Báo cáo tổng kết Đề tài Nghiên cứu phân lập và định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn vibrio parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (ahpnd) trên tôm biển

acillus sakei 2a sản sinh ra một loại bacteriocin có tên là P. sakacin ức chế đáng kể sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây hỏng thịt, cá, do đó chúng còn ứng dụng rộng rãi trong việc bảo quản các sản phẩm thịt lên men và một số sản phẩm cá (Milton, 2005). Nghiên cứu của Reid (1999) và Vázquez et al. (2005) cho thấy Lactobacilli mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ bởi chúng có khả năng: bám vào tế bào; ngăn chặn hoặc giảm sự bám vào tế bào của các tác nhân gây bệnh; cạnh tranh dinh dưỡng với vi khuẩn gây bệnh; kích thích miễn nhiễm cho vật chủ, tồn tại và tăng mật số trong vật chủ, tạo ra acid, H2O2 và bacteriocin để kháng lại sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh, và cân bằng vi sinh đường ruột. Schillinger và Lucke (1989) đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của Lactobacillus sake được phân lập từ thịt. Nghiên cứu chỉ ra rằng bacteriocin thô thu được từ dịch nuôi L. sake có khả năng ức chế nhiều loài Lactobacilli và Listeria monocytogenes. Nguyễn Thị Hoài Hà và ctv (2005) đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của loài Lactobacillus plantarum L24 được phân lập từ nước dưa chua. Kết quả cho thấy bacteriocin do loài này sinh ra thuộc nhóm II và lượng bacteriocin sinh ra bị ảnh hưởng bởi các nguồn nitơ vô cơ khác nhau khi được thêm vào môi trường nuôi. Todorov và Dicks (2007) nghiên cứu bacteriocin ST712BZ – một bacteriocin được tạo ra bởi Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ Boza (một thức uống truyền thống của Bulgaria được tạo ra từ sự lên men của nhiều loại ngũ cốc). Kết quả nghiên cứu cho thấy bacteriocin ST712BZ ức chế được nhiều loài vi khuẩn như: Lactobacillus casei, Escherichia coli,...bên cạnh đó thì việc thay đổi khối lượng của một số thành phần môi trường nuôi có ảnh hưởng tới hoạt tính của bacteriocin này. 26 Karthikeyan và Santosh (2009) đã phân lập và mô tả một loại bacteriocin được tạo ra từ Lactobacillus plantarum, loài vi khuẩn được phân lập từ ruột tôm sú (Penaeus monodon), bacteriocin này đã kháng lại được một vài vi khuẩn gây bệnh như: Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Staphylococcus aereus,... Kết quả nghiên cứu của Riaz et al. (2010) cho thấy bacteriocins được tạo ra từ các dòng vi khuẩn Lactobacillus fermentum và Lactobacillus acidophilus được phân lập từ yogurt, phân gà,... có khả năng ức chế sự phát triển của dòng vi khuẩn Escherichia coli kháng lại kháng sinh cephalosporin. Bacteriocin hay những chất giống bacteriocin từ vi khuẩn lactic mà đặc biệt là giống Lactobacillus có khả năng ức chế lại nhiều loài vi khuẩn gây bệnh đã được nghiên cứu và công bố bởi nhiều tác giả (Harris et al. (1989), Tahara et al. (1996), Chung (2003), Hernández et al. (2005), Mezaini et al. (2009), Gong et al. (2010). Bên cạnh đó nhiều nghiên cứu cho thấy rằng thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đến sự tạo ra bacteriocin (Leroy và Vuyst (1999), Ogunbanwo et al. (2003), Todorov và Dicks (2005), Mollendorff et al. (2009), Sarika et al. (2010), Wang et al. (2010)). + Một số nghiên cứu về probiotic Probiotics là những vi sinh vật sống mà khi được tiêu