Báo cáo Thực tập về các bệnh trong nuôi trồng thủy sản

2 triệu tấn, sản lượng nuôi đạt hơn 1,4 triệu tấn, giá trị kim ngạch xuất khẩu vượt qua mốc 3 tỷ USD, đạt hơn 3,35 tỷ USD, tăng hơn 300 lần so với năm 1986, tăng gần 600 triệu USD so với năm 2005. Giá trị làm ra của Ngành Thuỷ sản ngày càng có tỷ trọng cao hơn trong khối nông nghiệp và trong nền kinh tế quốc dân. Với mục tiêu đến năm 2010 phải đạt 4 triệu tấn sản lượng thủy sản và giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt 4,5 – 5 tỷ USD, toàn ngành Thủy sản phải nỗ lực nhiều hơn nữa, phấn đấu nhiều hơn nữa trên các lĩnh vực hoạt động theo hướng phát triển bền vững, chú trọng chất lượng của sự tăng trưởng, tham gia hiệu quả vào việc bảo vệ an ninh vùng biển, đảo của Tổ quốc, góp phần xứng đáng cùng cả nước đưa nước ta trở thành một nước mạnh về biển và giàu lên từ biển như Đảng đã định hướng và cũng là nguyện vọng khao khát của bà con ngư dân và của cả dân tộc ta. (Toàn văn bài phát biểu của Bộ trưởng Tạ Quang Ngọc tại Lễ đón nhận Huân chương Sao vàng) Để đạt những kết quả đáng kể như hiện nay thì ngành nuôi trồng thủy sản đã đề ra những biện pháp tích cực để tăng sản lượng và diện tích nuôi trồng thủy sản: thâm canh, tăng năng suất mở rộng… Bên cạnh những lợi ích do những biện pháp tích cực mang lại thì song song với việc này thì môi trường nuôi thủy sản ngày càng bị ô nhiễm nghiêm trọng. Điều này dẫn đến một hệ quả nghiêm trọng là phá hủy môi trường sinh thái của các sinh vật nuôi. Ảnh hưởng tới hộ nuôi tôm, cá gây thiệt hại nặng nề. Do môi trường ô nhiễm nên bệnh dịch tràn lan không kiểm soát được, và ngày càng có nhiều tôm, cá bệnh do môi trường nuôi ô nhiễm do không biểt cách quản lý tốt môi trường nuôi. Để giải quyết một phần khó khăn do bệnh tôm cá ngày càng tràn lan nên Trường ĐH Nông Lâm đã mở ra một chuyên ngành Ngư Y để khắc phục một phần khó khăn này. Và trong đợt này, Khoa thủy sản đã tổ chức cho chúng em thực tập môn bệnh cá ngay tại phòng thí nghiệm tại trường Đại học Nông Lâm từ ngày 30/10/08 đến 7/11/08. Để giúp chúng em tiếp cận thực tế về bệnh học thủy sản và những vấn đề liên quan tới bệnh trong ngành nuôi trồng thủy sản. Và sau khi ra trường chúng em cũng bớt một phần bỡ ngỡ trong các thao tác ở phòng thí nghiệm. 2. Mục tiêu Nhằm đáp ứng cho sinh viên khi ra trường nắm bắt được các bước cơ bản trong việc thực hiện các phương pháp trong phòng thí nghiệm nhằm phát hiện bệnh trên động vật thuỷ sản:  Phương pháp kiểm tra cá khi thu mẫu.  Phương pháp thu mẫu cố định và lưu trữ bệnh.  Các bước chuẩn đoán, định danh vi khuẩn bằng bộ test Nam Khoa, API 20.  Các phương pháp kháng sinh đồ, MIC,…  Các kỹ năng làm việc trong phòng thí nghiệm. Từ đó, mỗi sinh viên có sự đánh giá và so sánh giữa kiến thức thực tế về những gì đã được học với thực tế. Ngoài ra còn giúp cho sinh viên xử lý nhanh các tình huống làm việc trong phòng thí nghiệm và trong thực tế. CHƯƠNG II. Tổng quan tài liệu 2.1 Tổng quan về cá tra 2.1.1 Đặc điểm sinh học Bộ Siluriformes Họ Pangasidae Giống Pangasius P. hypothalmus (Sauvage, 1878) Cá sống ở tầng giữa, khi nhỏ sống đàn, khi lớn sống đơn độc. Cá tra biết đớp móng vào khoảng 12-14 ngày tuổi ( có cơ quan hô hấp phụ là da và bóng hơi ). Điều kiện chất lượng nước Nhiệt độ: 22-36oC ( tốt nhất 26-32oC ) pH = 6-8 Hàm lượng DO: 2mg/l Độ mặn cao nhất 7ppt Cá tra là loài có tốc độ sinh trưởng nhanh. Sau 5 tháng nuôi đạt trọng lượng 5kg/con. Đặc điểm sinh trưởng : - Cá tra có tốc độ tăng trưởng nhanh . - Sau 5 tháng nuôi cá tra:1kg/con. Đặc điểm sinh sản Cá đẻ trứng dính vào rễ cây cỏ thuỷ sinh Tuổi thành thục: 3-4 năm tuổi Thời gian tái thành thục: 2,5-3 tháng (phụ thuộc điều kiện dinh dưỡng ) Sức sinh sản thực tế: 150.000 trứng/kg Tập tính ăn Cá 3 ngày tuổi ăn phiêu sinh động vật Thường ăn nhau ở giai đoạn 1-3 ngày tuổi mặc dù còn noãn hoàng 10-15 ngày tuổi trở đi,ngoài phiêu sinh động, cá ăn được cám gạo, bột cá thức ăn viên Là loài ăn tạp thiên về động vật 2.1.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh Trong vài năm trở lại đây, phong trào nuôi cá tra xuất khẩu ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) tăng rất nhanh, đem về cho đất nước một nguồn ngoại tệ rất lớn.Tuy nhiên hiện nay tình hình nuôi cá tra gặp nhiều rủi ro cao do giá thành cá tra luôn tăng, nhưng giá bán sản phẩm cá tra lại giảm, do giá vật tư và nguyên liệu tăng, đưa giá thành sản phẩm cá tra hiện nay (đến 23/05/2008) là 14.000 - 14.500đ/kg (đối với thức ăn tự chế) và trên 15.000đ/kg đối với thức ăn công nghiệp, tăng lên từ 2.000 - 3.000đ/kg. Trong khi đó giá cá thịt bán ra là 14.200 - 14.800đ/kg, nhiều doanh nghiệp thu mua sản phẩm có giới hạn do thiếu vốn Do phát triển quá nhanh không theo quy hoạch nên bệnh trên cá tra nuôi hiện nay xảy ra ngày càng nhiều nhưng việc điều trị lại kém hiệu quả đang là vấn đề quan tâm hàng đầu của người nuôi cá và cả các nhà chuyên môn. Đối với cá tra thương phẩm bệnh thường xuất hiện theo mùa vụ chủ yếu vào đầu mùa mưa đặc biệt là bệnh gan thận mũ, ký sinh trùng. Tuy nhiên tình hình dịch bệnh kiểm soát được. 2.2. Tổng quan về vi khuẩn Edwardsiella Ictaluri 2.2.1 Đặc điểm sinh học Edwardsiella ictaluri ( Hawked et al. 1981) Edwardsiella thuộc họ Enterobacteriaceae. Vi khuẩn này có một số đặc điểm: là vi khuẩn yếm khí tuỳ ngi, có hình que mảnh, gram âm, kích thước 1 x 2-3µm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ vào tiêm mao Khi phân lập nên phát triển ở môi trường thạch Nuôi cấy trên môi trường TSA + 5% máu hoặc môi trường BHIA Ủ 28-30oC, 48h khuẩn lạc hiện rõ Khuẩn lạc tròn, nhỏ, trắng đục Dấu hiệu bệnh lý: Cá bệnh do nhiễm vi khuẩn E.ictaluri thường thể hiện kém ăn hoặc bỏ ăn, gầy yếu, bụng thường chướng to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc vây xuất huyết, mắt lồi. Giải phẩu bên trong, một số cơ quan nội tạng như gan, lá lách, thận bị hoại tử, tạo thành những đốm màu trắng đục đường kính 0,2-0,5mm 2.2.2 Dịch tễ học Do mật độ nuôi dày nên mầm bệnh tích tụ nhiều trong ao nuôi. Khó phòng bệnh vì bệnh lưu hành thường xuyên trên cá tra nuôi công nghiệp Cá nhiễm bệnh do bị stress bởi mật độ nuôi cao, chất lượng nước giảm Khó ngăn cản được vi khuẩn xâm nhập vào ao nuôi ( bơm