Báo cáo Tối ưu hóa quá trình thu nhận flavonoid từ củ cải trắng (raphanus sativus l.) với sự hỗ trợ của vi sóng

chảy bên ngoài (dung môi). Động lực của quá trình trích ly là sự chênh lệch nồng độ của cấu tử ở trong nguyên liệu và trong dung môi. 1.3.4 Trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng (MAE: microwave - assisted extraction) 1.3.4.1 Khái niệm [18], [20] Vi sóng là sóng bức xạ điện từ có tần số từ 0,3 đến 300 GHz. Vi sóng dùng trong gia đình và quy mô công nghiệp thường có tần số 2,45 GHz. Hình 1.9 Thiết bị trích ly MAE [24] Vi sóng được truyền đi dưới dạng sóng, do đó có thể xâm nhập vào bên trong các vật liệu sinh học, tương tác với những phần tử phân cực bên trong vật liệu như nước và sinh ra nhiệt. Do vậy, nó có thể làm nóng toàn bộ vật liệu cùng lúc. 1.3.4.2 Cơ chế tác dụng [18], [20] Cơ chế tác dụng của vi sóng trong quá trình trích ly được cho là theo 3 bước như sau: • Do sự tương tác của vi sóng và các phân tử phân cực trong mẫu làm tăng nhiệt độ và áp suất ở một số điểm hoạt động mạnh trong mẫu, gây ra sự phá vỡ cấu trúc tại đó, giúp giải phóng các chất hòa tan bên trong. 15 • Từ những điểm đã bị phá vỡ dung môi sẽ xâm nhập sâu hơn vào bên trong mẫu, kết hợp với sự tác động của vi sóng gây ra nhiều hơn sự phá vỡ các cấu trúc từ bên trong. • Các chất hòa tan trong mẫu sẽ được giải phóng dưới tác động của dung môi và nhiệt độ. 1.3.4.3 Ưu nhược điểm của phương pháp [18], [20] MAE có một số ưu điểm như sau: giảm thời gian trích ly, giảm lượng dung môi sử dụng và nâng cao hiệu suất trích ly. MAE cũng có thể được so sánh với các phương pháp trích ly hiện đại khác, ví dụ như trích ly bằng dung môi siêu tới hạn (SFE) vì ưu điểm thiết bị đơn giản và giá thành thấp. Tuy nhiên, nhược điểm của MAE là hiệu quả sẽ thấp nếu hợp chất cần thu nhận hoặc dung môi sử dụng kém phân cực. Ngoài ra, khi so với SFE, nó còn có một nhược điểm khác là cần phải có một quá trình loại dung môi để thu chất mong muốn. Đồng thời, trong quá trình trích ly bằng MAE, sự tăng nhiệt độ cũng gây bất lợi nếu hợp chất cần thu nhận có tính nhạy cảm với nhiệt độ cao. 1.3.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến MAE - Dung môi sử dụng: loại dung môi và nồng độ dung môi có ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả thu nhận các hợp chất bằng MAE. Trong phương pháp MAE, các dung môi có tính phân cực sẽ cho hiệu quả tốt hơn khi sử dụng các dung môi không phân cực [26], [27]. - Các thông số kỹ thuật của quá trình xử lý vi sóng: công suất vi sóng và thời gian xử lý vi sóng. - Các thông số kỹ thuật của quá trình trích ly: nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ nguyên liệu: dung môi dùng trích ly. - Đặc điểm của mẫu nguyên liệu: bao gồm độ ẩm và kích thước hạt. Độ ẩm liên quan đến lượng nước có trong mẫu và do đó liên quan đến khả năng tương tác với vi sóng để sinh nhiệt. Kích thước hạt cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của MAE, kích thước phù hợp nằm trong khoảng 100 µm – 2 mm. Zhang Yan et al. (2011) đã sử dụng MAE để thu nhận flavonoid từ râu bắp. Tác giả đã xác định được các thông số cho quá trình trích ly MAE tối ưu như sau: dung môi ethanol 60%, công suất vi sóng 600 W, thời gian 16 phút, tỉ lệ nguyên liệu: dung 16 môi là 1: 20. Khi đó, lượng flavonoid tổng thu được là 4,55%. Các nghiên cứu cũng cho thấy MAE không ảnh hưởng lên hoạt tính của flavonoid và các polyphenol thu được [28]. Ping Shao et al. (2012) và Farid Dahmoune et al. (2015) đã sử dụng MAE để thu nhận các flavonoid tan trong nước từ lá tía tô Perilla frutescens và ly polyphenol