Báo cáo Nghiên cứu Công nghệ vi sinh

Kết quả khảo sát điều kiện li trích PHB Ảnh hưởng của tác nhân li trích: Sodiumhypochlorite (SH) 5%, Sodiumdodecylsulfate (SDS) 3% được sử dụng làm tác nhân phá vỡ tế bào theo hàm lượng sinh khối. Đối với tác nhân sodiumhypochlorite cho hi ệu suất phá vỡ tế bào cao nhất ở hàm lượng 1% sinh khối tế bào đạt 85,635% và thu được 32,865 % PHB theo trọng l ượng khô tế bào. Đối với tác nhân SDS 3% cho hiệu suất phá vỡ tế bào cao nhất ở hàm lượng 5% sinh khối tế bào đạt 85,124% và thu được 34,635 % PHB theo trọng l ượng khô tế bào. Tác nhân SDS 3% có khả năng ly trích PHB ở h àm lượng sinh khối cao hơn tác nhân Sodiumhypochlorite 5%. Ảnh hưởng của nhiệt độ li trích: Thí nghiệm đ ược thực hiện với 2 tác nhân sodiumhypochlorite và SDS theo dãy nhiệt độ từ 400C đến 900C. Đối với tác nhân sodiumhypochlorite đạt hàm lượng PHB cao nhất (32,182 %) tại 600C với hiệu suất phá vỡ tế bào 85,462%. Đối với tác nhân SDS đạt hàm lượng PHB cao nhất (35,623%) tại 800C với hiệu suất phá vỡ tế bào 85,253% [hình 6]. Kết quả cho thấy, đối với tác nhân Sodiumhypochlorite 5% nhiệt độ càng cao quá trình phá vỡ tế bào càng giảm đối với các chủng lactobacllus. Ngược lại, hiệu suất phá vỡ tế bào càng mạnh khi nhiệt độ tăng lên đối với tác nhân SDS 3% , tuy nhiên lại ảnh hưởng đến sự phá vỡ cấu trúc của PHB và cho hàm lượng thấp xuống. Hình 5: Khảo sát sự phá vỡ tế bào với tác nhân sodiumhypochlorite 5% v à SDS 3% theo hàm lượng sinh khối tế bào Hình 6: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá tr ình li trích PHB với tác nhân sodiumhypochlorite 5% v à SDS 3% S od ium hypoch lo rite - S DS 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0.50% 1% 2% 3% 4% 5% 6% Sinh kho ái (% ) P H B )% ) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 H ie äu su aát PH B(% )-SH 5 % H ie äu su aát (% )-SH 5 % PH B(% )-SD S 3 % H ie äu su aát (% )-SD S 3 % 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 40 50 60 70 80 90 N hie ät ñ o ä (o C ) P H B )% ) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 H ie äu su aát PH B(% )-SH 5 % H ie äu su aát (% )-SH 5 % PH B(% )-SD S 3 % H ie äu su aát (% )-SD S 3 % Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 235 Ảnh hưởng của thời gian li trích: Thời gian trong quá tr ình ly trích PHB được thiết lập trong khoảng thời gian từ 20 phút đến 120 phút cho 2 tác nhân Sodiumhypochlorite tại nhiệt độ 600C và SDS tại 800C. Kết quả khảo sát cho thấy quá tr ình ly trích PHB với tác nhân Sodiumhypochlorite đ ạt hàm lượng PHB cao nhất tại thời điểm 60 phút ly trích với 32,246% PHB, hiệu suất ly trích là 85,642% và với tác nhân SDS đạt hàm lượng PHB cao nhất tại thời điểm 80 phút ly trích với 34,575 % PHB, hiệu suất ly trích là 95,563% (hình 7). Hình 7: Khảo sát thời gian li trích ảnh h ưởng đến quá trình li trích PHB với tác nhân sodiumhypochlorite 5% và SDS 3% KẾT LUẬN Qua kết quả nghiên cứu, chúng tôi có một số nhận xét như sau: Vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp PHB, đã phân lập được 78 chủng vi khuẩn lactic với h ơn 50 chủng thuộc nhóm Lactobacillus . Các chủng có sự hiện diện của PHB trong tế b ào là 30 chủng chiếm 38,5% trong tổng số vi khuẩn lactic phân lập đ ược. Trong đó chủng DG5, M1, N8 đã có khả năng sinh tổng hợp PHB cao nhất. Glucose v à peptone là 2 nguồn dinh dưỡng thích hợp cho cả 3 chủng D G5, M1 và N8 sinh tổng hợp PHB. Riêng chủng M1 đường lactose hoc ho hàm lượng cao hơn. Kết quả nghiên cứu cho thấy với môi trường dịch chiết cà chua bổ sung 1% glucose cũng thích hợp cho quá tr ình sinh tổng hợp PHB của cả 3 chủng. Đề t ài nghiên cứu đã xây dựng được quá trình tách chiết PHB dựa trên 2 tác nhân Sodiumhypochlorite 5% và SDS 3 %. Quá trình tách chiết với tác nhân Sodiumhypochlorite 5% thích h ợp ở hàm lượng sinh khối tế bào là 1%, nhiệt độ ly trích 600C và thời gian ly trích là 60 phút. Đối với quá trình tách chiết bằng tác nhân SDS 3% thích hợp với hàm lượng sinh khối là 5%, nhiệt độ ly trích là 800C và thời gian ly trích là 80 phút. