Báo cáo Phương pháp kiểm định vi sinh trong thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 1 BÁO CÁO PHƢƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH VI SINH TRONG THỰC PHẨM I. Giới thiệu Ngộ độc thực phẩm ở các nƣớc đang phát triển hiện đang ở mức báo động. Đặc biệt tình trạng ngộ độc tập thể đang ngày càng có xu hƣớng gia tăng. Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng ngộ độc thực phẩm, chiếm 55,8% trong số đó là đến từ các loài vi sinh vật nhƣ Staphylococcus aureus, Coliform, E. Coli… Chỉ tính riêng ở Việt Nam, hàng năm tổn thất do ngộ độc thực phẩm lên đến 30 tỷ đồng. Nắm bắt đƣợc tình hình thực tế, trong tuần tháng 5 vừa qua ( từ 16/05 đến 21/05/2011) khoa Sinh học đã tiến hành cho sinh viên thực nghiệm về các phƣơng pháp để kiểm định vi sinh trong thực phẩm nhằm giúp sinh viên thực hành các phƣơng pháp kiểm định và gia tăng kiến thức trong quá trình tiếp cận với các phƣơng pháp thực tế. II. Mẫu thực phẩm 1. Tên mẫu: thịt heo tƣơi 2. Ngày thu: 16/05/2011 3. Nơi thu: Khu chợ- ĐHKHXH & NV III. Tiêu chuẩn kiểm nghiệm: TCVN 7046 : 2002 Thịt tƣơi- quy định kỹ thuật IV. Kết quả kiểm định 1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1(g) mẫu (TPC) 1.1. Quy trình định lượng TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 2 1.2. Kết quả đếm khuẩn lạc Độ pha loãng F Số khuẩn lạc N ( CFU) 10 -4 >300 10 -5 >300 10 -6 323 và 358 1.3. Kết luận - Kết quả: Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 1 (g) mẫu lớn hơn 3x106 CFU/g TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 3 - Kết luận: Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 1 (g) mẫu vƣợt tiêu chuẩn cho phép của tiêu chuẩn Việt Nam (10 6 CFU/g) 1.4. Mở rộng - Phƣơng pháp đổ đĩa đếm khuẩn lạc là một phƣơng pháp khá phổ biến và đƣợc sử dụng rộng rãi để định lƣợng vi sinh vật, cụ thể ở đây là định lƣợng vi sinh vật hiếu khí có trong mẫu thực phẩm. Trong bài thực tập mẫu đƣợc tiến hành pha loãng lên đến 10 -4 , 10 -5 , 10 -6 đƣợc xem là nồng độ tƣơng đối loãng để tiến hành nuôi cấy trong môi trƣờng PCA. Kết quả khi đếm khuẩn lạc đều lớn hơn 300. Từ đó ta thấy mẫu thịt tƣơi đã nhiễm rất nhiều vi sinh vật hiếu khí. Nhiều chủng loại khác nhau. - Về cơ bản thịt tƣơi là một thực phẩm khá dễ bị nhiễm vi sinh vật vì nó có đầy đủ phẩm chất giúp vi sinh vật tồn tại và phát triển nhƣ t 0 , pH, độ nƣớc, thành phầm dinh dƣỡng…Quá trình nhiễm có thể do chế biến, gia nhiệt chƣa tới hạn, nhiễm từ các dụng cụ chế biến, vật chứa hoặc từ không khí, đất. - Giải pháp: Cần giữ sạch sẽ trong quá trình chế biến thịt tƣơi. Không dùng các thiết bị bẩn để đựng thịt, vùng chế biến phải thoáng, tránh xa cống rãnh hoặc vùng rác thải. Xử lý sạch những phế phẩm không dùng đến. Quá trình bảo quản và vận chuyển phải giữ nhiệt độ đúng theo yêu cầu để tránh ảnh hƣởng đến chất lƣợng thịt tƣơi. Hình 1: Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong môi trƣờng PCA ở nồng độ 10 -6 2. Coliform tổng số trong 1 (g) mẫu (C) 2.1. Quy trình định lượng TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 4 2.2. Kết quả đếm khuẩn lạc và ống sinh hơi Độ pha loãng F Số khuẩn lạc N ( CFU) 10 -4 50 và 15 - Số đĩa pha loãng mỗi nồng độ: n= 2 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 5 - Thể tích cấy vào đĩa: V=1ml - Tỷ lệ xác nhận: R= số khuẩn lạc sinh hơi trong ống BGBL/tổng số khuẩn lạc đem đi cấy=1 ( cả năm ống đều sinh hơi) N x R N x V x F C = 32,5 x 10 4 ( CFU/g) 2.3. Kết luận - Coliform tổng số / g trong mẫu thịt tƣơi là 32,5 x 104 CFU/g - Kết luận: Coliform tổng số trong 1(g) mẫu vƣợt tiêu chuẩn cho phép theo TCVN 10 2 CFU 2.4. Mở rộng - Môi trƣờng VRB không hấp vô trùng nhƣ những môi trƣờng khác, mà đƣợc cân vô trùng. Đun trong lò vi ba cho tan hết và giữ nhiệt ở 45 0 C. - Môi trƣờng BGLB Mật bò bile) và brilliant green