từ lá Myrtus communis L. Kết quả nghiên cứu đã khẳng định hiệu quả của phương pháp MAE với 1 số phương pháp khác [25], [29]. . Bảng 1.2 Hiệu suất thu nhận flavonoid từ lá tía tô [29] Phương pháp Thời gian trích ly Dung môi Flavonoid thu được (mg/g) Soxhlet Soxhlet Gia nhiệt MAE 4 giờ 4 giờ 2 giờ x 2 lần 23 phút Methanol Nước Ethanol 85% Nước 6,73 2,69 3,15 6,07 Bảng 1.3 Hiệu quả thu nhận polyphenol từ lá Myrtus communis L. [25] Phuon g pháp Thời gian (phút ) Tỉ lệ ethano l (%) P.m w (W) R (ml/g ) TPC (mg GAE/g) TFC (mg QE/g) IC50 (µg GAE/ml) ABTS. DPPH. MAE UAE CSE 1,04 15 120 42 50 50 500 - - 32 50 50 162,49±16,9 5 144,77±30,2 3 128,00±18,0 7 5,02±0.0 5 3,88±0.4 5 4,15±0.7 5 38,20±1,0 8 71,81±2,1 9 39,85±1,1 3 16,80±0,2 9 20,61±1,6 6 21,56±0,1 0 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về củ cải trắng 1.4.1 Các nghiên cứu nước ngoài Năm 2010, Syed Sultan Beevi và cộng sự khảo sát thành phần các hợp chất polyphenol, khả năng chống oxi hóa và khử gốc tự do của lá và thân cây Raphanus sativus. Kết quả cho thấy trong lá và thân củ cải có các chất chống oxy hóa mạnh và có khả năng khử gốc tự do. Dịch chiết methanol và acetone của lá R.sativus có tổng hàm lượng polyphenol lần lượt là 86,16 và 78,77mg/g chất khô, có thể so sánh với trà xanh và trà đen. Phân tích HPLC cho thấy sự hiện diện của catechin, acid 17 protocatechuic, acid syringic, acid vanillic, axit ferulic, acid sinapic, o-coumaric acid, myricetin, và quercetin trong dịch chiết này. Dịch chiết methanol từ lá và thân cây đã cho thấy khả năng ức chế đáng kể acid linoleic peroxy và biểu thị hoạt động khử ion kim loại. Cụ thể, IC50 khi khử gốc tự do DPPH lần lượt là 31 và 42 mg/ml, khi khử superoxide là 23 và 52 mg/ml, khi khử hydrogen peroxide là 67 và 197 mg/ml, khi khử gốc NO là 56 và 62 µg/ml tương ứng [19]. Năm 2012, Ali Ghasemzadeh và cộng sự đã nghiên cứu thành phần flavonoid và hoạt tính chống oxi hóa của một số loài cây nhiệt đới gồm bắp cải, ớt xanh, ớt đỏ, rau dền, củ cải trắng, xả và nghệ. Flavonoid tổng được xác định bằng phương pháp của Chen et al (1998), các flavonoid thành phần được xác định bằng HPLC. Kết quả cho thấy trong củ cải trắng có hàm lượng flavonoid tổng là 0,098 ± 0,012 mg/g chất khô với ít nhất 5 loại flavonoid gồm quercetin, catechin, kaemferol, apigenin và rutin với hàm lượng lần lượt là: 0,016; 0,057; 0,039; 0,014 và 0,012 mg/g chất khô [17]. Năm 2013, Safia Janiua và cộng sự cũng cho thấy trong củ cải trắng tồn tại các hợp chất có tác dụng chữa bệnh như tanin, saponin, flavonoid, phlobatannin, anthraquinon, carbohydrat, đường khử, steroid, phytosterol, alkaloid, amino acid, terpenoid, cardiac glycoside và chalcone. Để khảo sát khả năng kháng khuẩn của củ cải, tác giả đã tiến hành trích ly củ cải trong các dung môi khác nhau (nước, methanol, ethanol, ethyl acetate, ete dầu hỏa). Dịch sau trích được bổ sung vào các đĩa thạch agar đã cấy vi khuẩn khảo sát (S.aureus, B.subtilis, M.lutes, E.aerogenes, S.typhi, E.coli, K.pneumoniae, P.auregnosa, B.bronchiseptica). Kết quả cho thấy dịch trích trên tất cả các dung môi đều có khả năng ức chế đối với tất cả các vi khuẩn khảo sát, có mẫu khả năng ức chế còn cao hơn mẫu đối chứng sử dụng kháng sinh gentamycin cùng liều lượng. Tuy nhiên, khả năng ức chế có sự khác biệt giữa các mẫu [8]. Năm 2014, K. Agarwal, R. Varma đã nghiên cứu về thành phần sinh hóa và khả năng khử gốc tự do của củ cải trắng. Kết quả công bố cho thấy dịch chiết trong nước của phần củ có khả năng kháng oxi hóa ở mức 58,38% với nồng độ 200µg/ml, giá trị IC50 là 166,79 µg/ml. Kết quả phân tích cho thấy trong dịch chiết có sự tồn tại của alkaloid, flavonoid, glycoside, tannin, triterpenoid và steroid [30]. 