nước trực tiếp vào ao không qua xử lý ) Vaccine đang trong giai đoạn nghiên cứu Phòng bệnh Sức khoẻ của cá nuôi phải tốt để mức độ cảm nhiễm với mầm bệnh thấp Không sử dụng một số hoá chất diệt kí sinh như CuSO4 trong thời gian nhiệt đọ nước thích hợp cho vi khuẩn phát triển ( giảm chất lượng nước, giảm sức đề kháng của cá ) β-Glucan không cải thiện được sức đề kháng của cá đối với E.ictaluri. Vi khuẩn có thể kí sinh tuỳ nghi bên trong tế bào của cá nên khả năng mang bệnh và chống lại các chất kích thích miễn dịch lớn Cải tạo ao, đặc biệt sát trùng đáy ao để hạn chế mầm bệnh. Sau mỗi vụ nuôi, ta loại bỏ lớp bùn đáy ao, chỉ giữ lại lớp bùn khoảng 10cm Khi thấy bệnh xuất hiện thì ngưng cho ăn để hạn chế khả năng mầm bệnh lây lan qua đường phân 2.3 Tổng quan về kháng sinh 2.3.1 Định nghĩa Kháng sinh là chất hữu cơ có nguồn gốc sinh học,bán tổng hợp hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc giết chết vi trùng trên cơ sở kết hợp với một điểm tiếp nhận ( receptor ) trong quá trình biến dưỡng, dẫn đến sự ngưng trệ quá trình sống của vi khuẩn bên trong cơ thể,vì vậy kháng sinh thường được dùng để điều trị trên cơ thể đã bị nhiễm trùng. Trong y học,thú y và nuôi trồng thuỷ sản, người ta dùng kháng sinh để trị các bệnh nhiễm khuẩn và đã đem lại hiệu quả điều trị rất cao, nếu dùng đúng thuốc, đúng liều, đúng thời điểm. Tuy vậy kháng sinh cũng là con dao hai lưỡi, có thể ảnh hưởng xấu đến động vật sử dụng nó và cũng có những tác động không nhỏ tới môi trường sinh thái. Nếu dùng kháng sinh tuỳ tiện và thiếu hiểu biết có thể làm giảm sức đề kháng của vật nuôi với các loại mầm bệnh 2.3.2 Các nguyên tắc sử dụng kháng sinh 1. Lựa chọn kháng sinh đúng với vi khuẩn gây bệnh 2. Lựa chọn kháng sinh theo vị trí nhiểm trùng 3. Dùng kháng sinh đúng liều quy định 4. Dùng kháng sinh đúng liệu trình 5. Tránh phối hợp các kháng sinh tương kỵ 2.4 MIC MIC - Minimal Inhibitory Concentration- Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau khi pha loãng kháng sinh nhiều lần khác nhau ( µg/mL ) CHƯƠNG III. Tổng quan và phương pháp thí nghiệm 3.1 Tổng quan và đặc điểm Tổng quan: -Thí nghiệm được tiến hành ở phòng Thí Nghiệm Khoa Thuỷ Sản – Trường ĐH Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. -Thí nghiệm trong điều kiện phòng và trong các bể kính. -Gồm 5 nghiệm thức,gồm 15 bể,trong đó nghiệm thức 1 làm đối chứng. -Cá thí nghiệm có cỡ khá đồng đều,trong quá trình thí nghiệm thì không cho ăn. - Hàng ngày,các chỉ tiêu (pH ,DO ,NH4+ / NH3 ,nhiệt độ) được theo dõi. Đặc điểm: -Tiến hành kiểm tra kí sinh trùng,định danh và phân lập vi khuẩn tại phòng thí nghiệm. -Ngoài ra,còn tiến hành một số thí nghiệm: MIC, kháng sinh đồ. 3.2 Vật liệu 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu Việc gây bệnh thực nghiệm được thực hiện trên cá tra giống được cung cấp từ trại thủy sản trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Cá tra giống sử dụng trong bể nuôi thí nghiệm có kích thước từ 1,3 – 1,5 cm, đạt trọng lượng cơ thể từ 7 – 10 g. Cá được chọn một cách ngẫu nhiên từ trại giống và được bố trí một cách ngẫu nhiên trong các nghiệm thức gây bệnh thực nghiệm. 