Báo cáo khóa luận Xây dựng chứng nội (internal amplification control) cho quy trình phát hiện thành phần có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm chay dựa trên gen rDNA

ố trình tự gen lục lạp của các loài thực vật (cụ thể là cải, xà lách,) trong cơ sỡ dữ liệu Gene trên NCBI. 2.1.2. Kế thừa cặp mồi, kiểm tra độ đặc hiệu và tƣơng đồng Mồi là chỉ tiêu quan trọng trong việc khuếch đại trình tự DNA mục tiêu trong phản ứng PCR. Mồi phải có tính chuyên biệt nghĩa là chỉ có duy nhất một vị trí bắt cặp trên khuôn DNA. Kế thừa cặp mồi từ bài báo của tác giả Lao Đức Thuận và cs [2] , mồi được thiết kế dựa trên gen 16S rRNA ty thể động vật. Và cặp mồi sử dụng làm chứng nội được thiết kế dựa trên gen không mã hóa của lục lạp được kế thừa từ bài báo của tác giả Taberlet P. và cs [43]. Các cặp mồi được đánh giá bằng các công cụ tin sinh sau: Cặp mồi được kiểm tra độ đặc hiệu và tương đồng bằng công cụ BLAST, kiểm tra vị trí bắt cặp của mồi và kích thước sản phẩm bằng phần mềm Annhyb. Tiếp tục kiểm tra các thông số vật lý (chiều dài, % GC, nhiệt độ nóng chảy, hairpin, self-dimer, năng lượng hình thành cấu trúc bậc 2,) của cặp mồi bằng chương trình trực tuyến Oligo Analyzer 3.1 của IDT. 2.1.3. Danh mục các phần mềm sử dụng Annhyb 4.946: giúp làm việc và quản lý các trình tự nucleotide dưới nhiều định dạng. Clustalw2: dùng cho việc so sánh sự tương đồng của hai hay nhiều trình tự sinh học. Trang 15 SeaView 4.5.4: hỗ trợ cho các phân tích tương đồng, sắp gióng cột các trình tự. Chromas Lite 2.1.1: chương trình miễn phí dùng để hiệu chỉnh trình tự. 2.2. THỰC NGHIỆM: KIỂM TRA TÍNH THUẦN CHAY CỦA 6 MẪU THỰC PHẨM CHAY 2.2.1. Vật liệu Mẫu: 10 mẫu thực phẩm chay được thu nhận từ chợ và các công ty sản xuất thực phẩm chay thuộc khu vực Tp. Thủ Dầu Một - Bình Dương. Mồi: Kế thừa cặp mồi khuếch đại gen 16S rRNA ty thể động vật từ bài báo của tác giả Lao Đức Thuận [2]: Mồi xuôi (F) TP1: 5’ CCYAGGGATAACAGCGCAATC 3’ Mồi ngược (R) TP2: 5’ TCCGGTCTGAACTCAGATCAC 3’ Cặp mồi sử dụng làm chứng nội kế thừa từ bài báo của tác giả Taberlet P. và cs [43] : Mồi xuôi (F) CLO-1-F: 5’ GGTTCAAGTCCCTCTATCCC 3’ Mồi ngược (R) CLO-1-R: 5’ ATTTGAACTGGTGACACGAG 3’ Hóa chất - Dung dịch đệm PBS-Phosphate buffer saline (NaCl (8 g), KCl (2 g), KH2PO4 (2 g), Na2HPO4 (1,15 g), dH2O (bổ sung nước đủ 1000 mL)) - Nước cất 1 lần - Nước cất 2 lần - Ethanol 70% (Việt Á) - Ethanol 100% (Việt Á) - Dung dịch đồng nhất (NaCl 5M (0,8 mL), Tris - HCl 1M (0,1 mL), EDTA 0,5M (0,02 mL), H2O (9,08 mL)) Trang 16 - Dung dịch SDS 10% (Bio Basic Canada INC) - Proteinase K 1 mg/mL (Fermentas) - Dung dịch Proteinase K (SDS 10%, Proteinase K 1 mg/mL, EDTA 0,5 M) - EDTA (Ethylendiamin Tetraacetic Acid) - Dung dịch NaCl bão hòa - Phenol (Merk) - Chloroform (Merk) - Isopropanol (Isopropyl alcohol) (Merk) - Amonium acetat (NH4OAc) - Dung