thụ với lượng thích hợp sẽ mang lại những tác động có ích cho vật chủ (FAO/WHO, 2001). Việc sử dụng probiotics như thức ăn bổ sung cho vật nuôi được bắt đầu từ 1970. Chúng được trộn vào thức ăn để làm tăng sự tăng trưởng và sức khỏe vật nuôi bởi chúng giúp vật nuôi tăng khả năng kháng bệnh (Fuller, 1992). Gildberg et al. (1997) đã nghiên cứu tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống của cá hồi tuyết Đại Tây Dương khi bổ sung thức ăn khô có chứa vi khuẩn acid lactic (được phân lập từ loài cá này). Kết quả cho thấy tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống, cũng như khả năng kháng bệnh của cá có sự cải thiện rõ rệt hơn so với đối chứng do vi khuẩn lactic đã trở thành nhóm sinh vật chiếm ưu thế trong ruột cá sau thí nghiệm. Carnevali et al. (2004) đã phân lập Lactobacillus fructivorans AS17B từ ruột cá tằm (Sparus aurata) và bổ sung vi khuẩn này trong suốt thời gian nuôi cá tằm với việc sử dụng Brachinons plicatilis, Arternia salina và thức ăn khô. Kết quả cho thấy có sự giảm đáng kể tỷ lệ chết của cá so với nghiệm thức không có bổ sung Lactobacillus fructivorans AS17B. Loài Streptococcus lactis là cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn. Đây là loại ưa ấm, nhiệt độ tối ưu là 30-350C, nhiệt độ tối thiểu cho sự phát triển là 100C và tối đa là 40-500C. Trong môi trường chúng có khả năng tích tụ được khoảng 0,8-1% acid. Một số chủng tạo thành bacteriocin ở dạng nisin, là một hợp chất có tính kháng sinh được dùng trong bảo quản thực phẩm. Leconostoc mesenteroides đã được ứng dụng 27 sản xuất một loại bacteriocin gọi tắt là mesenterocin 5 chống lại vi khuẩn Listeria monocytogenes (gây ngộ độc trên thực phẩm nhưng không gây ảnh hưởng đến vi sinh vật hữu ích khác (Daba et al., 1991). Pediococcus pentosaceus FBB61 sản xuất một loại bacteriocin gọi là Pedicin A ức chế các loài thuộc giống Lactobacillus, Listeria và Clostridium (Andrea Piva và Denis Headon, 1994). Bifidobacterium infantis BCRC 14602 sản sinh một loại bacteriocin có tên là Bifidin I ức chế sự tăng trưởng của nhiều loại vi khuẩn gây hỏng thực phẩm và bệnh lây truyền qua đường thực phẩm nên có ứng dụng rất lớn trong vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm (Ahmad Cheikhyoussef, 2009). Kết quả nghiên cứu của Nowroozi et al. (2004) cho thấy các dòng Lactobacillus được phân lập từ xúc xích có mang một số thuộc tính probiotics. Klayraung et al. (2008) đã nghiên cứu một số thuộc tính probiotics của Lactobacilli được phân lập từ một số thực phẩm truyền thống của Thái Lan. Từ 563 dòng được phân lập có 3 dòng mang một số đặc tính probiotics như: tỷ lệ tồn tại cao dưới điều kiện acid và muối mật, kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh phổ biến, nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh,... + Một số kết quả nghiên cứu về việc ứng dụng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn gây bệnh Kết quả đề tài nghiên cứu của Trịnh Hùng Cường (2011) tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ về việc Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sp. trên tôm sú nuôi công nghiệp có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh Vibrio sp. đã cho ra kết quả như sau: tác giả đã tìm ra 38 dòng Lactobacillus sp. được phân lập từ các mẫu tôm thu tại Kiên Giang và Sóc Trăng. Thử nghiệm khả năng kháng Vibrio sp. Bằng phương pháp