3.2.2 Hệ thống bể thí nghiệm Hệ thống bể thí nghiệm được sử dụng là bể kính có kích thước 50x40x30 cm, gồm có 15 bể sử dụng cho 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần. Số cá sử dụng thí nghiệm trong mỗi bể là 15 con. Mỗi bể được trang bị một ống sục khí riêng biệt. 3.2.3 Dụng cụ Ống nghiệm: dùng để chứa môi trường nuôi cấy và kiểm tra các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật. Bình tam giác: dùng để nấu hoặc chứa môi trường nuoi cấy vi sinh vật. Đĩa petri: dùng để nuôi cấy và làm thuần vi khuẩn. Lame: dùng để quan sát mẫu tươi vi sinh vật. Lamelle: dùng để quan sát vi sinh vật. Cốc đong, ống đong, phễu thủy tinh. Pipet thủy tinh, pipet pasteur, micropipet, đầu tips. Que trang, que cấy, đèn cồn, nút bông. Hình .Cá tra giống thí nghiệm Hình .Hệ thống bể thí nghiệm Ống nhựa dùng cung cấp nước vào bề, vợt dùng vớt cá được sử dung riêng cho từng nghiệm thức. Các bộ test về NH3, pH, DO nhãn hiệu Sera của Đức, nhiệt kế. Dụng cụ giải phẫu: kéo lớn, kéo nhỏ, kẹp, dao, dùi và khay nhôm. Các dụng cụ xử dụng phải được khử trùng trước khi sử dụng. 3.2.4 Hóa chất, môi trường. Hóa chất cố định kí sinh trùng Dung dịch Shaudin Dung dịch ammonium 1%. Cồn 70 %. Dung dịch Iod loãng. Hóa chất nhuộm màu, Gram Dung dịch Crystal Violet. Dung dịch Hematoxylen, Lugol. Dung dịch Giemsa, Safranin. Dung dịch Carmin. Dung dịch AgNO3. Môi trường: TSA ( Trypticase Soy Agar ), NA ( Nutrient Agar ), BHIA ( Brain Heart Infusion Agar ). 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Định danh vi khuẩn bằng bộ test IDS 14GNR của công ty Nam Khoa: Tiến hành định danh vi khuẩn bằng bộ 14 thử nghiệm sinh hoá định danh trực khuẩn Gram [-] (IDS 14GNR).Đây là hệ thống bao gồm 14 thử nghiệm sinh hoá dùng để định danh các trực khuẩn Gr [-] bằng cách sử dụng hệ thống mã định danh và phần mềm định.Bộ định danh này gồm các phản ứng : Oxidase,lên men Glucose,khử Nitrate,thử nghiệm ONPG,sinh Urease,PAD,Citrate,thuỷ giải Esculin,sinh H2S,sinh Indol,Voges-Poskauer (VP),Malonate,LDC,dinh động. Nguyên tắc phản ứng: -Lên men Glucose : thử nghiệm này nhằm xác định khả năng sử dụng nguồn carbon nhất định của vi khuẩn để tăng trưởng. -Thử ghiệm khử Nitrate : các vi khuẩn có khả năng khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác sự khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử trong điều kiện không có oxi phân tử. -Thử nghiệm ONPG (O-Nitrophenyl β-D-galactopyrannoside) :các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự tổng của 2 enzyme là З-galactosida có vai trò xúc tác sự thuỷ phân lactose và permease có vai trò vận chuyển lactose vào bên trong tế bào. -Thử nghiệm Urease :một số vi khuẩn tổng hợp enzyme urease xúc tác sự thuỷ phân của liên kết amide giữa C-N và CO2. -PAD :phenylalanine là một amino acid có thể bị khử amine để tạo thành phenylpiruvic nhờ sự hiện diện của enzyme phenylalanine deaminase(PAD). -Citrate :một vài vi khuẩn có khả năng sử dụng citrate là nguồn carbon duy nhất để thu lấy năng lượng và vận chuyển. -Thuỷ giải Esculin :thử nghiệm