ức chế hầu hết các vi khuẩn gram và vi khuẩn gram– không phải Coliform. Brilliant green có nồng độ đặc hiệu nhằm ngăn vi khuẩn kị khí lên men lactose sinh trƣởng ở 44 0 C , Tránh đƣợc hiện tƣợng dƣơng giả, lúc này Coliform phát triển làm đục môi trƣờng và sinh khí trong ống durham do lên men lactose. - Vì đặc tính của nhóm Coliform là có khả năng lên men lactose và sinh hơi trong môi trƣờng nuôi cấy lỏng. Do đó trong quá trình định lƣợng Coliform tổng số ta sử dụng môi trƣờng BGBL để quan sát khả năng sinh hơi của Coliform từ đó khẳng định có xuất hiện Coliform trong mẫu. Trong bài thực tập này kết quả cho ta thấy 5 ống BGBL có cấy khuẩn lạc Coliform đều sinh hơi. - Coliform có thể đƣợc xem là vi sinh vật chỉ thị bởi vì số lƣợng của chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong thực phẩm. Sự hiện diện Coliform trong mẫu thịt tƣơi là khá lớn điều đó có thể cho thấy sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác trong mẫu thịt tƣơi là khá lớn. - Khuẩn lạc có màu đỏ hoặc đỏ đậm do màu của môi trƣờng và thêm tủa quầng muối mật có trong môi trƣờng. TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 6 Hình 2: Khuẩn lạc Coliform trong môi trƣờng VRB 3. Quy trình định tính Escherichia Coli giả định 3.1. Quy trình định tính TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 7 3.2. Kết luận - Kết quả: Phản ứng thử Indol dƣơng tính. Xuất hiện vòng màu hồng trên mặt dung dịch. - Kết luận: Phát hiện E. Coli giả định trong 1(g) mẫu. TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 8 3.3. Mở rộng - Thuốc thử sử dụng trong phản ứng Indol là Kovac’s. Cơ chất chính tham gia phát hiện Indol trong môi trƣờng nuôi cấy là p-dimethyaminobanzaldehyde. Chất này phản ứng với indol tạo thành phức hợp màu đỏ do nhân pyrol của indol phản ứng với nhóm ahdehyde của DMAB tạo thành nhân quinone có màu đỏ. - E.coli đƣợc xem nhƣ là vi sinh vật chỉ thị trong môi trƣờng ô nhiễm phân hay chất thải. Ngƣời ta thƣờng xác định sự hiện diện của E.coli để kiểm tra xem mẫu thực phẩm có bị nhiễm bẩn từ môi trƣờng hay thông qua nguồn nƣớc hay không. 4. Quy trình định lượng Staphylococcus aureus 4.1. Quy trình định lượng TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 9 4.2. Kết quả Độ pha loãng F Số khuẩn lạc N (CFU) 10 -3 21 và 14 - Số ống huyết tƣơng đông tụ 4 - Tỷ lệ xác nhận: R= Số khuẩn lạc đông tụ huyết tƣơng/ tổng số khuẩn lạc cấy = 4/5 N x R N x V x F C = 14 x 10 3 (CFU/g) 4.3. Kết luận - Staphylococcus aureus có trong 1 (g) mẫu là 14 x 103 CFU/g - Kết luận: Staphylococcus aureus trong 1 (g) mẫu vƣợt quá tiêu chuẩn cho phép của TCVN: 10 2 CFU/g 4.4. Mở rộng - Thành phần môi trƣờng BPA có lithium chloride và tellurite có tác dụng ức chế các quần thể vi khuẩn thƣờng hiện diện cùng Staphylococcus trong khi đó pyruvate và glycine kích thích sự phát triển của Staphylococcus. Khuẩn lạc Staphylococcus có hai đặc điểm: Khuẩn lạc có màu đen do khử telurite thành telurium, dạng lồi và tạo vòng trong xung quanh khuẩn lạc,đƣờng kính từ 2 – 5 mm do sự thủy phân protein. Sau đó có thể xuất hiện 1 vòng đục ở trong vòng trong có tác động của lecithinase, một loại lipase). Đây là một đặc tính thƣờng thấy và có tính chuyên biệt ở các tụ cầu khuẩn gây bệnh. - Coagulase là enzyme đƣợc tạo bởi S.aureus, là enzyme liên quan đến khả năng bền nhiệt, có thể bền đến 60 0 C trong 30 phút. Enzyme này là một protein tự nhiên, đƣợc S.aureus tiết ra ngoài tế bào, dễ bị bất hoạt bởi các protease. Coagulase đóng vai trò đông tụ huyết tƣơng, chúng kết hợp với các cấu tử trong huyết tƣơng thành từng khối hay từng cục. Ứng dụng nguyên tắc này ngƣời ta sử dụng huyết tƣơng thỏ để tiến hành phản ứng định lƣợng Staphylococcus aureus. - Sự hiện diện mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ của quá trình chế biến rất kém. TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 10 Hình 3: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 11 5. Định tính Samonella trong 25 (g) mẫu 5.1. Quy trình định tính TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 12 5.2. Kết quả  Thử nghiệm KIA: - Đối chứng: Trên đỏ dƣới vàng, có vệt đen và nứt thạch - Mẫu: Không đổi màu môi trƣờng màu đỏ), không nứt thạch và không xuất hiện vệt đen.  