dịch đệm TE (Tris - HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH = 8) - Master Mix 2X (Thermo Scientific) - Loading dye 6X (Bio Rad) - Thang DNA chuẩn 100 bp (Bio Rad) - Agarose 1,5% (Bio Rad) - Dung dịch đệm TBE (Tris - acid boric - EDTA) (Bio Rad) - Ethidium bromide - EtBr (100 mg/mL) (Bio Rad) Dụng cụ và thiết bị - Găng Tay cao su, khẩu trang - Dụng cụ tách chiết (Cối giã, ống falcon, becher, micropipet, đầu tuýp, eppendorf,) - Cân phân tích - Cân kỹ thuật - Máy khuấy từ - Máy vortex Trang 17 - Bể ổn nhiệt - Tủ lạnh - Máy ly tâm (Hettich - Universal 320R) - Tủ tách chiết và tủ PCR (ESCO ADC - 4B1) - Máy luân nhiệt PCR (Bio Rad) - Máy đo quang phổ (SmartSpec) - Bồn điện di (Bio Rad) - Máy đọc gel (Geldoc XR Bio Rad) 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Về thực nghiệm, mẫu đem về được tách chiết DNA bằng phương pháp phenol/chloroform, DNA tách chiết xong được bảo quản bằng dung dịch TE. Tiếp theo sử dụng phương pháp đo quang phổ để định tính, định lượng DNA trong mẫu. Kiểm tra sự hiện diện của thành phần động vật trong mẫu bằng cách sử dụng phương pháp PCR khuếch đại gen 16S rRNA ty thể động vật nhờ cặp mồi đã chọn, sau khi PCR xong mẫu này được đem đi điện di để phân tách DNA mục tiêu đã khuếch đại nhờ PCR. Mẫu nào nghi ngờ bị nhiễm DNA động vật tiến hành gửi mẫu giải trình tự và xác định xem mẫu bị nhiễm DNA loài nào. Bước đầu thiết lập quy trình multi-PCR để khảo sát mồi CLO-1 được dùng làm chứng nội. Trang 18 Sơ đồ thí nghiệm kiểm tra sự hiện diện của thành phần động vật trong mẫu 2.2.2.1. DNA trong mẫu thực phẩm chay được tách chiết bằng phương pháp phenol/chloroform [28][29] Mẫu được rửa lần lượt bằng nước cất, cồn 70%, dung dịch PBS (từ 2 - 3 lần). Sau khi được làm sạch dùng kéo (đã hấp, ngâm cồn) cắt mẫu thành từng mảnh nhỏ, cho vào cối vô trùng, giã nhuyễn. Cân 2 g mẫu và đem đồng nhất với 4 mL dung dịch đồng nhất, vortex. Chuyển 750 µL dung dịch vừa đồng nhất vào eppendorf, thêm 20 μL SDS 10% và 20 μL proteinase K (1 mg/mL). Ủ mẫu qua đêm trong bể ổn nhiệt ở 65°C. Tiến hành bổ sung 250 μL NaCl bão hòa, lắc nhẹ, ủ mẫu ở 4°C trong 30 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút. Sau đó hút 500 μL dịch nổi vào eppendorf khác. Bổ sung 500 μL hỗn hợp phenol : chloroform : isoamylalcohol (25 : 24 : 1 v:v:v) đảo ống nhẹ, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C, thu dịch nổi cho vào eppendorf mới (lặp lại bước này từ 1 đến 2 lần tùy thuộc vào mẫu). Thêm 500 μL chloroform, đảo ống nhẹ, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C, thu dịch nổi cho vào eppendorf mới. Thêm 0,1 lần thể tích NH4OAc và 1 lần thể tích isopropanol, đảo ống nhẹ, để lạnh ở -20°C trong 2 giờ. Sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C thu tủa. Bổ sung 1 mL ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C thu tủa và phơi khô DNA. Bảo quản DNA: Trang 19 bổ sung 50 µL dung dịch TE để bảo quản và giữ DNA trong tủ âm (-20°C) cho đến khi cần dùng. 2.2.2.2. Kiểm tra sự hiện diện của thành phần động vật trong mẫu bằng phương pháp PCR khuếch đại gen 16S rRNA ty thể động vật nhờ cặp mồi đã chọn. Phương pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 được sử dụng rộng rãi nhất. Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào. Kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng. PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài khoảng từ 200 – 3.000 bp. Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide [1] . Mẫu đem về được tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform. Sau đó tiến hành phản ứng PCR với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau: Thành phần phản ứng PCR với mồi TP1-TP2 Tổng thể tích phản ứng: 15 µL - Master Mix: 7,5 µL - Mồi xuôi TP1 (10 µM): 0,5 µL - Mồi ngược TP2 (10 µM): 0,5 µL - DNA mẫu: 1 µL - Water free nuclease: 5,5 µL Trang 20 Mồi TP1-TP2 Mồi chứng nội Chu trình nhiệt 95°C trong 5 phút 1 chu kì 95°C trong 30 giây 35 chu kì 67°C trong 1 phút 72°C trong 1 phút 72°C trong 5 phút 1 chu kì 4°C Vô cùng Thành phần phản ứng multi-PCR với cặp mồi TP1-TP2 và mồi chứng nội Tổng thể tích phản ứng: 15 µL Master Mix: 7,5 µL Mồi xuôi TP1 (10 µM): 0,5 µL Mồi ngược TP2 (10 µM): 0,5 µL Mồi xuôi CLO-1-R (10 µM): 0,5 µL Mồi ngược CLO-1-F (10 µM): 0,5 µL DNA mẫu: 1 µL Water free nuclease: 4,5 µL Chu trình nhiệt 95°C trong 5 phút 1 chu kì 95°C trong 30 giây 35 chu kì 55°C trong 1 phút 72°C trong 1 phút 72°C trong 5 phút 1 chu kì 4°C Vô cùng Trang 21 2.2.2.3. Sử dụng phương pháp đo quang phổ để định tính, định lượng DNA [1] Phương pháp này không thật chính xác nhưng cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu, và thường điều này cũng đáp ứng đủ yêu cầu nghiên cứu. Nguyên tắc của phƣơng pháp dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan sau: Một đơn vị OD260 nm tương ứng với một nồng độ là:  50 µg/mL cho một dung dịch DNA sợi đôi  40 µg/mL cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với các dung dịch nucleic acid sạch. Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở bước sóng 280 nm (OD280 nm). 280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic aid. Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 - 2. Mẫu sau khi tách chiết, pha loãng 50 lần (2 µL DNA : 98 µL H2O cất) và đem đo OD để xác định độ tinh sạch và nồng độ nucleic acid trong mẫu. 2.2.2.4. Điện di sản phẩm kiểm tra kết quả Kỹ thuật điện di trên gel bây giờ đã được coi như một phương pháp thông thường trong phòng thí nghiệm để phân tích DNA [34]. Sau khi PCR xong tiến hành điện di mẫu để kiểm tra tính “thuần chay” của các mẫu thực phẩm chay đã thu thập và kích thước sản phẩm đã khuếch đại có đúng với kích thước khuếch đại trên lý