Báo cáo Thực tập tại công ty cổ phần sữa Việt Nam, nhà máy nước giải khát Vfresh

kiểm tra các chỉ tiêu. Tuy nhiên nếu sau khi kiểm tra nhận thấy mật độ vi sinh vật quá cao thì cần phải pha loãng (thường thì mật độ vi sinh vật trong bán thành phẩm không quá cao (các nguyên liệu đã kiểm tra, đạt chất lượng mới đem đi phối trộn nên mật độ vi sinh không quá cao, không cần thiết phải pha loãng). - Trực tiếp sử dụng các sản phẩm đã đóng gói cuối cùng trước khi đêm đi tiêu thụ để kiểm tra chất lượng. Các mẫu lấy thường không cần phải pha loãng vì mật độ vi sinh vật không nhiều (thường không có) do đã qua thiết bị tiệt trùng UHT. 3.3.1.2.3 Kiểm tra môi trường, thiết bị, Lấy mẫu không khí xung quanh khu vực sản xuất bằng 1 dụng cụ thủy tinh có nắp đậy đặt gàn khu các khu vực cần kiểm tra ( khu vực phối trộn, đóng gói, khu chứa nguyên liệu…) sau đó đậy nắm đem về phòng vi sinh. Dùng nước muối sinh lý tráng đều dụng cụ sau đó đi phân tích. Nếu mật đọ vi sinh vật qua cao thì phải pha loãng theo MNP. 3.3.1.2.4 Thiết bị, bao bì, công nhân: Sử dụng que stick vô trùng trên đầu có quấn bong gòn quét đều trong long ống dẫn của các thiết bị sau đó đem đi pha loãng theo MPN. Sử dụng làm que cấy để cấy rải trên đĩa petri. Làm tương tự với tay và quần áo công nhân Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 19 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến Bao bị cho chạy qua máy đóng gói nhưng không cho sản phẩm vào (chứa không khí) đã qua hệ thống tiệt trùng UHT. Sử dụng nước muối để tráng đều bao bì, sau đó đem đi làm mẫu phân tích. 3.3.1.2.5 Nước thải: Dùng chai thủy tinh có nắm để lấy mẫu nước trước và sau khi qua hệ thống xử lý nước thải. Đem pha loãng mẫu để kiểm tra vi sinh. 3.2.3 Các bước chuẩn bị môi trường - dung dịch pha loãng: - Pha môi trường theo hướng dẫn trên nhãn của mỗi loại môi trường. - Tính số lượng mẫu để cân đối môi trường cần pha - Cân và pha môi trường với nước cất vào các lọ 250mL để pha lõang mẫu. - Các đầu pipetman rửa sạch, sấy khô cho vào ca Inox và đậy kín nắp. Chỉ sử dụng các đầu pipetman có đầu còn nguyên vẹn. - Bông gòn để kiểm tra tay công nhân, thiết bị, thùng tole được cắt nhỏ, vửa dùng, thấm nước, vắt khô rồi cho vào đĩa petri, gói giấy. - Tất cả được tiệt trùng bằng Autoclave ở 1210C – 1 atm trong 20 phút. - Sau khi tiệt trùng cho môi trường vào bể điều nhiệt ở 450C – 500C đối với môi trường dùng liền. Nếu môi trường chưa dùng liền để nguội cho vào tủ lạnh, khi dùng đem đun cách thủy cho đến khi thạch tan hòan tòan, làm nguội đến 450C - 500C trước khi sử dụng. - Đối với nước cất pha lõang mẫu sau khi tiệt trùng phải cho nhiệt độ hạ xuống bằng nhiệt độ của mẫu thử để tránh làm ảnh hưởng đến các vi sinh vật do thay đội nhiệt độ đột ngột. 3.2.4 Chuẩn bị mẫu cấy: - Sắp xếp mẫu theo thứ tự thời gian, độ sạch đến dơ; bán thành phẩm theo thứ tự số thùng, từ mẫu sạch đến dơ; nguyên liệu theo thứ tự ngày nhập và độ sạch đến dơ. - Sắp xếp các lon mẫu, lọ mẫu theo thứ tự, ghi tên mẫu trên lọ mẫu - Sắp xếp các đĩa petri và ghi ký hiệu mẫu trên đĩa petri theo thứ tự - Vệ sinh phòng, bật đèn cực tím để thanh trùng phòng trong 30 