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Dương Thị Thu Lý (2003). Phân lập và chọn giống vi khuẩn lactic để l àm yaourt đậu nành. Luận văn Thạc sỹ sinh học. Đại học Khoa học Tự nhi ên - TPHCM. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 20 40 60 80 100 120 phuùt PH B )% ) 0 20 40 60 80 100 120 H ie äu su aát PHB(%)-SH 5%- Hieäu suaát (%)-SH 5% PHB(%)-SDS 3% Hieäu suaát (%)-SDS 3% Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007236 2. Kolybaba M. A.. Tabil L. G.. Panigrahi S. A. (2004). Recent Developments in the Biopolymer Industry. The society for Engineering in agricultural food and biological systems. pp. MB04 - 301. 3. Law. John H. & RalpH A. Splepecky (1960). Assay of Poly--hydroxybutyric acid. J. Bacterial. Vol. 82. pp. 33 - 36. 4. Lee S. Y. (1996). Bacterial Polyhydroxyalkanoate. Biotechnology and Bioengineering. Vol. 49. pp. 1 - 14. 5. Liddell J. M. (1999). Process for the recover y of polyhydroxyalkanoic acid. United states Patent. Patent Number 5894062. 6. Luengo J. M.. Garcia B.. Sandoval A.. Naharro G. and Olivera E. R. (2003). Bioplastics from microorganisms. Current Opinion in Microbiology . Vol. 6. pp. 251-260. 7. Mahishi L. H.. Tripathi G.. Rawal S. K. (2003). Poly (3--hydroxybutyrate) synthesis by recombinant Escherichia coli harbouring Streptomyces aureofaciens PHB biosynthesis genes: Effect of various carbon and nitrogen sources. Microbial Research. Vol. 158. pp. 19 - 27. 8. Saledizadeh. Loosdrecht (2004). Production of polyhyd roxyalkanoates by mixed culture: Recent trends and biotechnological importance. Biotechnology Advances. Vol. 22. pp. 261 - 279. 9. Steinbuchel A. (1996). PHB and Other Polyhydroxyalkanoic Acids. Biotechnology. Vol. 6. pp 403 - 464. 10. Ugur. Sahin. Beyati (2002). Accumulation of Poly -- hydroxybutyrate in Streptomyces Species: During Growth with Different Nitrogen Sources. Tur J Biol. Vol. 26. pp. 171 - 174. SUMMARY Screening of lacyobacillus strains for biosynthe sis of polyhydroxybutyrate (PHB) Nguyen Duy Long, Phạm Tran To Nhu, Nguyen Minh Nhut, Hoang Quoc Khanh Institute of Tropical Biology In this study, we found 3 Lactobacillus strains (DG5, M1, N8) with a h igher concentration of PHB than 78 strains collected with 27.87%, 26.23%, 26.60% corresponding. Glucose and peptone are investigated and determined as nutrient factor for produce PHB. For the accumulation of PHB from DG5, M1, and N8, the tomato extract solution was found as a cheeper nutrient resourse to produce PHB. The processing of PHB extraction was followed by Sodiumhypochlorite (SH) 5% in cell mass 1% at 600C during 60 minutes and Sodiumdodecylsulphate (SD Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 237 PHÂN LẬP VÀ THU NHẬN enzym phytase TỪ MỘT SỐ NẤM MỐC Aspergillus TRÊN MÔI TRƯỜNG NÊN MEN BỀ MẶT Nguyễn Duy Long, Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, Ho àng Quốc Khánh Phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Photpho là nguyên tố thiết yếu cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và sinh sản của động vật. Tuy nhiên, có khoảng 60-75% photpho trong ngũ cốc và hạt dầu trong thức ăn của động vật được tìm thấy ở dạng phytat (inositol hexaphosphat) hoặc axit phytic. Động vật không thể hấp thụ photpho