1.4.2 Các nghiên cứu trong nước: 18 Năm 2008, Trần Thị Hồng đã tiến hành nghiên cứu phương pháp sử dụng enzyme peroxidase (POD) tách chiết từ củ cải trắng để xác định hàm lượng thủy ngân trong nước ô nhiễm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng protein trong củ cải là 0,1269 mg/g; Enzyme POD hoạt động mạnh nhất tại giá trị pH = 6,5; Ion Hg2+ ảnh hưởng đến hoạt tính của POD, enzyme hoàn toàn mất hoạt tính tại giá trị nồng độ 5 mg/l Hg2+. Đây là hướng nghiên cứu thân thiện với môi trường, có giá trị thực tiễn cao với phạm vi áp dụng rộng rãi [31]. Năm 2011, đề tài “Tinh chế peroxydase từ củ cải trắng và ứng dụng trong xét nghiệm ethanol” của Nguyễn Anh Thủy cũng được đưa ra. Dịch củ cải với hoạt tính peroxidase ban đầu 29 U/ml được tinh chế 190 lần sử dụng các phương pháp kết tủa bằng (NH4)2SO4, sắc ký trao đổi ion và lọc gel. Enzyme thu nhận được có hoạt tính 810 U/ml, hoạt tính riêng 3237 U/mg protein, kích thước phân tử 43 KDa theo SDS- PAGE. Peroxidase từ củ cải trắng được thử nghiệm ứng dụng trong xét nghiệm ethanol dựa trên hệ alcohol oxidase – peroxidase kết hợp với phản ứng tạo màu sử dụng cơ chất 3,3’, 5’5’–tetramethylbenzidine. Phương pháp enzyme cho phép phát hiện ethanol ở mức 25ppm. Tương quan tuyến tính được xác định trong dải nồng độ ethanol từ 50 ppm tới 500 ppm [32]. ➢ Theo tổng quan tình hình các nghiên cứu của tác giả cho thấy thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần và hoạt tính của củ cải trắng. Qua đó cho thấy, dịch chiết từ củ cải trắng có các giá trị sinh học quan trọng, có hoạt tính chống oxi hóa cao, khả năng ức chế sự phát triển của rất nhiều loài vi khuẩn và nấm bệnh, tiềm năng ứng dụng rất lớn. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về củ cải trắng còn rất hạn chế. Đó là lý do tôi chọn thực hiện đề tài này. 19 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian, địa điểm thực hiện Thời gian: từ tháng 4/2016 đến tháng 2/2017. Địa điểm: Viện Kỹ thuật và Kinh tế biển, trường ĐH Bà Rịa Vũng Tàu. Một phần nghiên cứu được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm. trường ĐH Công nghiệp TP.HCM. 2.2 Nguyên vật liệu - dụng cụ 2.2.1 Nguyên liệu Củ cải trắng: củ cải trắng được thu hái vào tháng 2 năm 2016 tại trang trại thuộc huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam. Nguyên liệu sau khi thu hái được rửa sạch, cắt lát dày 0,5 cm, rồi cắt thành sợi, chần qua nước nóng 800C trong 3 phút, để ráo, sấy ở 600C trong 24 giờ đến độ ẩm khoảng 8%, sau đó xay nhỏ (0,5 – 1 mm) và bảo quản trong bao PE , tránh ánh sáng ở - 200C. 2.2.2 Hóa chất Aluminium chloride (AlCl3) Sodium carbonate (Na2CO3) Kali acetat (CH3COOK) ABTS, K2S2O8, Trolox – Sigma. 2.2.3 Trang thiết bị Máy quang phổ UV-vis Máy lọc chân không Máy đo pH Tủ sấy Lò vi sóng Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm. 2.3 Nội dung nghiên cứu 20 Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.7 Bố trí thí nghiệm 2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng bằng phương pháp truyền thống 2.4.1.1 Khảo sát loại dung môi ➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 7 loại dung môi ethanol 70, ethanol 90, ethanol 90 + 1% HCl, metanol, ethylacetate, cloroform và nước. ➢ Yếu tố cố định: Tỉ lệ rắn/ lỏng: 1/20 (g/ml) Nhiệt độ: 50oC Thời gian: 4 giờ Bột củ cải trắng Phân tích thành phần hóa học Trích ly bằng phương pháp truyền thống - Loại dung môi - Tỉ lệ dung môi và nguyên liệu - Nhiệt độ - Thời gian Trích