phút Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 20 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Cân mẫu, trộn mẫu thật kỹ sao cho các vi sinh vật phân bố đều trong lọ chứa mẫu. Tránh tạo bọt và để bọt tan hết. Khỏang thời gian từ khi trộn đến khi lấy phần mẫu để thử không vượt quá 3 phút. - Tiến hành cấy mẫu theo các hướng dẫn công việc tương ứng. 3.2.5 Cấy mẫu phân tích các chỉ tiêu: Tùy thuộc vào mỗi mẫu cần phân tích, các chỉ tiêu khác nhau mà sử dụng các phương pháp cấy mẫu khác nhau. Chi tiết sẽ được trình bày ở phần kế tiếp. 3.2.6 Tính và xử lý kết quả - Tùy thuộc vào phương pháp sử dụng mà ta có cách đọc kết quả riêng sau ( số lượng khuẩn lạc, độ đục, bọt khí, đổi màu chất chỉ thị...) - Xử lý kết quả:  Thường thì các mẫu phân tích tại nhà máy la đếm số lượng khuẩn lạc và lấy đó làm kết quả để kết luận rằng các mẫu nguyên liệu, bán thành phẩm hoặc thành phẩm có đạt yêu cầu chất lượng không.  Nếu sản phẩm đạt thì cho xuất xưởng, nếu chưa đạt thì kiểm tra lại lần 2, lần 3(đồng thời kiểm tra lại mẫu nguyên liệu cũng nhue bán thành phẩm xem đã bị nhiểm vi sinh ở khâu nào, nếu vẫn chưa đạt thi đem đi tái chết hoặc tiêu hủy nguyên lô. Đối với nguyên liệu nếu không đạt thì trả lại cho nhà cung cấp.  Vì một số yêu cầu tính bảo mật của công ty nên em không trình bày kết quả cụ thể của các mẫu đã tham gia đánh giá chất lượng cũng như chỉ tiêu riêng của nhà máy đặt ra để đánh giá chất lượng. Em xin dẫn nguồn số liệu từ tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6213:2004 để tạm đánh giá chất lượng của các sản phẩm phân tích xem có đạt kết quả không (các chỉ tiêu riêng được áp dụng tại nhà máy luôn nhỏ hơn so với số liệu cho phép của TCVN 6213:2004). Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 21 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4 Các phương pháp phân tích Tùy thuộc vào mỗi loại vi sinh vật mà ta có phương pháp phân tích riêng. Tuy nhiên tất cả đều tuân theo quy trình chung như sau: Ñoàng nhaát maãu 10g maãu + 90ml dd pha loãng Pha loaõng 10-2, 10-3, 10-4… Caáy maãu UÛ maãu Ñoïc keát quaû Keát luaän Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 22 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.1 Tổng VSV hiếu khí 3.4.1.1 Phương pháp Phương pháp kiểm nghiệm tổng số vi khuẩn hiếu khí theo Iso 5511-1992 3.4.1.2 Phạm vi áp dụng Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí trong sữa và sản phẩm sữa. 3.4.1.3 Thiết bị và dụng cụ - Máy đếm khuẩn lạc - Autoclave - Tủ sấy dụng cụ duy trì ở 1700C – 1750C - Tủ ấm cài đặt 300C±10C - Cân phân tích - Bể điều nhiệt 450C – 500C - Đĩa petri 90 – 100mm - Các thiết bị thông thường của phòng vi sinh đã tiệt trùng. 3.4.1.4 Môi trường và thuốc thử - Plate count agar 3.4.1.5 Quy trình phân tích - Cân 25g mẫu vào bình chứa 225mL nước cất vô trùng, lắc cho mẫu tan hòan toàn. - Lấy 2 đĩa petri, dùng pipetman vô trùng cho vào mỗi đĩa 1 mL mẫu thử. - Nếu cần, thực hiện tương tự với các nồng độ pha lõang tiếp theo, mỗi độ pha loãng dùng 1 pipette riêng biệt. - Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 12 – 15ml môi trường Plate count agar (đã giữ ở 450C – 500C trong bể điều nhiệt), xoay nhẹ đĩa theo kim đồng hồ và ngược lại để hòa tan mẫu vào môi trường. Để môi trường đông đặc tự nhiên. - Thời gian hoàn tất 1 mẫu không quá 15 phút. - Lật úp và ủ các đĩa vào tủ ấm ở nhiệt độ 300C±10C trong 72 giờ ± 3 giờ. Không chồng quá 6 đĩa lên nhau. Để các chồng đĩa tách xa hẳn nhau cũng như xa thành và xa nóc tủ ấm. - Đếm số khuẩn lạc ở các đĩa petri. Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu, tránh lẫn lộn các hạt nhỏ không tan hoặc các chất kết tủa trong đĩa với khuẩn lạc nhỏ. Kiểm tra thật kỹ các đốm còn nghi ngờ để phân biệt khuẩn lạc với các chất lạ. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 23 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến Những khuẩn lạc mọc lan rộng được tính là những khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu các khuẩn lạc mọc lan rộng nhưng ít hơn ¼ bề mặt đĩa thì đếm những khuẩn lạc trên phần còn lại của đĩa và tính số lượng tương ứng cho toàn đĩa. Nếu lan rộng hơn ¼ bề mặt thì loại bỏ đĩa đó. - Chỉ các đĩa có ít nhất 10 khuẩn lạc, nhiều nhất 300 khuẩn lạc. - Thực hiện đĩa đối chứng để kiểm tra độ vô trùng. 3.4.1.6 Tính kết quả Trong đó: Σ c : tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại. n1: số đĩa của độ pha lõang thứ nhất n2: số đĩa của độ pha lõang thứ hai d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất. 3.4.2 Nấm men nấm mốc 3.4.2.1 Phương pháp Xác định đơn vị khuẩn lạc nấm men hoặc mốc bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ủ ở nhiệt độ 250C theo 6611 – 2004 3.4.2.2 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) từ nấm men và/hoặc nấm mốc trong sữa và sản phẩm sữa bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 250C. 3.4.2.3 Thiết bị và dụng cụ - Nồi hấp tiệt trùng - Tủ nuôi ủ ở nhiệt độ 250C ± 10C - Bếp cách thủy điều chỉnh được nhiệt độ 450C ±10C . - Máy đo pH (hiệu Meter 310) - Các dụng cụ thông thường của PTN vi sinh. 3.4.2.4 Môi trường và thuốc thử - Chất pha loãng canh thang pepton - Môi trường DBRC Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 24 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.2.5 Quy trình phân tích - Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch pha lõang ban đầu, và các dung dịch pha loãng thập Phân. - Dùng 1 pipet vô trùng cấy vào dĩa petri vô trùng, mỗi dĩa 1mL mẫu thử nếu là dạng lỏng hoặc 1mL chất huyền phù ban đầu nếu là sản phẩm dạng khác. - Nếu cần, dùng 1 pipette vô trùng khác cấy vào 2 dĩa petri vô trùng khác mỗi dĩa 1mL dung dịch pha lõang 10-1 (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 1mL dung dịch pha loãng 10-2(sản phẩm dạng khác). - Nếu cần, lặp lại thao tác này cho các nồng độ pha loãng tiếp theo. - Rót vào mỗi dĩa petri khoảng 15mL môi trường thạch dextroza chứa oxitetraxicline hoặc môi trường chứa chloramphenicol (đã chuẩn bị trước và giữ ở 450C trong nồi hấp cách thủy). - Khuấy trộn kỹ mẫu với môi trường bằng cách xoay dĩa petri và để cho hỗn hợp đông đặc trên mặt phẳng ngang, mát. - Thời gian từ khi chuẩn bị dịch pha loãng thứ nhất đến khi trộn chất nuôi cấy với môi trường không vượt quá 15 phút. - Thực hiện mẫu