trong phyta t vì chúng không có enzym phytase trong đường ruột. Vì thế phần lớn photpho được tìm thấy trong phân của động vật. Ngoài ra những chất dinh dưỡng khác như protein, Fe2+, Ca2+, Mg2+, Zn2+ cũng sẽ bị liên kết vào cấu trúc của axit phytic. Do đó cơ thể động vật không thể hấp thụ được các ion này. Photpho trong phân của động vật được hấp thụ vào đất, chúng cần thiết cho sự phát triển của thực vật. L ượng photpho dư thừa không được cây hấp thụ sẽ bị cuốn trôi ra ao, hồ, sông, suối kích thích sự phát triển của phiêu sinh thực vật (tảo) gây ra hiện tượng phú dưỡng hoá. Ngoài ra, sự thiếu hụt oxy sẽ làm cá chết và giảm sự đa dạng của hệ sinh vật có lợi trong n ước. Phytase là một trong số các enzym hiện đang rất đ ược quan tâm. Phytase thủy phân liên kết giữa photpho và vòng phytat sẽ phóng thích photpho vô cơ. Việc bổ sung phytase vào thức ăn gia súc giúp tận dụng tối đa nguồn photpho trong các loại nguy ên liệu chế biến vì hệ vi sinh vật đường ruột của động vật hầu như không có khả năng sinh tổng hợp phytase, và đồng thời giúp giảm chi phí bổ sung lượng photpho vô cơ cần thiết vào thức ăn gia súc. Hơn thế nữa, phytase còn giúp giảm thiểu ô nhiễm photpho vào môi trường do chất thải động vật. Enzym phytase được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau như nấm men, nấm mốc và vi khuẩn nhưng nhiều nhất vẫn là trên các loại nấm mốc đặc biệt là Aspergillus sp. vì khả sinh tổng hợp enzym phytase cao và có thể chịu được pH thấp. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các chủng Aspergillus được phân lập từ các loại men rượu (men cơm rượu, men rượu) và một số chủng Aspergillus khác (A.aculeatus, A.awamori, A.carbonarius, A.ellipticus, A.ficuum, A.flavus, A.niger NRRL-363, A.ochraceus A175, A.oryzae, A.phoenisis, A.tubingensis) từ bộ sưu tập giống của phòng Vi sinh ứng dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới trên môi trường PGA . Quá trình nuôi cấy và tách chiết enzyme phytase được thực hiện theo quy trình dưới (Hình 1). Enzym phytase được phân tích hàm lượng protein theo phương pháp Bradford. Hoạt tính enzym phytase được xác định trên cơ chất sodium phytate (một đơn vị hoạt tính phytase (U) được định nghĩa là lượng phytase giải phóng được 1 µmol photphat vô cơ trong Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007238 một phút từ sodium phytat ở 37oC, pH5,5). Quá trình khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hoạt tính enzym phytase được thực hiện trong dải nhiệt độ từ 30-950C, trong đệm Glycin: 2,5pH, trong Sodium acetat: 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5, trong đệm Imidazol-HCl: 6,0; 6,5; 7,0, trong đệm Tris-HCl: 7,5; 8,0; 8,5; 9,0. Enzym phytase được phân tích trên gel polyacrylamide theo phương pháp SDS -PAGE. KẾT QUẢ 1. Phân lập nấm Aspergillus từ men rượu Trong số 14 loại men rượu thu nhận từ các nơi khác nhau cho thấy sự phân bố các chủng nấm mốc không có sự khác biệt nhiều. trong đó chúng tôi đ ã xác định được 4 chủng nấm mốc khác biệt nhau rõ rệt về hình thái là Aspergillus.MCR1 (hình 2.1; 2.2; 2.3), Aspergillus.MCR2(hình 3.1; 3.2; 3.3), Aspergillus. MR5 (hình 4.1; 4.2; 4.3), Aspergillus.MR2 (hình 5.1; 5.2; 5.3), Ống PGA giữ giống Aspergillus + 5ml nước cất vô trùng Hút 1ml dung dịch bào tử vào các bình lên men bề mặt (Trấu:Bột m ì:Khoáng)[Tỉ lệ Trấu:Bột mì 1:2, 60% Khóang] 370C, 2 ngày Bổ sung 200ml dung dịch đệm Sodium Acetate pH 5.5 Lắc 200rpm, 3h Lọc dịch qua vải mỏng Dịch chiết enzym thô Cấy truyền sang các ống nghiệm PGA Hình 1: Quy trình lên men bề mặt aspergillus sinh tổng hợp enzyme phytase Hình 2.2. Hình thái và kích thước Conidiophores chủng MCR1; X 