ly với sự hỗ trợ của vi sóng đồng thời - Tỉ lệ dung môi và nguyên liệu - Công suất sóng - Thời gian xử lý vi sóng So sánh hiệu quả của 2 phương pháp - Lượng flavonoid thu được - Hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết flavonoid - Cấu trúc bề mặt của mẫu thông qua kết quả chụp SEM Tối ưu quá trình trích ly 21 Phương pháp: trích ly có gia nhiệt (chưng ninh) ➢ Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng flavonoid Hoạt tính chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do ABTS* Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. 2.4.1.2 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (tỉ lệ rắn/lỏng) ➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 4 mức 1/10, 1/20, 1/30 và 1/40 (g/ml) ➢ Yếu tố cố định: Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1 Nhiệt độ: 50oC Thời gian: 4 giờ Phương pháp: trích ly có gia nhiệt (chưng ninh) ➢ Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng flavonoid Hoạt tính chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do ABTS* Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. 2.4.1.3 Khảo sát nhiệt độ trích ly ➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 5 mức 40, 45, 50, 55 và 60oC ➢ Yếu tố cố định: Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1 Tỉ lệ rắn/ lỏng: từ kết quả mục 2.4.1.2 Thời gian: 4 giờ Phương pháp: trích ly có gia nhiệt (chưng ninh) ➢ Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng flavonoid Hoạt tính chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do ABTS* Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. 2.4.1.4 Khảo sát thời gian trích ly ➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 4 mức 2, 3, 4 và 5 giờ ➢ Yếu tố cố định: Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1 22 Tỉ lệ rắn/ lỏng: từ kết quả mục 2.4.1.2 Nhiệt độ: từ kết quả mục 2.4.1.3 Phương pháp: trích ly có gia nhiệt (chưng ninh) ➢ Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng flavonoid Hoạt tính chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do ABTS* Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. 2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng với sự hỗ trợ của vi sóng 2.4.2.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (tỉ lệ rắn/lỏng) ➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 4 mức 1/10, 1/20, 1/30 và 1/40 (g/ml) ➢ Yếu tố cố định: Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1 Thời gian: 5 phút Công suất sóng: 450 W ➢ Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng flavonoid Hoạt tính chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do ABTS* Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. 2.4.2.2 Khảo sát công suất của vi sóng sử dụng ➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 5 mức 80, 150, 300, 450, 700 và 900 W ➢ Yếu tố cố định: Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1 Tỉ lệ rắn/lỏng: từ kết quả mục 2.4.2.1 Thời gian: 5 phút ➢ Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng flavonoid Hoạt tính chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do ABTS* Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. 2.4.2.3 Khảo sát thời gian sử dụng vi sóng để trích ly ➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 4 mức 3, 5, 7 và 9 phút 23 ➢ Yếu tố cố định: Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1 Tỉ lệ rắn/lỏng: từ kết quả mục 2.4.2.1 Công suất sóng: từ kết quả mục 2.4.2.2 ➢ Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng flavonoid Hoạt tính chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do ABTS* Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. 