đối chứng để kiểm tra độ vô trùng. - Ủ các đĩa vào tủ ấm 4 ngày ở nhiệt độ 250C. • Để tránh hiện tượng mọc lan, cần phủ thêm một lớp môi trường nuôi cấy lên trên mặt các dĩa đã cấy sau khi đã đông đặc . - Không chồng quá 6 dĩa lên nhau, để các dĩa xa thành và nóc tủ. 3.4.2.6 Tính kết quả Chỉ giữ lại các dĩa có 10 – 150 khuẩn lạc: Tổng số CFU của nấm mốc và/hoặc nấm men, N, trong 1gram hoặc 1ml sản phẩmđược tính theo công thức: ∑C : là tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các dĩa được giữ lại. n1: là số dĩa của độ pha lõang thứ I có chứa 10 – 150 khuẩn lạc n2: là số dĩa của độ pha lõang thứ II có chứa 10 – 150 khuẩn lạc d: hệ số pha lõang tương ứng với độ pha lõang thứ I Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 25 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.3 Coliform 3.4.3.1 Phương pháp Phương pháp kiểm tra tổng số coliform theo Iso 5541-1986. 3.4.3.2 Phạm vi áp dụng Xác định tổng số coliform trong sữa và sản phẩm sữa. 3.4.3.3 Thiết bị và dụng cụ - Nồi hấp tiệt trùng điều chỉnh được áp lực 14°C ± 1°C trong 20 phút - Tủ sấy dụng cụ duy trì được nhiệt độ 1700C – 1750C - Tủ ấm cài đặt được nhiệt độ ở 300C ± 10C - Cân kỹ thuật - Kính hiển vi - Bể điều nhiệt duy trì nhiệt độ ở 450C – 500C - Đĩa petri 90 – 100mm - Các thiết bị thông thường của phòng vi sinh đã tiệt trùng. 3.4.3.4 Môi trường và thuốc thử 3.4.3.4.1 Chất pha loãng: dùng 1 trong 4 lọai dung dịch pha loãng - Dung dịch pepton / muối: Thành phần: Pepton : 1.0g NaCl : 8.5g Nước : 1000 ml Hòa tan các thành phần trong nước, đun nóng nếu cần. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7.0 ± 0.1 ở 250C. - Dung dịch Ringer nồng độ ¼ - Dung dịch Pepton - Dung dịch đệm Photphat 3.4.3.4.2 Môi trường nuôi cấy: - Môi trường VRBL (Violet red bile lactose) – Môi trường đặt chọn lọc. - Môi trường BGB (Brillan green Bile Lactose) 2% - môi trường khẳng định. 3.4.3.5 Quy trình phân tích - Cân 25g mẫu vào bình chứa 225mL nước cất vô trùng hoặc chất pha loãng, lắc cho tan mẫu hoàn toàn. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 26 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Lấy 2 đĩa petri, dùng pipetman vô trùng cho vào mỗi đĩa 1mL mẫu thử. Nồng độ pha lõang 10-1. - Lấy 2 đĩa petri khác, dùng pipetman vô trùng cho vào mỗi đĩa 1mL mẫu thử. Nồng độ pha lõang 10-2. - Thực hiện tương tự cho độ pha loãng tiếp theo nếu cần. - Rót vào mỗi đĩa petri khỏang 15mL môi trường VRBL (đã giữ ở 450C – 500C trong bể điều nhiệt), xoay nhẹ đĩa theo kim đồng hồ và ngược lại để hòa tan mẫu vào môi trường. Để môi trường đông đặc tự nhiên. - Thực hiện song song mẫu đối chứng với 15mL môi trường VRBL. - Đổ thêm 4mL môi trường VRBL tráng phủ kín bề mặt mỗi đĩa và để đông đặc như trên. - Thời gian hoàn tất 1 mẫu không quá 15 phút. - Lật úp và ủ các đĩa vào tủ ấm ở nhiệt độ 300C ±10C trong 24 giờ ±2giờ. - Sau 24 giờ, đếm các khuẩn lạc Coliform có màu đỏ tía, đường kính ≥0.5mm, đôi khi có vòng đỏ nhạt bao quanh. - Chỉ giữ lại các đĩa có ít nhất 15 khuẩn lạc, nhiều nhất 150 khuẩn lạc để đếm và khẳng định. 3.4.3.6 Thử khẳng định Cấy 5 khuẩn lạc từ mỗi lọai vào các ống nghiệm chứa môi trường BGB 2% và nuôi ở nhiệt độ 300C ± 10C trong 24 giờ ± 2giờ , các khuẩn lạc cho thấy sự sinhkhí trong ống Durham được coi là Coliform. 