6 Hình 2.1. Hình thái chủng MCR1 mọc trên môi trường PGA Hình 2.3. Hình thái và kích thước bào tử chủng MCR1 (conidia); X 100 Hình 3.2. Hình thái và kích thước conidiophores chủng MCR2; X 6 Hình 3.1. Hình thái chủng MCR2 mọc trên môi trường PGA Hình 3.3. Hình thái và kích thước bào tử chủng MCR2 (conidia); X 100 Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 239 Hình 4.1. Hình thái chủng MR5 mọc trên môi trường PGA Hình 4.2. Hình thái và kích thước Conidiophores chủng MR5; X 6 Hình 4.3. Hình thái và kích thước bào tử chủng MR5 (conidia); X 100 Hình 5.1. Hình thái chủng MR2 trên môi trường PGA Hình 5.3. Hình thái và kích thước bào tử chủng MR2 (conidia); X 100 Hình 5.2. Hình thái và kích thước Conidiophores chủng MR2; X 6 2. Xác định hoạt tính enzyme phytase của các chủng Aspergillus Trong 4 chủng được phân lập từ các loại men th ương mại, có 3 chủng Aspergillus có khả năng sinh phytase là A.MCR2, A.MR2, A.MR5 và 1 chủng không sinh phytase là A.MCR1. Trong số 3 chủng có hoạt tính phytase th ì A.MR2 cho hoạt tính cao nhất. Ngoài ra, 1 chủng trong Bộ sưu tập giống- Phòng Vi sinh ứng dụng cũng không có khả năng sinh phytase là A.ochraceus. Hai chủng Aspergillus cho hoạt tính phytase cao nhất là A.niger NRRL-363 và A.oryzae. A.niger NRRL-363 có hoạt tính tổng (Ut) cao hơn A.oryzae nhưng A.oryzae lại cho hoạt tính riêng cao hơn. Enzyme từ các chủng còn lại có hoạt tính trung bình hoặc thấp (hình 6a, 6b). Đối với A.flavus, một loại nấm mốc sinh độc tố anfatocin cũng có khả năng sinh enzym phytase, do đó cần t hận trọng trong việc tuyển chọn nấm mốc. Từ các chủng tr ên, chọn ra 3 chủng A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 cho hoạt tính phytase cao nhất để khảo sát phổ nhiệt độ, pH. 3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme phytase Từ đồ thị cho thấy nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính phytase cao đối với cả 3 chủng A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 là 50-550C so sánh với các kết quả đã nghiên Hình 6a: Hoạt tính tổng Ut (U/g mẫu) của các chủng nấm mốc 0 50 100 150 200 250 300 Chuûng H oa ït tí nh t oån g U t (U /g m aãu ) A.MCR1 A.MCR2 A.MR5 A.MR2 A.aculeatus A.awamori A.carbonarius A.ellipticus A.ficuum A.flavus A.niger NRRL-363 A.ochraceus A175 A.oryzae A.phoenicis A.tubingensis Ñoái chö ùng 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Chuûng H oa ït tí nh r ie ân g U s (U /m g m aãu ) A.MCR1 A.MCR2 A.MR5 A.MR2 A.aculeatus A.awamori A.carbonarius A.ellipticus A.ficuum A.flavus A.niger NRRL-363 A.ochraceus A175 A.oryzae A.phoenicis A.tubingensis Ñoái chö ùng Hình 6b. Hoạt tính riêng Us (U/mg mẫu) của các chủng nấm mốc Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007240 cứu đa số phytase có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 44-600C [6,10]. Tại khoảng nhiệt độ tối ưu này, A.niger NRRL-363 cho hoạt tính enzym phytase tổng Ut cao nhất nhưng lại có hoạt tính riêng Us thấp nhất trong 3 chủng. A.niger NRRL-363 có hàm lượng protein cao, hoạt tính tổng cao, hoạt tính ri êng thấp chứng tỏ chủng này cho ít enzym phytase hơn trong t ổng số nhiều loại protein được sinh ra, hình (7a, 7b). Trong sản xuất, hoạt tính ri êng cao được quan tâm nhiều h ơn. A.oryzae và A.MR2 đáp ứng được yếu tố này, cả 2 chủng đều có hoạt tính enzym phytase tổng thấp hơn A.niger NRRL-363 nhưng lại có hoạt tính riêng cao hơn hẳn nhất là A.oryzae. Từ kết quả khảo sát ảnh h ưởng của nhiệt độ đến hoạt tính phytase từ A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2, chúng tôi có kết luận và nhận xét như sau: Các tính chất này của phytase từ 3 chủng nấm mốc tr ên rất thích hợp cho các ứng dụng công nghiệp, đặc biệt trong chế biến thức ăn gia súc. 4. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme phytase Từ đồ thị cho thấy, cả 3 chủng A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 có pH tối ưu cho hoạt tính phytase cao là 2,5 và 5,0-5,5. Hầu hết enzym phytase từ vi sinh vật thể hiện pH tối ưu giữa 4,5 và 5,5, đặc biệt đối với phytase từ nấm mốc [10,11]. Tính chất này rất cần thiết trong các ứng dụng công nghiệp v à phù hợp với điều kiện trong dạ dày (pH 2,0-4,0) và ruột non (pH 4,0-6,0) của động vật [9]. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Nhieät ñoä (ñoä C) H oa ït tín h to ång U t (U /g m aãu ) A.niger NRRL-363 A.oryzae A.MR2 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Nhieät ñoä (ñoä C) H oa ït tín h ri eân g U s (U /m g m aãu ) A.niger NRRL-363 A.oryzae A.MR2 Hình 7a. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính tổng của enzym phytase của A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 Hình 7b. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính tổng của enzym phytase của A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 Hình 8a. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính tổng enzym phytase chủng A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 pH H oa ït tín h ri eân g U s (U /m g m aãu ) A.niger NRRL-363 A.oryzae A.MR2 0 50 100 150 200 250 300 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 pH H oa ït tín h to ång U t (U /g m aãu ) A.niger NRRL-363 A.oryzae A.MR2 Hình 8b. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính tổng enzym phytase chủng A.niger NRRL-363, A.oryzae, A.MR2 Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 241 Hình 9: Phân tích enzym phytase trên gel polyacrylamide b ằng phương pháp điện di SDS PAGE. 5. Phân tích enzyme phytase trên gel polyacrylamide Mục đích cuả thí nghiệm nhằm xác định một số th ành phần protein có trong dịch chiết enzym phytase của ba chủng A.niger NRRL-363, A.oryzae, Aspergillus MR2. Kết quả xác định được trình bày ở hình 9 dưới đây: Band 1: chứa các protein marker có trọng l ượng phân tử là 200.000, 116.250, 97.400, 66.200, 45.000, 31.000, 21.500, 14.400, 6.500 Daltons. Band 2: m ẫu đối chứng (control). Band 3: dịch chiết enzym thô của A.or yzae chứa các protein có trong lượng phân tử là 97.400, 89.200 và 58.000 Daltons. Band 4: d ịch chiết enzym thô của A.MR2 chứa các protein có trong lượng phân tử là 97.400, 89.200 và 58.000 Daltons. Band 5: dịch chiết enzym thô của A.niger NRRL -363 chứa các protein có trong lượng phân tử là 116.250, 97.400, 89.200 và 58.000 Daltons. Phytase t ừ các chủng A.niger có hai loại l à PhyA và PhyB. PhyA có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 66 -128 kDa. PhyB có trọng lượng phân tử khoảng 58-65 kDa [2]. Phytase từ các chủng A.oryzae cũng cho hai loại phytase là PhyA và PhyB. PhyA có trọng lượng phân tử khoảng 65-120 kDa. PhyB có trọng lượng phân tử khoảng 58 kDa [19]. Qua kết quả phân tích enzym phytase sinh tổng hợp từ các chủng A.niger NRRL -363, A.oryzae, A.MR2 trên gel polyacrylamide bằng phương pháp SDS - PAGE, các band protein xuất hiện tương đối rõ trong vùng kích thước của phytase so với kết quả nghi ên cứu trước [2,19]. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Thị Tuyết (2003). Thu nhận v à khảo sát enzym phytase của nấm Asperg illus niger NRRL-363 trong môi trường lên men bán rắn. Khóa luận Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM, 5-27. 2. Mullaney E. J. and Ullah A. H. J. (2003). The term phytase comprises serveral different classes of enzymes. Biochemical and Biophysical Researc h Communications 312 , 197-184. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007242 3. Barbara, George Szakacs, Ashok Pandey, Sabu Abdulhameed, James C. Linden, và Robert P. Tengerdy (2003). Production of phytase by mucor racemosus in solid - state fermentation. Biotechnol Prog. 19 (2), 312 -319. 4. Wodzinski R. J. and Ullah A. H. J. (1996). Phytase. Advances in Applied Microbiology, vol 42, 263-298. 5. Lei X. G. and Porres J. M. (2003). Phytase enzymology, applications, and biotechnology. Biotechnology Letters, 25 (21), 1787 -1794. 6. Oh B. C., Choi W.-C., Park S., Kim Y.-O., Oh T.-K. (2004). Biochemical properties and substrate specificities of alkaline and histidine acid phytases. Appl Microbiol Biotechnology , 63 (4), 362 -372. 7. Zimmermann B., Lantzsch H.-J., Langbein U. and Drochner W. (2002). Determination of Phytase activity in cereal grains by direct incubation, J Anim Physiol Anim Nutr (Berl), 86 (9 -10), 374-352. 8. Bogar B., Szakacs G., Linden J. C., Pandey A. and Tengerdy R. P. (2003). Optimization of phytase production by solid substrate fermentation. J Ind Microbiol Biotechnol., 30 (3), 183-189. 9. Casey A. and Walsh G. (2003). Purification and characterization of extracellular phytase from Aspergillus niger ATCC 9142. Bioresour Technol, 86 (2), 183 -188. 10. Vohra A. and Satyanarayana T. (2003). Phytases: Microbial Sou rces, Production, Purification, and Potential Biotechnological Applications. Critical Reviews in Biotechnology, 23 (1), 29-60. 11. Kerovuo J. (2000). A Novel Phytase from Bacillus. Characterization and Production of the Enzyme, 1-66. 12. McKee T. and McKee J. R. (1999). An Introduction to Chemical Biology. Biochemistry, vol 2. 13. Daniel M. Bollag, Michael D. Rozycki và Stuart J. Edelstein (1996). Protein Methods. Wiley, Chichester. 14. Nagashima T., Tange T., and Anazawa H. (1999). Dephosphorylation of Phytate by Using the Aspergillus niger Phytase with a High Affinity for Phytate. Appl Environ Microbiol, 65 (10), 4682-4684. 15. Budy J. Hidayat, Niels T. Eriksen and Marylin G. Wiebe (2006). Acid photphatase production by Aspergillus niger N402A in continuous flow culture. Federation of European Microbiologycal Societ8ies Microbioal Lett , vol 254, 324 -321. 16. Chantasartrasamee K, Duangnetre Israngkul Na Ayuthaya, Sunthum Intarareugsorn, Saovanee Dharmsthiti (2004). Phytase activity from Aspergillus oryzae AK9 cultivated on solid state soybean meal medium. Process Biochemistry, 1 -5. 17. Shieh T. R. and Ware J. H. (1968). Survey of microorganisms for production of extracellular phytase. Applied Microbiology, 16 (9), 1348 -1351. 18. Howson S. J. and Davis R. P. (1983). Production of Phy tase – hydrolysing enzyme by some fungi. Enzyme Microbiol Technol., 5, 377 -382. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 243 19. Fujita J., Seiko Shigeta, Yu-Ichi Yamane, hisashi Fukuda, Yasuzo Kizaki, Saburo Wakabayashi, and Kazuhisa Ono (2003). Production of two phytase from Aspergillus oryzae during industrial Koji making. Journal of Bioscience and Bioengineering, 95 (5), 460-464. 20. Wyss M, Brugger R, Kronenberger A, Rémy R, Fimbel R, Oesterhelt G, Lehmann M, and Van Loon A. P. G. M. (1999). Biochemical Characterization of fungal phytases (myo-Inositol hexakisphophate phosphohydrolases): catalytic properties, 65 (2), 367-373. SUMMARY Isolation and investigation of phytase from A spergillus in solid-state fermentation Nguyen Duy Long, Nguyen Thi My Hanh, Hoang Quoc Khanh Institute of Tropical Biology Phytases are acid phosphatase enzymes have been found as a supplement to increase not only the growth rate of monogastric