Thử nghiệm LDC: - Đối chứng: Môi trƣờng LDC giữ nguyên màu tím (+) - Mẫu: Môi trƣờng LDC giữ nguyên màu tím (+)  Thử nghiệm Manitol Phenol Red Broth: - Đối chứng: Môi trƣờng chuyển từ màu đỏ sang vàng (+) - Mẫu: Môi trƣờng giữ nguyên màu đỏ (-)  Thử nghiệm Urea Broth: - Đối chứng: Môi trƣờng giữ nguyên màu hồng nhạt (-) - Mẫu: Môi trƣờng giữ nguyên màu hồng nhạt (-)  Thử nghiệm Canh Trypton: - Đối chứng: Không xuất hiện vòng màu hồng (-) - Mẫu: Không xuất hiện vòng màu hồng (-)  Kết luận: Không phát hiện Samonella trong 25 (g) mẫu. 5.3. Mở rộng Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhƣng không lên men saccharose và lactose, không sinh Indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S. Salmonella có thể phân tích định tính bằng mộ quy trình gồm 4 bƣớc: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thƣờng có mặt trong mẫu với số lƣợng nhỏ, bị tổn thƣơng và cùng hiện diện chung với một số lƣợng lớn với các loài vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trƣởng của Salmonella. Vì trong môi trƣờng KIA lƣợng đƣờng chỉ chiếm 1% lactose và 0,1% glucose và thuốc thử phenol red. Do đó sau khi lên men glucose hết Samonella bắt đầu sử dụng đến pepton trong môi trƣờng, quá trình trao đồi này làm giải phóng NH3, làm kiềm hóa môi trƣờng do đó phần nghiêng có màu đỏ. Ở phần sâu của môi trƣờng có pH acid bởi sự lên TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 13 men kỵ khí glucose, các sản phẩm thu đƣợc là acid hữu cơ, do đó làm cho môi trƣờng chuyển thành màu vàng. Khi enzyme lisine decarboxylase tác động lên amino acid L- lisin và khử nhóm carboxyl, chúng tạo thành một amin và CO2 làm kiềm hóa môi trƣờng. Tiến hành thử phản ứng LDC để xác định khả năng tổng hợp enzyme khử nhóm carboxyl hay tách hydrogen từ các acid amin. Nếu sau khi nuôi cấy môi trƣờng chuyển màu vàng là âm tính, giữ nguyên màu ban đầu là dƣơng tính. Từ kết quả trên ta có thể thấy Samonella là vi sinh vật có thể tổng hợp nhóm enzyme khử nhóm carboxyl hoặc tách hydrogen từ acid amin khi môi trƣờng giữ nguyên màu tím (+) Vi khuẩn Samonella có khả năng lên men đƣờng manitol sinh acid khi có thuốc thử phenol red sẽ làm môi trƣờng chuyển từ đỏ sang vàng. Samonella có khả năng lên men đƣờng manitol do đó môi trƣờng ở ống đối chứng chuyển từ đỏ sang vàng. Emzyme urease là một enzyme quan trọng trong tế bào vi sinh vật. Khi có cơ chất urea hiện diện trong môi trƣờng, enzyme này đƣợc tổng hợp và phóng thích ra bên ngoài tế bào xúc tác phản ứng thủy giải urea. Sản phẩm sau phản ứng làm cho môi trƣờng hóa kiềm chuyển sang màu đỏ. Samonella không có khả năng sinh enzyme urease phân giải ure do đó môi trƣờng giữ nguyên màu. Tryptophan là một aminoacid có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật nhất định tạo hợp chất indol. Sự tách amin từ tryptophan là một phản ứng khử. Qua quá trình này nhóm amin đƣợc tách ra và chuyển thành NH3. DMAB trong môi trƣờng nuôi cấy phản ứng với indol tạo màu đò. Samonella không có khả năng tách nhóm amin từ tryptophan vì vậy không sinh indol. Phản ứng thử indol âm tính (-) không phát sinh vòng màu đỏ. Hình 3: Hình dạng khuẩn lạc Samonella TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 14 Mục lục: I. Giới thiệu ........................................................................................................................... 