3.4.3.7 Tính kết quả Số Coliform có trong 1mL hoặc 1g (sản phẩm khác) được tính theo công thức: Tổng số Coliform/1g mẫu = Σc/(n1+0.1n2)d Trong đó: Σc : tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại. n1: số đĩa của độ pha loãng thứ nhất n2: số đĩa của độ pha loãng thứ hai 3.4.4 E.coli 3.4.4.1 Phương pháp Kiểm tra Escherichia coli giả định theo Iso 11866 - 1997 Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 27 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.4.2 Phạm vi áp dụng Xác định Escherichia coli giả định trong sữa và sản phẩm sữa. 3.4.4.3 Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị & dụng cụ vi sinh thông thường. 3.4.4.4 Môi trường và thuốc thử • Lauryl sulfate tryptose broth • EC broth. • Tryptone water. • Thuốc thử Kovacs 3.4.4.5 Quy trình phân tích (phương pháp MPN) - Chuẩn bị dịch đồng nhất mẫu hoặc pha lõang mẫu để được dịch mẫu có độ pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng ở những nồng độ kế tiếp (10-2 - 10-3 ,...) sao cho dãy ống nghiệm ở nồng độ pha loãng cuối cùng có 01 ống cho kết quả âm tính. - Thực hiện trên 9 ống nghiệm (mỗi một nồng độ sử dụng 3 ống nghiệm). - Ở mỗi nồng độ sử dụng 01 pippet vô trùng, tuần tự cấy 10ml dịch mẫu đã pha l loãng ở nồng độ 10-1 vào 3 ống nghiệm chứa môi trường Lauryl sulfate tryptose broth có nồng độ kép. Tiếp tục hút 1ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-2 vào 3 ống nghiệm chứa môi trường Lauryl sulfate tryptose broth có nồng độ đơn và thực hiện tương tự đối với dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-3. - Nếu nghi ngờ số lượng E.Coli trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. - Ủ các ống nghiệm ở 370C ± 20C trong 24h ± 2h. Sau 24h nếu không có hiện tượng sinh khí ủ tiếp đến 48h ± 2h. - Ghi nhận số ống sinh khí. Dùng que cấy vòng, cấy chuyền các ống sinh khí sang các ống nghiệm chứa môi trường EC broth, ủ ở 440C± 20C trong 24h ± 2h, sau 24h nếu không có hiện tượng sinh khí, tiếp tục ủ đến 48h ± 2h. - Ghi nhận số ống sinh khí ứng với mỗi độ pha loãng. - Dùng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ các ống EC broth (+) sang ống nghiệm chứa 5 – 10ml tryptone water. Ủ 440C± 20C trong 48h ± 2h. Sau thời gian ủ, nhỏ 0.5ml thuốc thử Kovacs vào các ống nghiệm, lắc đều, sau 1 phút nếu trong ống nghiệm xuất hiện vòng màu đỏ là dương tính. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 28 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Ghi nhận số lượng các ống cho kết quả dương tính trên môi trường tryptone ứng với mỗi độ pha loãng. 