này phân biệt vi khuẩn trên khả năng liên kết glucoside trong esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật. -Sinh H2S :một số vi khuẩn tổng hợp được enzyme Desulfohydrase xúc tác sự chuyển hoá trong điều kiện kỵ khí các amino acid chứa lưu huỳnh như:cysteine,cytin,methionine và giải phóng H2S. -Sinh Indol :trytophan là một amino acid có thể bị oxi hoá bởi một số vi khuẩn có hệ enzyme tryptophanase tạo ra sản phẩm chứa góc indol. -Voges-Poskauer :thử nghiệm này xác định khả năng tạo acetone (acetyl methylcarbinol),một sản phẩm cuối trung tính hình thành do lên men glucose. -Malonate :là một tác nhân kiềm hãm tính hoạt động của enzyme succinase chuyển succinate thành fumarate cản trở sự biến dưỡng của chu trình Krebs. -LDC :đây là phản ứng đánh giá hoạt tính decarbonxylase của vi khuẩn dùng để khử nhóm carboxyl của amino acid tạo thành amine có tính kiềm. -Di động :trong bộ định danh này,phản ứng di động được xác định trên môi trường bán rắn.Khi vi khuẩn mọc trên môi trường này sẽ làm mờ đường cấy và lan ra khỏi đường cấy. Cách thực hiện -Cấy vi khuẩn có thời gian phát triển không quá 24 giờ. -Dùng pipet pasteur chạm vào vào vi khuẩn thử nghiệm,cấy đâm thẳng đứng vào chính giữa chai môi trường LDC,sau đó đậy chặt nắp chai. -Làm huyền dịch vi khuẩn trong 3-5 mL nước muối sinh lý vô trùng,pha càng đục càng tốt.Dùng pipet với đầu tips vô trùng ,hút cho vào khoảng 2/3 giếng .Đậy nắp bảng nhựa lại. -Bảng nhựa đã nhỏ huyền dịch vi khuẩn và chai môi trường LDC được ủ trong tủ ấm ở 35 - 37oC .Đọc kết quả sau khi ủ khoảng 12- 16 giờ. Đọc kết quả: Giếng Phản ứng sinh hoá Thuốc thử thêm vào Đọc kết quả 1 Lên men glucose Không [+] vàng [-] tím 2 Lên men nitrate 1 đĩa giấy tìm nitrate [+] đỏ [-] vàng lợt 3 Beta-galactosidase Không [+] vàng [-] không màu 4 Sinh urea Không [+] đỏ cánh sen [-] đỏ nhạc hoặc vàng 5 PAD 1 giọt FeCl3 [+] xanh lá đậm [-] vàng lợt 6 Citrate Không [+] Xanh biển đậm [-] xanh lá nhạt 7 Thuỷ giải esculin Không [+] đen [-] không đen 8 Sinh H2S Không [+] đáy giếng đen [-] không đen 9 Sinh indol Kovac [+] thuốc thử chuyển màu đỏ [-] thuốc thử không đổi màu 10 Voges-Poskauer 1 giọt KOH, 1 giọt naphthol [+] đỏ [-] vàng nhạc 11 Malonate Không [+] xanh biển [-] vàng hay xanh lá Kết quả LDC và được đọc trên chai môi trường LDC: Phản ứng sinh hoá Đọc kết quả LDC [+] vi khuẩn mọc và môi trường thường có màu tím hay nhạc màu [-] vi khuẩn mọc và môi trường có màu vàng Di động [+] vi khuẩn mọc làm nhoè đường cấy [-] vi khuẩn mọc không nhoè đường cấy Phương pháp tính điểm để có code định danh: OXI GLU NIT ONPG UREA PAD CIT ESC H2S IND VP MLO LDC MOB [-] 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 [+] 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 Code ∑ ∑ ∑ ∑ ∑ Định danh vi khuẩn bằng bộ test API-20E: Phương pháp thử -Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ test để giữ ẩm trong quá trình ủ vi khuẩn trong tủ ấm. -Dùng que cấy đã tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5mL nước muối sinh lý hoặc nước cất đã tuyệt trùng ,lắc đều. -Dùng pipet tuyệt trùng hút vi