nhỏ giọt và khuếch tán giếng thạch đã được sử dụng. Trong số 38 dòng có khả năng kháng Vibrio sp., 5 dòng (ST322, ST423, KG411, ST111, ST413) có khả năng kháng mạnh, đặc biệt dòng ST322 thể hiện tính kháng mạnh nhất. 5 dòng có khả năng kháng mạnh Vibrio sp. đã được kiểm định về tác nhân kháng, kết quả cho thấy khả năng kháng này không phải do bacteriocin mà do acid lactic và một số thành phần khác tạo nên. Khảo sát ảnh hưởng của mật số chủng và thời gian nuôi đến khả năng kháng của 5 dòng trên cho thấy dòng ST322 với mật số chủng ban đầu 105, thời gian nuôi 72 giờ cho tính kháng Vibrio sp. mạnh nhất trong hầu hết các nghiệm thức thí nghiệm. Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy dòng ST322 tương đồng 100% với Lactobacillus suntoryeus LH5. Qua các kết quả thí nghiệm cho thấy dòng ST322 có triển vọng để tiếp tục nghiên cứu sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Kết quả thí nghiệm còn cho thấy trong tổng số 38 dòng Lactobacillus sp. phân lập được kiểm tra khả năng kháng Vibrio sp. thì dòng ST322 28 tạo đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất (13,7mm) và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đường kính vòng vô khuẩn được tạo ra bởi các dòng Lactobacillus sp. Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An (2008) đã nghiên cứu thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu. Kết quả cho thấy lượng bacteriocin thu nhận tương đối cao. Công ty Trách nhiệm Hữu hạn Công nghệ Sinh học Dược NANOGEN đã nghiên cứu và thương mại hóa chế phẩm Microcin. Chế phẩm chứa reuterin – một bacteriocin chiết xuất từ Lactobacillus reuteri, loàivi khuẩn cộng sinh đường ruột. Chế phẩm đã được khảo nghiệm bởi tiến sĩ Bùi Quang Tề thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I. Qua kết quả thử kháng sinh đồ chứng tỏ chế phẩm có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh ở cá nước ngọt như: Aeromonas hydrophila, Edwarsiella tarda, Streptococcus sp. ở nồng độ thử từ 10 – 60µl. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Trai (2011) phân lập vi khuẩn Lactobacillus sp. có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ và đốm đỏ trên cá tra tạiViện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã cho ra kết quả như sau: 45 dòng Lactobacillus sp. đã được phân lập tách ròng từ dạ dày – ruột của cá tra và cá rô phi thu ở 5 tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong số 45 dòng Lactobacillus sp. phân lập, 43 dòng có khả năng ức chế cả Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh gan thận mủ và đốm đỏ ở cá tra khi được kiểm tra bằng phương pháp nhỏ giọt. Kết quả nghiên cứu của Lewus et al. (1991) cho thấy các dòng vi khuẩn lactic mà đặc biệt là các loài thuộc giống Lactobacillus có khả năng ức chế được nhiều vi khuẩn gây bệnh mà trong đó có Aeromonashydrophila, Staphylococcus aureus, Listeria monogenes,... 