1 II. Mẫu thực phẩm.................................................................................................................. 1 1. Tên mẫu: thịt heo tƣơi.................................................................................................... 1 2. Ngày thu: 16/05/2011 .................................................................................................... 1 3. Nơi thu: Khu chợ- ĐHKHXH & NV............................................................................. 1 III. Tiêu chuẩn kiểm nghiệm: .............................................................................................. 1 IV. Kết quả kiểm định .......................................................................................................... 1 1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1(g) mẫu (TPC) ................................ 1 1.1. Quy trình định lƣợng ............................................................................................... 1 1.2. Kết quả đếm khuẩn lạc ............................................................................................ 2 1.3. Kết luận ................................................................................................................... 2 1.4. Mở rộng ................................................................................................................... 3 2. Coliform tổng số trong 1 (g) mẫu (C)............................................................................ 3 2.1. Quy trình định lƣợng ............................................................................................... 3 2.2. Kết quả đếm khuẩn lạc và ống sinh hơi .................................................................. 4 2.3. Kết luận ................................................................................................................... 5 2.4. Mở rộng ................................................................................................................... 5 3. Quy trình định tính Escherichia Coli giả định ............................................................... 6 3.1. Quy trình định tính .................................................................................................. 6 3.2. Kết luận ................................................................................................................... 7 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 15 3.3. Mở rộng ................................................................................................................... 8 4. Quy trình định lƣợng Staphylococcus aureus ................................................................ 8 4.1. Quy trình định lƣợng ............................................................................................... 8 4.2. Kết quả .................................................................................................................... 9 4.3. Kết luận ................................................................................................................... 9 4.4. Mở rộng ................................................................................................................... 9 5. Định tính Samonella trong 25 (g) mẫu ........................................................................ 11 5.1. Quy trình định tính ................................................................................................ 11 5.2. Kết quả .................................................................................................................. 12 5.3. Mở rộng ................................................................................................................. 12 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM KHOA SINH HỌC BỘ MÔN PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM VŨ THÙY LINH 0715174 16