3.4.4.6 Tính kết quả - Từ số lượng các ống nghiệm có E.Coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN thích hợp (bảng 9 ống – phụ lục 1) để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN / g mẫu hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng. - Ghi chú: Nếu giá trị MPN < 0,3 E.Coli / g hay ml mẫu thì kết quả ghi như sau: không có sự hiện diện E.coli trong 01 ml hay 1g mẫu. Bảng chỉ số MPN & giới hạn độ tin cậy (mức độ tin cậy) Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 29 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.5 Staphilococcus aureus 3.4.5.1 Phương pháp Kiểm tra Staphilococcus aureus theo ISO (6888-1) - 1999 3.4.5.2 Phạm vi áp dụng Định lượng Staphylococcus Aureus trong thực phẩm. 3.4.5.3 Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị và dụng cụ vi sinh thơng thường đã tiệt trùng 3.4.5.4 Môi trường và thuốc thử - Baird parker agar medium - Brain heart infusion broth - Rabbit plasma 3.4.5.5 Quy trình phân tích - Dùng pipet tiệt trùng hút 1ml dung dịch mẫu nguyên hoặc đã được pha loãng thích hợp vào 3 đĩa môi trường thạch Baird parker (mỗi đĩa khoảng 0.3ml). Hoặc hút 0.1ml dung dịch mẫu nguyên hoặc đã được pha loãng bằng pipet tiệt trùng cho vào 1 dĩa thạch Baird parker (thực hiện 2 đĩa song song). Dùng que cấy tam giác thủy tinh trải đều mẫu lên bề mặt môi trường càng nhanh càng tốt. Lật úp đĩa, ủ ở 35°C - 37°C trong 24h ± 2h. - Sau 24h ± 2h đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc đặc trưng. Tiếp tục ủ thêm 24h ± 2h và đánh dấu các khuẩn lạc đặc trưng mới hình thành, cần đếm cả các khuẩn lạc không đặc trưng. Giữ lại các đĩa cĩ số khuẩn lạc trong khoảng 15 – 150. - Chọn: + 5 khuẩn lạc đặc trưng trong trường hợp những đĩa chỉ chứa các khuẩn lạc đặc trưng. + 5 khuẩn lạc khơng đặc trưng trong trường hợp những đĩa chỉ chứa các khuẩn lạc khơng đặc trưng. + 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc khơng đặc trưng trong trường hợp những đĩa chứa cả 2 dạng khuẩn lạc trên. Khuẩn lạc Staphylococcus Aureus đặc trưng cĩ màu đen hoặc xám, bĩng, lồi vàcĩ vàng sáng bao quanh. - Nhuộm gram: gram (+) - Khẳng định: Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 30 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến Dùng que cấy vịng cấy mỗi một khuẩn lạc đã được chọn lọc từ mơi trường Braid – Parker sang ống nghiệm chứa 10ml Brain heart infusion broth, ủ ở 35°C hoặc 37°C trong 24h ± 2h. Sau 24h ± 2h dùng pipette vơ trùng cấy 0.1ml canh trùng vào ống nghiệm chứa 0.3ml huyết tương thỏ Rabbit Plasma và ủ ở 35°C - 37°C. Theo dõi phản ứng đơng huyết tương sau 4h, 6h, 24h. Kết quả thử nghiệm là dương tính khi thể tích khối đơng huyết tương lớn hơn ½ thể tích dịch lỏng ban đầu. 3.4.5.6 Tính kết quả 3.4.5.6.1 Tính số khuẩn lạc cho phản ứng Coagulase dương tính trên mỗi đĩa : Trong đó: Ac: số khuẩn lạc đặc trưng được chọn để thử phản ứng Coagulase bc: số khuẩn lạc đặc trưng cho phản ứng Coagulase dương tính Cc: tổng số khuẩn lạc đặc trưng đánh dấu trên đĩa Anc: số khuẩn lạc khơng đặc trưng được chọn để thử phản ứng Coagulase bnc: số khuẩn lạc khơng đặc trưng cho phản ứng Coagulase dương tính Cnc: tổng số khuẩn lạc khơng đặc trưng đánh dấu trên đĩa. 3.4.5.6.2 Tính số khuẩn lạc Staphylococcus Aureus trên một đơn vị mẫu thử: Trong đó: Σa: tổng số khuẩn lạc Staphylococcus Aureus cho phản ứng Coagulase dương tính trên tất cả các đĩa đã được chọn V : thể tích mẫu trên mỗi đĩa (ml) n1: số đĩa được đếm ở nồng độ pha lỗng thứ nhất. n2: số đĩa được đếm ở nồng độ pha lỗng thứ hai Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 31 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến d : hệ số pha lỗng tương ứng với nồng độ pha lỗng thứ nhất Kết quả được làm trịn đến 2 chữ số cĩ nghĩa. 