2.4 Ứng dụng vi sinh vật hữu ích trong nuôi trồng thuỷ sản Chế phẩm sinh học hay việc sử dụng vi khuẩn có lợi đã được ứng dụng rộng rãi để kiểm soát mầm bệnh theo nhiều cơ chế khác nhau và ngày càng được sử dụng rộng rãi để thay thế thuốc kháng sinh. Gần đây chúng được sử dụng nhiều trong Nuôi trồng Thuỷ sản (Gatesoupe, 1999; Gomez-Gil et al., 2000; Verschuere et al., 2000; Irianto và Austin, 2002; Bachère, 2003). Sự cạnh tranh về không gian sống hay sự kháng trực tiếp mầm bệnh là những yếu tố quan trọng mà các chế phẩm sinh học tác động làm giảm sự nhiễm bệnh và thời gian tồn tại của mầm bệnh. Các lợi ích của chế phẩm sinh học như: cạnh tranh loại trừ các vi khuẩn gây bệnh (Garriques và Arevalo, 1995; Moriarty, 1997; Gomez-Gil et al., 2000; Balca’zar, 2003; Balca’zar et al., 2004; Vine et al., 2004a), cung cấp nguồn dinh dưỡng và enzyme cho sự tiêu hoá (Sakata, 1990; Prieur et al., 1990; Garriques và Arevalo, 1995), hấp thu trực tiếp chất hữu cơ hòa tan bởi vi khuẩn (Garriques và Arevalo, 29 1995; Moriarty, 1997) và tăng hệ thống miễn dịch để chống lại mầm bệnh (Kamei et al., 1988; Girones et al., 1989; Direkbusaracom et al., 1998). Mariel., et al (2004) đã nghiên cứu việc lựa chọn vi khuẩn có lợi từ chế phẩm sinh học và nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) đã cho ra kết quả như sau: tác giả đã phân lập được tổng cộng 80 dòng vi khuẩn từ gan tuỵ của tôm khoẻ ngoài tự nhiên (trọng lượng 30 ±5g) ở Manglaralto-Ecuador và kiểm tra khả năng ức chế của chế phẩm sinh học này lên Vibrio harveyi (S2) trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và định danh được 3 dòng là Vibrio P62, Vibrio P63 và Bacillus P64 có khả năng kháng lại với vi khuẩn Vibrio harveyi (S2). Khi phân lập trên gan tụy của tôm thì 3 dòng P62, P63, và P64 chiếm tỉ lệ phần trăm tương ứng 83, 60, và 58% bằng phương pháp RAPD với 3 đoạn mồi. Tỉ lệ phần trăm ức chế vi khuẩn Vibrio harveyi (S2) được nghiên cứu bởi 3 dòng P62, P63, và P64 tương ứng là 54%, 19% và 34%. Khi phân tích mô bệnh học đã chỉ ra rằng thí nghiệm ác chế và tương tác đã cho kết quả là khi sử dụng các dòng probiotic thì mầm bệnh không xuất hiện. P62, và P64 có ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch (bên ngoài ao nuôi). Chỉ số đáp ứng miễn dịch cao hơn có ý nghĩa trên tôm khi sử dụng P64 và Vibrio alginolyticus. Trọng lượng của tôm cao hơn có ý nghĩa thống kê so với đối chứng khi sử dụng 3 dòng Probiotic này. Tóm lại, việc phân lập dòng Bacillus P64 chỉ ra rằng khi sử dụng vi khuẩn này tôm vừa tăng hệ thống miễn dịch và có được đặc tính của probiotic (ức chế vi khuẩn có hại) trong khi Vibrio P62 chỉ có tác dụng tốt như probiotic. Các vi khuẩn được sử dụng như chế phẩm sinh học: Vibrio (Griffith, 1995; Garriques and Arevalo, 1995), Bacillus ssp (Moriatrty, 1998; Rengpipat et al., 1998) và Thalassobacter utilis (Maeda and Lioa, 1992). Hầu hết những nghiên cứu đã phân lập các dòng probiotic từ nước nuôi tôm (Nogami and Macda, 1992; Direkbusarakom et al., 1997; Tanasomwang et al., 1998), hoặc từ các ao nuôi thâm canh của các loài tôm thẻ khác (Rengpipat et al., 2000). Gomez-Gil et al. (1998) đã chứng minh rằng ở các loài tôm thẻ khoẻ mạnh có đa dạng các loài vi khuẩn vibrio trong gan tụy của tôm. Tuy nhiên, không có báo cáo nào công bố đã sử dụng bất cứ các dòng vi khuẩn từ gan tuỵ của tôm như là chế phẩm sinh học. Khi sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thuỷ sản sẽ làm giảm các dòng gây bệnh cho vật chủ và thường xuyên làm giảm nguy cơ gây bệnh. Việc thúc đẩy hệ thống miễn dịch trong quá trình sử dụng các dòng từ chế phẩm sinh học đã được nghiên cứu bởi Rengpipat et al. (2000). Tôm tăng cường hệ thống miễn dịch và gia tăng sức đề kháng để kháng lại mầm bệnh do vi khuẩn (Rodriguez and Le Moullac, 2000). Đối với tôm, nhiều vi sinh vật có lợi kết hợp với nhau cũng được xem như là sự thúc đẩy chính các chức năng của tế bào, như là β-glucan, lipopolysaccharides và peptidoglycans (Vargas-Albores et al., 1998). Sự kết hợp từ 30 các vi sinh vật này được nghiên cứu để đánh giá khả năng chống lại vi khuẩn Vibrio và WSSV (Itami et al., 1998). Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự kết hợp của các vi sinh vật được ví như là kẻ thù (heat-killed) của Vibrio (Sung et al., 1996), phá vỡ thành tế bào của vi khuẩn và tiết ra chất men (Sung et al., 1994; Song và Hsieht, 1994). Một vài nghiên cứu đã chứng minh rằng khi sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi tôm sẽ giúp tôm tăng cường hệ thống miễn dịch trong hệ thống đáp ứng miễn dịch ở tôm. 3. Mục tiêu + Xác định được dòng vi khuẩn lactic có khả năng kháng mạnh nhất với Vibrio parahaemolyticus. + Định danh các loài vi khuẩn lactic đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. 4. Đối tượng, phạm vi và phương pháp nghiên cứu 4.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu - Mẫu tôm sú, thẻ, cá rô phi, mẫu nước, mẫu bùn được thu thập tại các ao nuôi tôm công nghiệp tại địa bàn tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng. - Mẫu vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus BL3 được phân lập và lưu trữ tại Bộ môn Bệnh học, Khoa thủy sản, trường Đại học Cần Thơ (Nguyễn Trọng Nghĩa và ctv., 2015) - Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Bệnh học Thủy sản, Trường Đại học Trà Vinh và Trường Đại học Cần Thơ từ 17/11/2014 đến ngày 17/9/2015. 4.2 Quy mô nghiên cứu - Đề tài nghiên cứu ở quy mô cấp Trường có khả năng ứng dụng rộng rãi ở các tỉnh nuôi tôm tại Đồng bằng Sông Cửu Long nói chung và tỉnh Trà Vinh nói riêng. 4.3 Phương pháp nghiên cứu 4.3.1 Dụng cụ và hóa chất + Thiết bị, dụng cụ dùng để phân lập vi khuẩn lactic. Sử dụng máy móc và thiết bị hiện có tại Bộ môn Bệnh học Thủy sản Trường Đại Học Cần Thơ và một số dụng cụ và thiết bị tại Trường Đại học Trà Vinh. Dụng cụ và thiết bị: tủ cấy vô trùng (Astec, Anh, Model50546), tủ ủ (Sanyo, Nhật, Mir 262), tủ đông sâu (-860C, MDF-U52V), tủ mát (Alaska), Máy lắc mẫu Vortex (Velp, Ý, ZX3), nồi hấp tiệt trùng (HVE 50, Nhật), tủ sấy (Menmert, Đức), cân điện tử (Sartorius, Đức, GM 612), máy ly tâm (Rotina 35, Đức), máy khuấy từ 31 gia nhiệt (Gostec, Hàn Quốc, GW-92HS), Micropipete các loại (Đức, Lab System), kính hiển vi soi nổi (Olympus, Nhật, CH 30), ống nghiệm 15 mL, đĩa petri đường kính 8 cm... Dụng cụ và hóa chất sử dụng trong kỹ thuật sinh học phân tử: các ống tuýp dùng để ly trích ADN và điện di, máy ly tâm eppendorf, máy nghiền Retsch, máy sấy chân không, máy đo OD Backman Coulter, máy PCR Perkin Elmer, máy chụp gel BIORAD UV, máy vortex, các loại ống tube chạy PCR, bộ điện di Run One 100/50 volt 13,5 cm (Mỹ), tủ lạnh -200C, microwave, tủ cấy, nồi khử trùng, tủ ủ, tủ hút, bộ micropipete, máy giải trình tự ABI 3130. Các thí nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ. + Môi trường Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Tripticase Soya Agar (TSA), Tripticase Soya Broth (TSB), Nutrient Agar (NA), Nutrient broth (NB). Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS). Man Rogosa Sharpe (MRS) + Hóa chất Hóa chất kiểm tra Catalase: dung dịch oxy già (H2O2 ,3%) Hóa chất thử oxydase: tetramethyl - p - phenylenediamine dihydrochloride 1% (được công ty Nam Khoa sản xuất dưới dạng dĩa giấy tẩm sẵn dung dịch trên) Hóa chất dùng để nhuộm Gram vi khuẩn lactic..: Iod, Fushin, Crystal violet, Ethanol (cồn) 70%, nước cất 2 lần vô trùng. Thuốc thử Kovacs dùng để thử khả năng sinh indole - Vật liệu thí nghiệm Mẫu tôm sú, thẻ, cá rô phi, mẫu nước, mẫu bùn được thu thập tại các ao nuôi tôm công nghiệp tại địa bàn tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng. Mẫu vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được phân lập và lưu trữ tại Bộ môn Bệnh học, Khoa thủy sản, trường Đại học Cần Thơ. 4.3.2 Phương pháp nghiên cứu 4.3.2.1. Thu mẫu và bảo quản mẫu - Mẫu tôm, cá rô phi, bùn và nước ao nuôi tôm được thu ở 2 tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng. Mẫu tôm biển ở mỗi tỉnh thu 30 mẫu của 6 ao tôm nuôi thâm canh (5 con/ao). Kích cỡ tôm thu mẫu là 20g/con. Mẫu cá rô phi khỏe được thu ở các ao nuôi kết hợp hoặc các ao tự nhiên. Kích cỡ cá khi thu mẫu khoảng 100g/con. Số lượng mẫu thu tương tự như thu mẫu trên tôm. Mẫu bùn cũng được thu ở 6 ao nuôi tôm thâm canh. Phương pháp thu mẫu bùn được thực hiện theo Somsiri et al., 32 (2006). Mẫu nước cũng được thu ở 6 ao nuôi tôm của mỗi tỉnh, mỗi ao thu ở 3 vị trí: đầu, giữa và cuối ao. Các mẫu nước của cùng một ao khi thu xong sẽ được trộn lẫn vào nhau. - Mẫu sau khi thu về sẽ được trữ ở 40C và mang về phòng thí nghiệm phân tích ngay. - Nguồn Vibrio parahaemolyticus BL3 gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm được lưu trữ tại Bộ môn Bệnh học, khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ (Nguyễn Trọng Nghĩa et al., 2015) 4.3.2.2 Tiến hành thí nghiệm - Phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm biển, ruột cá rô phi, bùn đáy ao và nước ao nuôi tôm Hình 1: Quy trình phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm, ruột cá rô phi, bùn đáy và nước ao nuôi tôm biển Tôm và cá rô phi được trữ lạnh và mang về phòng thí nghiệm sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng và khử trùng bên ngoài bằng ethanol 700, sau đó mổ tôm và cá rô phi để tách lấy phân cho vào ống nghiệm chứa 5 ml nước muối sinh lý đã được khử trùng, dùng que nghiền mẫu đến khi mẫu đã đồng nhất với nước muối sinh lý để lắng, sau đó dùng micropipet hút 1 ml phần dịch trong của từng mẫu cho Để lắng Mẫu nước Mẫu bùn Pha loảng trong 9 mL 0.85%NaCl solution 9 mL NaCl 0.85% Lắc đều Được khử trùng bằng cồn 70o Mổ và tách lấy phần ruột cho vào 5 mL nước muối sinh lý 0.85% đã tiệt trùng và nghiền Hút 1mL dịch nổi cho vào 5 ml MRS broth+1.5% NaCl, ủ ở 280C, 48h Pha loảng dịch nuôi 10-1, 10-2, 10-3 và hút 50 µl dịch nuôi trải đều trên đĩa MRS agar (+1.5% NaCl, 1% CaCO3, ủ ở 28°C, 48 hours) Cá rô phi hoặc tôm sú, thẻ Chọn khuẩn lạc làm tan CaCO3 cấy chuyền trên MRS agar (+1.5% NaCl, 1% CaCO3) Kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa Các dòng vi khuẩn lactic thuần được giữ trong MRS broth chứa 25% glycerol trong -800C 33 vào từng ống nghiệm có chứa 5 ml dung dịch MRS broth (+1.5% NaCl). Ủ ở 280C, 48 giờ. Sau 48 giờ tiến hành pha loãng dịch nuôi 10-1, 10-2, 10-3 trong nước muối sinh lý. Sau đó hút lần lượt 50µl từ các ống nghiệm có độ pha loãng nhỏ lên môi trường MRS agar (+ 1% CaCO3) và tiến hành trãi mẫu, đem ủ kỵ khí ở 280C trong 48 giờ. Sau 48 giờ tiến hành chọn khuẩn lạc có màu trắng đục và làm tan CaCO3 cấy ria ra các đĩa petri có chứa