animals but also the efficiency of phosphate utilization in feeds, which significantly reduces phosphorus excretion effect to environmental pollutants. In this study, phytases are extracted from Aspergillus species are isolated from original raw material of fermented glutinous rice. Three species A.MCR2, A.MR2, A.MR5 are found with a high positive of phytase activity. The effects of pH and temperature conditionals are researched and compared with others species of Aspergillus genus. Phytases are also assayed on polyacrylamide gel by SDS-PAGE method and the results appearing with 65 kDa and 58 kDa respective to phyA and phyB from A.MR2. Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007244 TỐI ƯU HOÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP enzyme cellulase CỦA Tricoderma reesei TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN Trần Thạnh Phong, Hoàng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Nguyễn Duy Long, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới MỞ ĐẦU Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống Trichoderma, Aspergillus, Pinicillium, …Trong đó hai giống nấm sợi là Trichoderma và Aspergillus đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất cellulase (Bothast & Saha, 1997). Cellulase là enzym đa c ấu tử gồm: exoglucanase hay C 1 (EC 3.2.1.91), endoglucanase hay Cx (EC 3.2.1.4) và -glucosidase (EC 3.2.1.21), hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành glucose. Cellulase được ứng dụng để bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm; chế biến thực phẩm; trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc; đ ường hóa các phế liệu giàu cellulose để sản xuất ethanol. Việt Nam có lượng phụ phế liệu nông nghiệp thải ra rất dồi d ào, trong đó lượng bã mía thải ra từ các nhà máy đường chiếm khoảng 20% mía nguyên liệu, trong bã mía có hàm lượng cellulose khoảng 50% và hemicellulose khoảng 25% nên có thể sử dụng như nguồn carbon để cảm ứng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nấm sợi:Chủng T. reesei VTT-D-80133 nhận được từ bảo tàng giống Roal Oy, Phần Lan. Cơ chất: Bã mía và cám mì. Xác định hoạt tính các enzym: Carboxymethyl cellulase (CMCase), FPU (Filter Paper Unit), xylanase, α-amylase, protease. Thủy phân giấy: cho dịch enzym cellulase (5 FPU/ml) vào giấy xay nhỏ (10%) ủ ở 500C, pH 5 trong 24 giờ. Hiệu suất (%) = lượng đường khử (g)*0,9*(100/lượng giấy in (g)) Ñieän di protein: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel (SDS -PAGE) ñö ôïc thö ïc hieän treân gel ñö ùng chö ùa 10% (w/v) polyacrylamide. Tối ưu hóa thành phần môi trường: Tỷ lệ BM: CM, độ ẩm, nồng độ dinh dưỡng và thời gian nuôi cấy là 4 yếu tố có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của T. reesei nên được tối ưu theo phương pháp quy ho ạch thực nghiệm. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả tối ưu hóa thành phần môi trường và các điều kiện nuôi cấy. Phần II: CÔNG NGHỆ VI SINH 245 Các kết quả thí nghiệm trước đây, chúng tôi đã xác định được thành phần môi trường cơ sở cho chủng T. reesei VTT-D-80133 sinh ra cellulase: tỷ lệ BM: CM (4:6), độ ẩm ban đầu 54%, 5 lần nồng độ dinh dưỡng, thời gian nuôi ủ 7 ngày, tỷ lệ giống 6x106 bào tử/g môi trường, hoạt tính cellulase đạt đ ược là 251,43 IU/g. Tuy nhiên, thành phần môi trường và các điều kiện nuôi cấy mới chỉ được nghiên cứu ảnh hưởng ở mức độ riêng rẽ. Trong năm yếu tố trên thì bốn yếu tố là tỷ lệ BM:CM, độ ẩm ban đầu, nồng độ dinh d ưỡng và thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của T. reesei VTT-D-80133 nên được chọn để nghiên cứu tối ưu hóa theo phương pháp qui ho ạch thực n