khuẩncho vào các giếng của bộ test -Cho dầu khoáng tuyện trùng các giếng ADH ,LDC ,H2S và Ure. -Ủ trong tủ ấm trong 24 giờ ở 28-30oC. -Đọc kết quả: +Cho một giọt thuốc thử TDA vào giếng TDA. +Cho một giọt thuốc thử Vp1 sau đó cho tiếp một giọt Vp2 vào giếng VP. +Cho một giọt thuốc thử JAME vào giếng IND. =>Nếu glucose (+) => MT1 +MT2 => đỏ - N2O (+) => kẽm - sủi bọt – N2 (+). Kết quả test API-20E 3.3.2 Làm kháng sinh đồ Sau khi phân lập được vi khuẩn gây bệnh cần thử độ nhạy kháng sinh để tìm ra loại khánh sinh có độ nhạy cao, để dùng khánh sinh đó chữa bệnh. Cách tiến hành -Dùng nước muối sinh lý (nếu vi khuẩn cần nghiên cứu ở nước ngọt), nước biển vô trùng (nếu vi khuẩn ở nước mặn) để tạo dịch huyền phù của vi khuẩn có mật độ 3-6 * 108 tb/ml. -Dùng pipet lấy 0,5ml dịch huyền phù dàn đều mặt thạch đĩa lồng. -Sau 1 phút, đặt các đĩa khánh sinh ở vị trí khác nhau trên mặt thạch. -Để ở nhiệt độ 30-32oC trong 24h. -Lấy ra, xác định độ nhạy của khánh sinh thông qua độ đo đường kính vòng vô khuẩn. sau đó, so sánh đường kính vòng vô khuẩn với độ nhạy chuẩn của từng loại khánh sinh. 3.3.3 MIC (nồng độ ức chế tối thiểu): Các bước tiến hành theo phương pháp pha loãng kháng sinh trong ống nghiệm (NCCCLS,2005): -Chuẩn bị dung dịch kháng sinh vô trùng: hoà tan kháng sinh trong nước muối sinh lý,pha loãng để đạt nồng độ kháng sinh như sau:128 ,64 ,32 ,16 ,8 ,4 ,2 ,1 ,0.5 ,0.25 ,0.125 ,0 µg/mL. -Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: nuôi cấy vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên môi trường BHIA trong vòng 36-48 tiếng.Chọn 5 khuẩn lạc riêng lẻ giống hệt nhau,tạo huyền dịch vi khuẩn khoảng ở nồng độ chọn trước trong nước muối Test Substrate Reaction/enzyme Âm tính Dương tính ONPG Ortho-nitrophenyl Beta-galatosidae Không màu Vàng ADH Arginine Arginine dihyrolase Vàng Đỏ/cam LDC Lysine Lysine decarboxylase Vàng Cam ODC Ornithine Ornithine decarboxylase Vàng Đỏ CTT Sodium citrate Citrate utilisation Vàng Xanh/xanh lá H2S Sodium thiosulphate H2S production Không màu Đen URE Urea Urease Vàng Đỏ/cam TDA Tryptophane Tryptophane deaminase Vàng Nâu sậm IND Tryptophane Indol production Vàng Đỏ (2phút) VP Sodium pyruvate Acetoin production Không màu Hồng/đỏ (10 giây) GEL Gelatin Gelatinase Kết tủa đen Màu đen hoà tan GLU Glucose Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng MAN Mannitol Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng INO Inositol Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng SOR Sorbitol Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng RHA Rhamnose Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng SAC Sucrose Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng MEL Melibiose Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng AMY Amygladin Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng ARA arabinose Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng sinh lý vô trùng.Pha huyền dịch vi khuẩn có độ tương đương với ống McFaland 0.5 nồng độ vi khuẩn khoảng 1.5x108 cfu/mL.Pha loãng dung dịch xuống còn 1.5x106 cfu/mL. -Đánh dấu ống nghiệm từ 1-12.Từ ống 2-11 cho vào môi trường BHI Broth. -Từ ống 1-11 cho kháng sinh vào tương ứng với nồng độ pha loãng.