích hợp nhất là 35 ℃ – 37 ℃, pH từ 6 - 9, thích hợp nhất là 7,2 , ở nhiệt độ 18 ℃ – 40 ℃ vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày. Trên môi trường phân lập XLD khuẩn lạc có hình tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, môi trường chuyển sang màu vàng. Hình 1. 10: Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi Tính chất sinh hóa và đề kháng: - Lên men đường manit, sorbitol (+). - Không lên men đường lactose, sucrose, salicin, inositol (-). Độc tố: vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: Nội độc tố: rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét; độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật. Ngoại độc tố: chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, đem cấy truyền 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có thể gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kị khí. Ngoại độc tố tác động vào Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 38 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé thần kinh và ruột. 1.5.1.4. Staphylococcus aureus Ngày 9 tháng 4 năm 1881, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng. Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học. Phân loại khoa học: Giới (Kingdom): Eubacteria Ngành (Division): Firmicutes Lớp (Class): Bacilli Bộ (Order): Bacillales Họ (Family): Staphylococcaceae Giống (Genus): Staphylococcus Loài (Species): Staphylococcus aureus Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy Lạp staphyle nghĩa là chùm nho là các cầu khuẩn kị khí tuỳ ý. Vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh nha bào và thường không có vỏ,có hình cầu, đường kính 0.8 - 1 µm, hình thức tập hợp này do vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian; trong bệnh phẩm vi khuẩn có thể đứng lẻ, từng đôi hoặc đám nhỏ. Hình 1. 11: Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 39 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Một số Staphylococcus được tìm thấy khắp nơi và có thể phân lập từ không khí, bụi, thực phẩm, thường trú ở vùng da và niêm mạc của người. Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai trò trong y học: Staphylococcus aureus (S. aureus): Tụ cầu vàng được xem là tụ cầu gây bệnh. o Staphylococcus epidermidis (Tụ cầu da). o Staphylococcus saprophyticus. Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của S. aureus là 18 – 40 ℃, pH = 7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 25 ℃, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ. Ở môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh co thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S. aureus có thể sinh trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi trường có nồng độ muối cao. Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15 ℃, nhiều nhất là khi tăng trưởng ở 35 – 37 ℃. Staphylococcus aureus có trong nhiều môi trường sống trước đây, thường sống ký sinh vô hại, nhưng cũng có thể gây bệnh, đặc biệt là khi Staphylococcus aureus (SA) xâm nhập hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau, chẳng hạn như các sự nhiễm trùng da, làm loét, phỏng da hoặc các sự nhiễm trùng nặng trong máu, phổi hoặc các mô khác. Tính chất sinh hoá và đề kháng: Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác, chịu độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%), nhiều chủng tụ cầu vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác. S. aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) (chuyển hoá hydrogen peroxit thành nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine. Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 40 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được men penicillinase (beta – lactamase). Men này phá huỷ vòng beta – lactam, cấu trúc cơ bản của các kháng sinh như penicilline G, Ampicilline và Ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng. Ngoài ra, tụ cầu khuẩn S. aureus không có khả năng tạo bào tử như vi khuẩn Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum và Bacillus cereus cũng thường được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn. Cấu trúc kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide, acid teichoic ở vách tế bào. Vách tế bào chứa kháng nguyên polysaccharide, kháng nguyên protein A ở bề mặt. Người ta có thể căn cứ vào các kháng nguyên trên để chia tụ cầu thành nhóm, tuy nhiên phản ứng huyết thanh không có giá trị trong chẩn đoán vi khuẩn. Độc tố - Enzym: Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme. Một số chủng thuộc loài S. aureus có khả năng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm Độc tố: Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 15 ℃ hơn cả vi khuẩn. Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S.aureus là một protein ổn định nhiệt,nhiều nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 37 ℃ và có thể tồn tại nhiệt ở 100 ℃ trong vòng 30 – 700 phút. Các enzyme ngoại bào: - Protease phân giải protein của tế bào chủ. - Lipase phân giải lipid. - Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo (FAME). 1.5.1.5. Pseudomonas aeruginosa Theo phân loại của Bergey D.G.(1984), Pseudomonas aeruginosa thuộc giống Pseudomonas, họ Pseudomonadaceae. Căn cứ vào sự tương đồng rARN/ADN và những đặc điểm nuôi cấy thông thường, người ta chia giống Pseudomonas thành 92 Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 41 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé loài khác nhau, trong đó Pseudomonas aeruginosa là một trong số 12 loài có liên quan nhiều đến y học. Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) là trực khuẩn Gram âm, nhỏ, đứng riêng lẻ, thành đôi và có khi xếp thành chuỗi. Di động nhờ một lông duy nhất ở một cực. Có pili, không bào tử. Phân loại khoa học: Giới (Kingdom): Bacteria Ngành (Division): Proteobacteria Lớp (Class): Gamma proteobacteria Bộ (Order): Pseudomonadales Họ (Family): Pseudomonas Giống (Genus): Pseudomonas aeruginosa Sức đề kháng: Có sức đề kháng cao với các yếu tố lý hoá. Có khả năng đề kháng kháng sinh cao. Kháng nguyên: Kháng nguyên liên kết với tế bào: + Protein màng ngoài: các protein ở màng ngoài tế bào có thể kết hợp với LPS tạo thành những thụ thể đặc hiệu của trực khuẩn mủ xanh. + Polysaccharide ngoại tiết: có 2 loại polysaccharide được tạo ra bởi những chủng P. aeruginosa có khuẩn lạc dạng M và dạng R. Các kháng nguyên ngoại bào: vi khuẩn tiết ra rất nhiều chất chuyển hoá trong môi trường (protease, elastase, exotoxin A, glycocalx, hemolysine, ...) là những yếu tố độc lực của vi khuẩn đồng thời còn là những kháng nguyên được nghiên cứu để sử dụng chế tạo vaccine gây miễn dịch. Hình 1. 12: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dưới kính hiển vi Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 42 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé Phân loại trực khuẩn mủ xanh: Việc xác định type rất có ý nghĩa trong phân loại, xác định tính phổ biến và sự phân bố của vi khuẩn theo địa dư và các loại bệnh, để từ đó có cơ sở nghiên cứu chế tạo ra các chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị các nhiễm khuẩn do P. aeruginosa. Mặt khác, các phương pháp xác định type cũng có tầm quan trọng trong điều tra dịch tễ học quá trình lây nhiễm loài vi khuẩn này. Những phương pháp hay sử dụng nhất là serotype, lysotype và pyocinotype; các phương pháp này cho phép xác định type của 90 – 95% số chủng P. aeruginosa. Theo Uỷ ban phân loại Quốc tế, việc định type kháng nguyên O (serotype) chia P. aeruginosathành 16 nhóm kháng nguyên được ký hiệu từ O1 đến O16 (hoặc P1 đến P16). Nội độc tố: Là thành phần của vách tế bào vi khuẩn. Nội độc tố bao gồm chủ yếu là LPS và một lượng nhỏ protein. Hoạt tính sinh học của nội độc tố chủ yếu do phức hợp LPS đảm nhiệm. LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết. Ngoại độc tố: Bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66,6 kDa. Exotoxin A hoạt động tượng tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu. Với khả năng khuếch tán và ức chế sự tổng hợp protein của tế bào, exotoxin A là một độc tố mạnh nhất của P. aeruginosa. Exotoxin A gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipit, gây tổn thương nhiều cơ quan, nhưng biểu hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan. 90% số chủng P. aeruginosa sản xuất exotoxin A nhưng đặc tính của độc tố này rất khác nhau tuỳ từng chủng. 1.5.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 1.5.2.1. Phương pháp khuếch tán Nguyên tắc: Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường MP đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường TSB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ 37oC. đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 100μL dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường LB đặc. Chuẩn bị dịch thử bằng cách hòa tan cao trong DMSO 5% Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành Công Nghệ KTHH Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Tống Thị Minh Thu 43 SVTH: Tống Thị Ngọc Bé thành các nồng độ theo yêu cầu. Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh (Ampicilin 10μg/ml, Tetracyclin 30 μg/ml, Amoxilin 10μg/ml); đối chứng âm là DMSO. Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức: BK (mm) = D-d; trong đó D = đường kính vòng vô khuẩn và d = đường kính lỗ khoan thạch. Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình. 1.5.2.2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (minimum inhibitory concentration) là thuật ngữ chỉ nồng độ tối thiểu của dung dịch thử ức chế sự phát triển của vi khuẩn. MIC được sử dụng trong các thử nghiệm đánh giá độ nhạy cảm của dịch thử. Phương pháp môi trường lỏng Mục đích: Kỹ thuật này nhằm mục đích xác định chính xác nồng độ nhỏ nhất của dung dịch thử có tác dụng ức chế sự phát triển của một chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy (phương pháp định lượng). Nguyên tắc: Dung dịch thử được pha loãng theo cấp độ giảm 1⁄(2 )trong môi trường nước thịt. Huyền dịch vi khuẩn được pha loãng tới mật độ xác định và được nuôi với thời gian, nhiệt độ thích hợp cùng với sự hiện diện của kháng sinh trong môi trường nước thịt. Với nồng độ thấp nhất của kháng sinh khi không thấy sự phát triển của vi khuẩn (trong như ban đầu) được ghi nhận là giá trị MIC của dung dịch thử đó trên chủng vi khuẩn đó. Cách thực hiện: Cho vào ống nghiệm thứ nhất a ml dung dịch thử, thêm đồng thể tích (a mL) dung dịch môi trường (pha loãng gấp 2 lần). Từ ống thứ nhất lắc đều lấy a mL chuyển sang ống thứ hai đã có a mL môi trường (pha loãng gấp 4), cứ tiếp tục sang các ống nghiệm sau cho hết các ống đã định, cuối cùng lấy a mL dung dịch ở ống cuối bỏ đi. Như vậy ta có một dãy đã pha loãng dần. Một ống làm chứng thì chứa a mL môi trường, thêm vào mỗi ống một lượng hỗn dịch vi khuẩn như nhau rồi để tất cả trong tủ ấm trong một thời gian thích hợp. Nế