3.4.5.6.3 Tính trên lượng nhỏ: a) Nếu 2 đĩa, mỗi đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc, kết quả được ghi nhận như sau: - Đối với sản phẩm lỏng, số khuẩn lạc Staphylococcus Aureus cho phản ứng Coagulase dương tính trên 1ml mẫu dựa vào cơng thức: Trong đó: Σa: tổng số khuẩn lạc cho phản ứng Coagulase dương tính được xác định dựa vào công thức (1) trên 2 đĩa đã được chọn. V : thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa (ml) - Đối với sản phẩm khác (được pha loãng), số khuẩn lạc Staphylococcus Aureus cho phản ứng Coagulase dương tính trên 1g mẫu dựa vào cơng thức: Trong đó: Σa: tổng số khuẩn lạc cho phản ứng Coagulase dương tính được xác định dựa vào cơng thức (1) trên 2 đĩa đã được chọn. V : thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa (ml) d : hệ số pha lõang b) Nếu 2 đĩa khơng chứa bất kỳ khuẩn lạc cho phản ứng Coagulase dương tính và nếu thể tích mẫu cấy là 0.1ml thì kết quả được ghi nhận như sau: < 10 khuẩn lạc Staphylococcus Aureus trên 1ml (sản phẩm lỏng) < 10/d khuẩn lạc Staphylococcus Aureus trên 1g (sản phẩm khác); trong đĩ d là hệ số pha lõang. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 32 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.6 Clostridium perfringens 3.4.6.1 Phương pháp Định lượng Clostridium Perfringens theo ISO 7937 – 1997 – 04 -15trong thực phẩm và thức ăn gia súc. 3.4.6.2 Phạm vi áp dụng Định lượng Clostridium Perfringens trong thực phẩm và thức ăn gia súc. 3.4.6.3 Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị và dụng cụ vi sinh thơng thường đã tiệt trùng. 3.4.6.4 Môi trường và thuốc thử - Egg yolk free tryptose sulfite cycloserine agar (SC) – Mơi trường này đã từng được gọi là EY – free TSC - Fluid thioglycollate medium - Lactose sulfite medium (LS) 3.4.6.5 Quy trình phân tích - Cấy 1ml dịch mẫu nguyên hoặc đã được pha lỗng thích hợp vào một đĩa petri vơ trùng. Đổ 10ml – 15ml mơi trường SC agar đã được ủ 470C vào đĩa, lắc đều. Sau khi mơi trường đã đông, đổ thêm lên trên bề mặt khoảng 15ml SC agar. Đĩa đã cấy mẫu được ủ ở 350C hoặc 370C trong 20h ± 2h trong bình kỵ khí. - Thực hiện lặp lại 2 lần cho mỗi độ pha lỗng. - Sau khi ủ, khuẩn lạc Clostridium Perfringens trên mơi trường SC agar cĩ màu đen. Giữ lại các đĩa cĩ số khuẩn lạc nhỏ hơn 150, chọn 5 khuẩn lạc điển hình. Nếu số khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa nhỏ hơn 5 thì chọn tất cả để tiến hành thử nghiệm sinh hĩa. - Cấy từng khuẩn lạc chọn lọc vào trong ống nghiệm chứa 10ml mơi trường fluid thioglycollate. Ủ trong điều kiện kỵ khí ở 350C hoặc 370C trong 18h đến 24h. Sau khi ủ, dùng pippet vơ trùng cấy 5 giọt dịch canh trùng từ mơi trường fluid thioglycollate sang ống nghiệm chứa 8ml mơi trường LS cĩ ống Durham lật úp. - Ủ ở 460C trong 18h đến 24h. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 33 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến - Kết quả được xem là dương tính nếu mơi trường chuyển thành màu đen và khí - Sinh ra phải lớn hơn ¼ chiều cao ống Durham. 