thuyết. Trang 22 Thông số điện di - Gel agarose: 1,5% (1,5 g agarose + 100 mL dd TBE) - Vnạp mẫu: 6 µL (1 µL loading dye 6X + 5 µL DNA), chạy trong 30 phút, 90V. - Thang chuẩn 100 bp: 1 µL 2.2.2.5. Tiến hành giải trình tự và hiệu chỉnh trình tự Sau khi điện di, mẫu nào nghi ngờ bị nhiễm thành phần động vật được gửi đi giải trình tự ở công ty Nam Khoa. Kết quả giải trình tự được hiệu chỉnh bằng phần mềm Chromas lite 2.1.1. Kiểm tra các peak ở 2 đầu của trình tự mồi xuôi và mồi ngược, nếu peak không rõ ràng phải tiến hành hiệu chỉnh. Đối với mạch F giữ nguyên còn mạch R phải tiến hành reverse & complement. Để bắt đầu hiệu chỉnh phải export cả 2 mạch thành file fasta rồi sử dụng phần mềm seaview 4.2.12 tiến hành sắp gióng cột kiểm tra độ tương đồng. Bắt đầu hiệu chỉnh trình tự (hiệu chỉnh từ sau lên trước để tránh trường hợp khi xóa 1 vài nucleotide thì vị trí của các nucleotide khác bị thay đổi) của 2 mạch bằng cách sử dụng chức năng Dotplot trong phần mềm seaview để so sánh 2 trình tự, sắp xếp các vùng trùng nhau. Nếu có những lỗi (mismatch) hay những khoảng trống (gap) trong trình tự thì tiến hành mở lại trình tự bằng phần mềm Chromas lite 2.1.1 để tái kiểm tra, so sánh và rút ra kết luận cuối cùng với độ chính xác cao nhất. Cuối cùng dùng phần mềm Chromas lite 2.1.1 xuất ra trình tự cuối cùng chính xác nhất của đoạn DNA đã được hiệu chỉnh. Sau khi hiệu chỉnh trình tự và xuất ra trình tự chính xác nhất của đoạn DNA thì bước tiếp theo là đưa trình tự vào chương trình BLAST để đánh giá. Nếu kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng phù hợp: nghĩa là tìm được một vài trình tự hoàn toàn tương đồng về chiều dài, không có sự sai khác giữa các nucleotide với trình tự đang nghiên cứu thì trình tự này được chấp nhận là đã hiệu chỉnh xong. Trường hợp trình tự hiệu chỉnh có sai khác đối với các trình tự trên ngân hàng Genbank thì xem xét lại các nucleotide có sự sai khác này dựa vào peak tương ứng thuộc trình tự đã hiệu chỉnh trên Chromas lite 2.1.1 để xác định chính xác có thể là lỗi kỹ thuật trong quá Trang 23 trình hiệu chỉnh. Còn nếu peak không rõ ràng, không thể nhận ra là nucleotide nào thì phải giải quyết như sau: vào NCBI thu nhận các trình tự có mức độ tương đồng trên 50% so với trình tự hiệu chỉnh, sắp giống cột với nhau và kiểm tra tần số xuất hiện tại vị trí nucleotide sai khác là nuleotide nào rồi xác định nuleotide cần thay thế ở vị trí đó. Kết thúc việc kiểm tra và hiệu chỉnh thu nhận được trình tự có mức độ chính xác cao nhất, đạt độ tin cậy lớn nhất. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN PHẦN Trang 24 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO TRÊN GEN TY THỂ 16S rRNA 3.1.1. Thu thập trình tự đích 16S rRNA Thu thập một số trình tự gen 16S rRNA của các loài động vật (cụ thể là: heo, bò, gà,) và thực vật (cụ thể là gạo, cải,) từ ngân hàng Genbank trên NCBI. Gồm 10 trình tự gen 16S rRNA của các loài động vật, 5 trình tự gen 16S rRNA của các loài thực vật và 8 trình tự gen 16S rRNA của các loài vi sinh vật thường gây hại trong thực phẩm đã được tìm kiếm và thu thập từ cơ sỡ dữ liệu Genbank trên NCBI. Bảng 3.1. Bảng liệt kê các trình tự gen 16S rRNA của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật STT Loài Tên loài cụ thể Mã Accession Chiều dài trình tự 1 Động vật Sus scrofa (heo) AJ002189 1569 bp 2 Sus scrofa (heo nhà) KM433673 1570 bp 3 Pangasianodon hypophthalmus (cá tra) NC021752 1630 bp 4 Pangasius pangasius (cá tra đuôi vàng) KC572135 1674 bp 5 Gallus gallus (gà) X52392 1621 bp 6 Bos indicus (bò Zebu) AF492350 1570 bp 7 Bos primigenius (bò nhà) NC013996 1571 bp 8 Bos mutus (bò tây tạng) KM233417 1571 bp 9 Canis lupus familiaris (chó) NC002008 1580 bp 10 Cairina moschata (ngan bướu mũi) L16769 1540 bp Trang 25 11 Thực vật Brassica oleracea (cải bắp dại) FJ859992 2301 bp 12 Zea mays (ngô) Z00028 1491 bp 13 Triticum turgidum (lúa mì cứng) AJ555400 1483 bp 14 Brassica napus (cải dầu) AB252057 1463 bp 15 Brassica oleracea (cải bắp) HE601634 1137 bp 16 Vi sinh vật Bacillus sp. X86600 1414 bp 17 Escherichia coli AB269763 1502 bp 18 Salmonella typhimurium EF489442 909 bp 19 Vibrio cholerae Z21856 1452 bp 20 Staphylococcus aureus DQ306891 1504 bp 21 Clostridium sp. HQ326724 1501 bp 22 Shigella sp. JN626189 1503 bp 23 Campylobacter jejuni AY621111 1442 bp 3.1.2. Kế thừa và đánh giá mồi cho phản ứng PCR Kế thừa cặp mồi từ bài báo của tác giả Lao Đức Thuận [2], mồi được thiết kế dựa trên gen 16S rRNA với trình tự như sau: Mồi xuôi (F) TP1: 5’ CCYAGGGATAACAGCGCAATC 3’ Mồi ngược (R) TP2: 5’ TCCGGTCTGAACTCAGATCAC 3’ 3.1.2.1. Đánh giá các thông số vật lý Các thông số vật lý được kiểm tra bằng chương trình trực tuyến Oligo Analyzer 3.1 của IDT với các tiêu chí sau [54]: Chiều dài: Độ dài tối ưu của mồi PCR thường là 18 - 22 bp. Độ dài này là đủ dài cho độ đặc hiệu và đủ ngắn để mồi bắt cặp một cách dễ dàng với mẫu. Nhiệt độ nóng chảy (Tm): Nhiệt độ nóng chảy của mồi thường trong khoảng 52 - 58°C thường cho ra kết quả tốt nhất. Chênh lệch ∆Tm là 5°C hoặc thấp Trang 26 hơn. Dựa vào Tm người ta tính ra nhiệt độ bắt cặp (Ta) của mồi với DNA khuôn (Ta < Tm). %GC: %GC của mồi phải từ 40 - 60%. Cấu trúc bậc hai của mồi: Càng ít hoặc không có hình thành cấu trúc bậc hai của mồi. Có 3 dạng cấu trúc bậc hai của mồi: cấu trúc kẹp tóc (hairpin), tự bắt cặp (self-dimer), bắt cặp lẫn nhau (hetero-dimer). Cấu trúc này càng bền vững thì hiệu quả của phản ứng PCR càng thấp vì nó làm cản trở khả năng bắt cặp của mồi vào trình tự đích. Tính toán thông qua ∆G (Kcal/mol) - sự biến đổi năng lượng tự do (Gibbs free energy), theo hãng IDT mồi được đánh giá tốt khi giá trị ∆G > -9 Kcal/mol. Bảng 3.2. Các thông số đánh giá mồi c