2.4.3 Thí nghiệm 3: Tối ưu hóa trích ly flavonoid từ củ cải trắng Các thí nghiệm đơn yếu tố cho từng phương pháp được tiến hành nhằm sơ bộ xác định các điểm tại tâm. Quá trình tối ưu các thông số của quá trình trích ly được thực hiện bằng phương pháp quy hoạch thực ngiệm theo mô hình Box-Wilson dạng CCC. 2.5 Phương pháp phân tích 2.5.1 Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. Các chỉ tiêu đường tổng, protein tổng, béo, tro tổng và xơ thô được gởi mẫu phân tích tại Trung tâm sắc kí Hải Đăng, 79 Trương Định, quận 1, TP.HCM. 2.5.2 Xác định hàm lượng flavonoid tổng (TFC) [39] Tổng flavonoid được xác định theo phương pháp so màu như miêu tả của Chang và cộng sự (2002) dựa trên nguyên tắc: flavonoid tạo phức màu vàng với dung dịch AlCl3. Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid được xác định ở bước sóng 415 nm. Quercetin được dùng làm chất chuẩn tham chiếu. ➢ Xây dựng đường chuẩn quercetin: Pha dung dịch quercetin 100 ppm trong dung dịch ethanol 80%. Từ dung dịch quercetin 100 ppm, tiếp tục pha ra thành các dung dịch có nồng độ 75; 50; 25; 12,5; 6,25 và 3,125 ppm. Ứng với mỗi nồng độ dung dịch đã được pha loãng hút 0,5 ml cho vào ống nghiệm sau đó thêm vào: 1,5 ml ethanol 95%; 0,1 ml AlCl3 10%; 0,1 ml CH3COOK 1M; 2,8 ml nước cất. Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, đo màu ở 415nm, mẫu trắng thực hiện tương tự nhưng thay AlCl3 bằng nước cất. 24 Hình 2.2 Đường chuẩn queretin dùng xác định TFC ➢ Xác định TFC trong mẫu: Lấy 0,5 ml dịch chiết củ cải, làm tương tự các bước xây dựng đường chuẩn. TFC trong mẫu được tính như sau: 3. . .10 aV n TFC m  (mg quercetin/g) Trong đó: a: hàm lượng quercetin xác định từ đường chuẩn (ppm) V: tổng thể tích dịch chiết (ml) n: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (g) 2.5.3 Xác định khả năng khử gốc tự do ABTS* [40] Xác định hoạt tính chống oxi hóa là phương pháp dựa trên khả năng làm giảm độ hấp thu của gốc tự do cation ABTS* bởi các hoạt chất có hoạt tính chống oxi hóa ở bước sóng 734 nm. Cường độ màu của ABTS* tỉ lệ nghịch với nồng độ các chất chống oxi hóa và thời gian phản ứng. Dựa vào đường chuẩn trolox với thuốc thử sẽ tính được hoạt tính chống oxi hóa của mẫu phân tích. ABTS được pha trong nước cất đến nồng độ 7 mM (dung dịch A). K2S2O8 pha trong nước cất đến 2,45 mM (dung dịch B). Gốc tự do cation ABTS* được tạo ra bằng phản ứng giữa dung dịch A và B theo tỉ lệ 1:1 về thể tích, phản ứng diễn ra trong bóng tối từ 12 - 16 giờ ở nhiệt độ phòng (dung dịch stock). y = 0,009x R = 0,994 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0 2 4 6 8 10 12 O D 4 1 5 Quercetin (ppm) 25 Pha loãng dung dịch stock bằng nước cất để đạt độ hấp thu 0,7 ± 0,02 A ở 734 nm (dung dịch C). Dung dịch C được chuẩn bị mới cho từng phép thử. ➢ Xây dựng đường chuẩn trolox: Pha dung dịch trolox 1000 µM sau đó pha loãng ra thành các nồng độ 100, 200, 300, 400, 500 và 600 µM. Bảng 2.1 Quá trình xây dựng đường chuẩn với dung dịch trolox chuẩn Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ trolox (µM) 0 100 200 300 400 500 600 Tổng thể tích (ml) 3,04 3,04 3,04 3,04 3,04 3,04 3,04 Dung dịch C (ml) 3 Thể tích trolox (ml) 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 Lắc đều và ủ nhiệt độ phòng trong 6 phút, trong bóng tối Đo độ hấp thu ở bước sóng 734 nm Hình 2.3 Đường chuẩn trolox dùng xác định khả năng khử ABTS* Đối với mẫu thí nghiệm: hút 3 ml dung dịch C cho vào ống nghiệm sau đó hút 0,04 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng 6 phút trong bóng tối, lắc đều và đo độ hấp thu ở 734 nm. Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách thay 3 y = 18,78x R = 0,994 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Đ ộ g iả m đ ộ h ấ p t h u ( % ) Nồng độ trolox (micro mol) 26 ml dung dịch C bằng 3 ml nước cất. Phần trăm độ giảm độ hấp thu của mẫu thử (%) tính bằng công thức: % 1 sample control A OD A    Trong đó: Asample: độ hấp thu của mẫu thí nghiệm (có dung dịch C) Acontrol: độ hấp thu của ABTS* không có pha mẫu (thay 0,04 ml mẫu bằng nước cất) 2.8 Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các thí nhiệm đều được lặp lại 3 lần. Kết quả thể hiện trong báo cáo là trung bình của 3 lần lặp lại ± độ lệch chuẩn. Sử dụng phần mềm Staraphic Centurion XI để xử lý ANOVA và phân tích sự khác biệt về mặt thống kê thông qua LSD. Phần mềm Modde 5.0 để bố trí thí nghiệm tối ưu và xử lí số liệu tối ưu hóa. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 27 3.1 Kết quả phân tích thành phần hóa học của nguyên liệu Các thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu củ cải trắng đã được xác định. kết quả ghi nhận trong bảng 3.1. Hàm lượng chất khô trong củ chỉ chiếm 4,6 % nhưng hơn một nữa trong số đó là đường (56,5% chất khô). Thành phần chiếm tỉ lệ lớn thứ 2 là protein với mức 11,2%. Ngoài ra, củ cải trắng cũng là một loại củ có nhiều khoáng nhưng rất ít chất béo. Với những đặc điểm này, giải thích lý do tại sao trong đời sống thường nhật. các bà nội trợ ưa chuộng việc sử dụng củ cải trắng trong quá trình nấu nước dùng cho các món ăn tạo vị ngọt tự nhiên, thanh mát. Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của nguyên liệu củ cải trắng STT Chỉ tiêu Đơnvị Kếtquả 1 Đường tổng % 56,5 2 Lipid % 0,58 3 Protein % 11,2 4 Tro tổng % 8,25 5 Xơ thô % 15,34 6 Độ ẩm % 8,13 3.2 Kết quả TN 1: khảo sát quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng bằng phương pháp truyền thống 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi sử dụng Flavonoid là một nhóm chất lớn gồm rất nhiều các chất khác nhau có các tính chất không giống nhau. Các flavonoid có độ hòa tan khác nhau tùy theo số nhóm hydroxyl và các nhóm thế khác có trong cấu trúc hóa học, nên rất khó có một dung môi đặc trưng để trích ly flavonoid ra khỏi mẫu thực vật. Flavonoid nào mang nhiều nhóm metoxyl -OCH3 và ít nhóm hydroxyl-OH, có tính phân cực yếu, tan tốt trong dung môi ít phân cực như: benzen, cloroform, etyl acetat, đôi khi tan một phần trong n-hexan. Flavonoid mang nhiều nhóm hydroxyl, có tính phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt trong dung môi có tính phân cực như aceton, 28 ethanol, methanol, butanol, nướcCác flavonoid glycoside, anthocyanidin không tan trong dietyl ate nhưng tan trong nước nóng, ethanol nóng. Hình 3.1 Ảnh hưởng của loại dung môi dùng trích ly đến đến TFC và ABTS* của dịch chiết Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi đã khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau đến hiệu quả quá trình trích ly thu nhận flavonoid từ củ cải trắng. Các dung môi được khảo sát gồm: ethanol 700, ethanol 900, ethanol 900 + HCl, metanol, ethylacetate, cloroform và nước. Các điều kiện khác của quá trình trích ly được mô tả trong 2.4.1.1. Kết quả thí nghiệm được ghi nhận trên hình 3.1 thể hiện sự ảnh hưởng rõ rệt của loại dung môi dùng trích ly đến hàm lượng flavonoid thu nhận được. Các dung môi etanol và metanol được biết đến như là các dung môi đa năng, tính phân cực cao có khả năng hòa tan hầu hết các hợp chất có trong mẫu, nên khả năng lôi kéo flavonoid ra khỏi mẫu cũng cao hơn các dung môi ethyl acetate, nước