3.4.6.6 Tính kết quả 3.4.6.6.1 Tính số khuẩn lạc C. perfringens trên mỗi đĩa theo cơng thức sau: Trong đó: b: số khuẩn lạc C.perfringens cho thử nghiệm dương tính A: số khuẩn lạc C.perfringens được chọn để tiến hành thử nghiệm C: số khuẩn lạc đặc trưng được đánh dấu trên đĩa. 3.4.6.6.2 Phương pháp tính: 3.4.6.6.2.1 Những đĩa chứa từ 10 đến 150 khuẩn lạc C. perfringens Trong đó: ∑a: tổng số khuẩn lạc C.perfringens trên tất cả các đĩa ở hai nồng độ pha lỗng liên tiếp. n1: số đĩa được đếm ở độ pha lỗng thứ nhất. n2: số đĩa được đếm ở độ pha lỗng thứ hai d: hệ số pha lỗng tương ứng với độ pha lỗng thứ nhất N: số khuẩn lạc C.perfringens trong 1g hoặc 1ml mẫu Kết quả được làm tròn đến 2 chữ số có nghĩa. Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 34 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến 3.4.6.6.2.2 Tính trên số lượng nhỏ - Nếu 2 đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc C.perfringens dựa vào cơng thức (1) tính số khuẩn lạc C.perfringens cho mỗi đĩa. Đặt m là số khuẩn lạc trung bình đếm được trên 2 đĩa. - Nếu sản phẩm lỏng: (không pha loãng): N E : số khuẩn lạc C.perfringens trên 1ml mẫu. - Nếu sản phẩm khác: N E = m / d N E : số khuẩn lạc C.perfringens trên 1g mẫu. d : hệ số pha loãng 3.4.6.6.2.3 Không có khuẩn lạc Nếu 2 đĩa không chứa bất kỳ khuẩn lạc C.perfringens nào, kết quả được ghi nhận như sau: < 1 C.perfringens trên 1ml (sản phẩm lỏng) < 1/d C.perfringens trên 1g mẫu (sản phẩm khác) d: hệ số pha loãng 3.4.7 Streptococci faecal 3.4.7.1 Phương pháp: Phân tích Streptococci trong nước uống đóng chai theo TCVN 6189 -2 1996 3.4.7.2 Phạm vi áp dụng: Phát hiện Streptococci feacal trong thực phẩm. 3.4.7.3 Thiết bị và dụng cụ: Dụng cụ chuyên dụng trong kiểm nghiệm vi sinh vật. 3.4.7.4 Môi trường và thuốc thử: Môi trường pha sẵn SB (thạch Slanetz – Bartley) 3.4.7.5 Quy trình phân tích: - Dùng pipet tiệt trùng hút 1ml dung dịch mẫu nguyên hoặc đã được pha loãng thích hợp vào 3 đĩa mơi trường thạch SB (mỗi đĩa khoảng 10ml). Công Ty Cổ Phần Sữa Việt Nam – Nhà Máy Nước Giải Khát Page 35 SVTH: Trần Đỗ Khoa Tiến Hoặc hút 0.1ml dung dịch mẫu nguyên hoặc đã được pha lỗng bằng pipet tiệt trùng cho vào 1 dĩa thạch Baird parker (thực hiện 2 đĩa song song). Dùng que cấy tam giác thủy tinh trải đều mẫu lên bề mặt mơi trường càng nhanh càng tốt. Lật úp đĩa, ủ ở 35°C - 37°C trong 24h ± 2h. - Sau 24h ± 2h đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc đặc trưng. Tiếp tục ủ thêm 24h ± 2h và đánh dấu các khuẩn lạc đặc trưng mới hình thành, cần đếm cả các khuẩn lạc khơng đặc trưng. - Giữ lại các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 15 – 150. 3.4.7.6 Tính kết quả: Số Streptococci feacal có trong 1mL hoặc 1g (sản phẩm khác) được tính theo công thức: Tổng số Strep/1g mẫu = Σc/(n1+0.1n2)d Trong đó: Σc : tổng số khuẩn lạc đếm được trong tất cả các đĩa được giữ lại. n1: số đĩa của độ pha loãng thứ nhất n2: số đĩa của độ pha loãng thứ hai 3.4.8 Speudomonas aeruginosa 3.4.8.1 Phương pháp: Dựa trên phương pháp định lượng Pseumonas aeruginosa theo TCVN 7138: 2002 3.4.8.2 Phạ