Ống 12 không cho kháng sinh (đối chứng). -Từ ống 1-12 cho huyền dịch vi khuẩn vào sao cho mật độ vi khuẩn trong ống nghiệm tương đương 5x106 cfu/mL. -Lắc đều ống nghiệm,ủ trong vòng 22-24 giờ ở 300 C. -Sau đó lấy ra quan sát. -Biện luận kết quả. 3.3.4 Kiểm tra kí sinh trùng trên cá: Nghiên cứu bên ngoài Đạt cá trong khay nhôm giữ ẩm.Nếu cá kích thước lớn thì làm chết ngay.Quan sát triệu chứng lâm sàn: -Quan sát bằng mắt thường,chú ý màu sắc, hình dạng thân cá,xem cá có bị tổn thương ,u nhọt ,vết đen ,loét ,đốm trắng ở da và mang cũng như các kí sinh trùng lớn (đĩa,giáp xác…) bám trên da,vẩy cá để chuẩn đoán sơ bộ bệnh cá. -Cân trọng lượng,đo chiều dài va chụp hình cá. -Dùng lamelle cạo nhớt trên da,vây,nhỏ 1-2 giọt nước đưa lên kính quát sát từ vật kính nhỏ đến lớn. -Cắt bỏ cung mang và cắt láy cung mang quan sát bằng mắt thường,sau đó để lên lamelle dùng kéo nhỏ dầm nhẹ cho đều cung mang, rồi để lên kính hiển vi quan sát. Nghiên cứu bên trong Đầu tiên mổ cá theo nguyên tắc đã học,chú ý không cắt đứt ruột,lấy cơ quan ra quan sát: -Ruột: mổ ruột ra,lấy toàn bộ các thành phần có trong ruột lên lamelle,quan sát qua bằng mắt thường xem co kí sinh trùng lớn không,sau đó đặt lên kính hiển vi và quan sát,nếu có thì đếm xem có bao nhiêu con. -Tương tự dạ dày cũng vậy. -Tính cường độ cảm nhiễm và tỉ lệ cảm nhiễm. -Biện luận kết quả. 3.3.5 LD50: Cách tiến hành: - Chuẩn bị vi khuẩn ở dạng lỏng,được pha vào môi trường với nồng độ thích hợp. - Rót vi khuẩn vào ống đông khoảng 100 mL,đổ vào nghiệm thức 2,tiếp tục ở các nghiệm thức 3,4,5 mỗi lần đổi nghiệm thức giảm thể tích 10 lần.Nghiệm thức 1 làm đối chứng. - Theo dõi xem cá có chết hay không,nếu có đem mổ và quan sát. - Theo dõi đến lúc kết thúc thí nghiệm xem nghiệm thức nào cá chết trên 50%,suy ra liều gây chết LD50. - Tính và biện luận kết quả. 3.4 Cách xử lý số liệu. 3.4.1 Xác định LD50 Mục đích Xác định liều gây chết 50 % số cá gây cảm nhiễm bằng Edwardsiella ictaluri trong các nghiệm thức. Phương pháp thực hiện Mỗi nghiệm thức được cho vào nồng độ vi khuẩn giảm 10 lần từ nghiệm thức (NT)2 là 100ml, NT3 là 10ml, NT4 là 1ml, NT5 là 0,1ml và NT1 là nghiệm thức đối chứng không có vi khuẩn. Cá thí nghiệm được cho bắt ra cho vào bể riêng theo từng nghiệm thức, mỗi bể đều có máy sục khí để tạo môi trường tương đối giống nhau về tính chất để tiến hành gây nhiễm. Gây cảm nhiễm vi khuẩn bằng phương pháp ngâm với liều như trên và ngâm trong 1 giờ sau đó đem thả vào các bể kính thí nghiệm theo từng nghiệm thức và theo dõi hoạt động, tỉ lệ chết của cá hàng ngày để tính LD50. Kết quả Bằng phương pháp gây cảm nhiễm như trên và qua 7 ngày theo dõi, kết quả là không có cá chết trong bất kỳ một nghiệm thức nào nên không xác định được LD50 với nồng độ vi khuẩn như trên bằng phương pháp ngâm. 3.4.2 Xác định kháng sinh đồ Nguyên tắc Phương pháp đĩa khuếch tán là phương pháp cơ bản để kiểm tra độ nhạy của kháng sinh, với các đĩa giấy đã được tẩm một nồng độ kháng sinh nhất định. Khi