và chloroform. Dung môi etanol có pha 1% acid HCl cho hiệu quả cao nhất trong nhóm 4 dung môi cho hiệu quả cao gồm metanol, etanol 700, etanol 900 và etanol 900 + HCl vì khi có acid, các flavonoid glycoside sẽ phân hủy, giải phóng gốc đường, trả lại phần aglycon, nên TFC tăng lên. Tuy nhiên, cần chú ý rằng sự thay đổi về cấu trúc này có thể gây ra những ảnh hưởng trên hoạt tính của flavonoid. Điều này giải thích sự thay đổi về hoạt tính khử gốc tự do ABTS* của dịch chiết ứng với các loại dung 1.168 3.884 2.838 5.068 0.17 4.784 1.135 13.87 14.89 16.13 17.68 17.49 18.35 8.31 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 A B T S ( m g T ro lo x /g ) T F C ( m g Q u er /g ) Loại dung môi TFC ABTS 29 môi khác nhau. Trong đó, mẫu chiết bằng dung môi etanol 70 dù hàm lượng flavonoid tổng xấp xỉ bằng với mẫu dùng etanol 90+HCl nhưng hoạt tính cao hơn có ý nghĩa và cao hơn tất cả các mẫu còn lại. Các nghiên cứu đã công bố cho thấy trong củ cải chứa các flavonoid tan trong etanol như quercetin, rutin, luteolin, apigenin nên kết quả nghiên cứu là phù hợp với các công bố trước đó. Từ kết quả này, chúng tôi chọn dung môi etanol 700 là dung môi dùng trích ly cho các phần nghiên cứu tiếp theo. 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (tỉ lệ rắn/lỏng) Với dung môi là etanol 700 đã chọn được, tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của yếu tố tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (hay gọi ngắn gọn là tỉ lệ rắn/lỏng) với các mức 1/10, 1/20, 1/30 và 1/40 (g/ml). Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận trong hình 3.2. Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn/lỏng dùng trích ly đến đến TFC và ABTS* của dịch chiết Bản chất của quá trình trích ly là quá quá trình khuếch tán, trong đó động lực của quá trình là sự chênh lệch nồng độ của cấu tử trong mẫu và trong dung môi. Trong quá trình trích ly rắn lỏng, lượng dung môi sử dụng quyết định lượng chất thu nhận được. Khi tỉ lệ này thấp, lượng dung môi sẽ không đủ để hòa tan hết flavonoid có trong mẫu, trạng thái cân bằng sẽ nhanh chóng đạt đến. Khi thêm dung môi, nồng độ cấu tử chất hòa tan trong dung môi giảm xuống, quá trình khuếch tán sẽ tiếp tục cho đến khi đạt trạng thái cân bằng mới ở giá trị cao hơn. Tuy nhiên, cần chú ý sự tăng tỉ lệ này không tỉ lệ thuận với lượng cấu tử thu được vì đến một lúc nào đó, lượng cấu 2.917 3.761 4.967 5.06915.21 17.11 19.01 19.12 0 5 10 15 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1:10 1:20 1:30 1:40 A B T S ( m g T ro lo x /g ) T F C ( m g Q u er /g ) Tỉ lệ rắn: lỏng (g/ml) TFC ABTS 30 tử cần thu nhận trong mẫu sẽ hết, cho dù tiếp tục tăng lượng dung môi sử dụng thi cấu tử sẽ không thể tăng tiếp nữa. Thực tế nghiên cứu cho thấy khi tăng tỉ lệ rắn/lỏng lên từ 1:10 đến 1:30 (g/ml). lượng TFC thu được tăng lên đáng kể, nhưng khi tiếp tục tăng lên 1:40 (g/ml). TFC tăng nhưng không có sự khác biệt khi xử lý thống kê. Tương tự, khi ghi nhận trên hoạt tính khử gốc tự do ABTS* của dịch chiết thu nhận được. Từ đó, tôi chọn tỉ lệ rắn lỏng 1/30 (g/ml) là tỉ lệ phù hợp nhất cho việc trích ly flavonoid từ củ cải trắng bằng dung môi etanol 700. 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ trích ly Trạng thái cân bằng và tốc độ truyền khối (hệ số khuếch tán) của quá trình trích ly rắn lỏng chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ. Theo lý thuyết, khi nhiệt độ tăng, sự thấm và hòa tan của dung môi tăng, độ nhớt giảm, vì thế làm tăng hiệu quả và tốc độ trích ly. Mặt khác, nhiệt độ cao có thể làm giảm các rào cản tế bào do suy yếu thàn