đĩa kháng sinh tiếp xúc với bề mặt môi trường được phủ một lượng vi khuẩn, thuốc trong các đĩa kháng sinh sẽ khuếch tán vào thạch. Ở những nơi mà nồng độ thuốc có thể ức chế được vi khuẩn thì không có sự phát triển của vi khuẩn và tạo thành một vòng tròn vô khuẩn quanh đĩa kháng sinh. Ngược lại nếu vi khuẩn mọc ở những nơi đó tức là vi khuẩn không bị ức chế. Cách đọc kết quả Để tiến hành làm kháng sinh đồ trước hết ta cần chuẩn bị giống vi khuẩn thuần, có thời gian phát triển từ 18 – 24 giờ, các đĩa môi trường, các đĩa kháng sinh phải đạt nhiệt độ phòng (vì khi bảo quản phải được giữ ở nhiệt độ lạnh). Khi có đầy đủ thì ta tiến hành thực hiện. Kết quả được xác định bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn của các đĩa giấy và so sánh độ nhạy của chúng. 3.4.3 Phương pháp tính MIC Trong một dãy ống thí nghiệm thì MIC là ống trong cuối cùng của dãy và gần ống đục, sau đó ta có thể rút huyền phù vi khuẩn trong các ống nghiệm và trang trên đĩa thạch dinh dưỡng đem ủ để xem khả năng mọc khuẩn lạc vi khuẩn để xác định chính xác MIC. CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Một số chỉ tiêu chất lượng nước: Nhiệt độ ( oC) Ngày Nghiệm thức pH NH3 DO Sáng Chiều 1 6.5 0.03 4 26 24 2 6.5 0.03 4 26 24 3 6.5 0.03 4 26 24 4 6.5 0.03 4 26 24 31/10/08 5 6.5 0.03 4 26 24 1 7 0.03 4 22 24 2 6.5 0.03 4 22 23 3 7 0.03 4 22 24 4 6.5 0.03 4 22 23 1/11/08 5 6.5 0.03 4 22 23 1 7 0.06 4 20 23 2 7 0.06 4 20 23 3 7 0.06 4 20 24 4 7 0.06 4 20 22 3/11/08 5 7 0.06 4 20 22 1 7 0.06 4 22 25 2 7 0.06 4 22 24 3 6.5 0.06 4 22 24 4 7 0.06 4 22 24 4/11/08 5 7 0.06 4 22 24 1 6.5 0.06 4 22 24 2 6.5 0.06 4 22 24 3 6.5 0.06 4 22 24 4 6.5 0.06 4 22 24 5/11/08 5 6.5 0.06 4 22 24 Kết quả: Không thấy cá chết trong các ngày thí nghiệm. Nhận xét : Có thể mật độ vi khuẩn thí nghiệm không đủ để làm cá chết hoặc cá có sức đề kháng sau các lần thí nghiệm trước đó. 4.2 Kết Quả Kiểm Tra Ký Sinh Trùng Qua quá trình kiểm tra ký sinh trùng trên cá lóc, cá trê chúng tôi có kết quả như sau. Kiểm tra ký sinh trùng trên nhớt da và mang của 2 loài cá này hầu như là không thấy. Có thể là do trong quá tình người nuôi đánh bắt cá và trữ cá trước khi bán đã làm cho ký sinh trùng không còn bám trên các kí chủ này hoặc có thể người nuôi đã xử dụng hóa chất sát trùng nước trong ao làm tiêu diệt các loại ký sinh trùng này Kiểm tra ký sinh trùng trong dạ dày và ruột cá: Cá lóc : số lượng giun đầu mốc ( giống Pallisentis Van Cleave, 1928) là 3 con và giun tròn ( Philometra Costa, 1845) là 3 con. Ở Việt Nam cá lóc có tỷ lệ cảm nhiễm giun đầu gai Pallisentis rất cao, cá lóc ở Đồng Bằng Sông Cửu Long có tỷ lệ cảm nhiễm 81,7%, cường độ cảm nhiễm 2 – 70 trùng/cá thể ( Bùi Quang Tề, 1990) Hình cá lóc trước khi kiểm tra ký sinh trùng Hình sạng đầy đủ giun đầu mốc Hình dạng đầu của giun đầu mốc Hình dạng giun tròn Cá trê: số lượng giun tròn ( Philometra Costa, 1845) là 1 con và sán dây ( Caryophyllaeus Miiller, 1787) là 2 con. Thực tế cho thấy những loài cá nào sống đáy và ăn sinh vật đáy có nguy cơ nhiễm loại sán dây này cao hơn so với các loài cá sống tầng giữa và