môi trường MRS agar (NaCl 1,5%) để tiến hành tách ròng (chọn khuẩn lạc rời, nhỏ, có kích thước, màu sắc giống nhau). Quan sát dưới kính hiển vi, chọn những dòng có hình que, cầu không chuyển động và thực hiện các test sinh hóa (nhuộm Gram, nhuộm bào tử, catalase, oxidase, indole, gelatinase) để định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc giống lactic. Cấy trữ các dòng thuần trong môi trường MRS và glycerol 25% để thực hiện cho thí nghiệm tiếp theo. Mẫu bùn khi thu về được trộn lẫn nhau, sau đó lấy 1 gam bùn hỗn hợp cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất đã tuyệt trùng, lắc đều mẫu bằng máy trộn để lắng. Dùng micropipet hút lần lượt 0,1ml phần dịch trong của mẫu bùn và mẫu nước tán đều vào đĩa thạch MRS agar + 1,5% NaCl, ủ ở 280C, 48 giờ. (Thực hiện theo phương pháp của Phạm Thị Tuyết Ngân, 2012). - Sàng lọc vi khuẩn lactic bằng các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa: nhuộm Gram, khả năng sinh bào tử, Oxydase, Catalase được thực hiện dựa trên phương pháp (Kandler and Wiss, 1986), O/F test (Parvathy and Puthuvallil, 2005). Khả năng làm tan CaCO3 của vi khuẩn lactic được thực hiện trên môi trường MRS Agar bổ sung 1% CaCO3 và 1.5% NaCl. Những khuẩn lạc có khả năng làm tan CaCO3 sau 48 giờ sẽ được cấy chuyền trên MRS agar cho đến khi thuần. 34 - Xác định tính đối kháng của chủng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus trong điều kiện in vitro. Hình 2: Quy trình xác định khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch - Phương pháp xác định tính đối kháng bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Ngô Thị Phương Dung và ctv., 2011) Vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus nhận từ Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ sẽ được nuôi sinh khối trong môi trường TSB + 1,5% NaCl trong 24 giờ, đếm mật số bằng phương pháp so màu quang phổ, pha loãng mật số khoảng 108 CFU/ml. Sau đó hút 50µl dịch nuôi này cho vào môi trường NA + 1,5% NaCl đã được rót ra đĩa Petri, trãi mẫu, đặt vào tủ mát 40C 1 giờ. Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND Phục hồi trên TCBS agar ở 28oC, 24 giờ Hút 50 µl dịch ly tâm vào giếng Nhuộm Gram để kiểm tra tính thuần Nuôi tăng sinh trong 5 ml môi trường NB (+1.5% NaCl) trong 24 giờ Pha loảng vi khuẩn đến mật độ 108 CFU/ml Vi khuẩn lactic Nuôi trong 5 ml môi trường MRS broth + 1.5% NaCl (ủ 28°C, 48 giờ) Ly tâm với tốc độ 10,000 rpm, 4°C, 20 phút Trãi 50 µl dịch nuôi lên bề mặt môi trường NA agar (+1.5% NaCl) Tạo giếng với đường kính 6mm Đo đường kính vô trùng Hút 1mL dịch nuôi vào ống eppendorf Ủ ở 28oC, 24 giờ Cấy chuyền trên môi trường NA agar (+1.5% NaCl) ủ 28oC, 24 giờ 35 Các dòng vi khuẩn lactic sẽ được nuôi trong ống nghiệm có chứa 5 mL MRS broth + NaCl (1,5%), ủ ở 280C trong 48 giờ. Tiếp theo hút 1mL dịch nuôi cấy cho vào eppendorf ly tâm 10000 rpm trong 20 phút ở 40C. Sau đó hút dịch ly tâm sang 1 eppendorf mới đã được khử trùng (chỉ hút phần dịch trong). Các đĩa petri chứa môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl có chứa vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được đục lỗ thạch tạo các giếng có đường kính 6mm (mỗi đĩa đục 4 lỗ: 3 lỗ cho dịch ly tâm vào và 1 lỗ đối chứng cho nước cất vô trùng vào). Dùng micropipet hút lần lượt 50μl dịch ly tâm của vi khuẩn lactic bơm vào mỗi lỗ thạch, ủ ở 280C, 24 giờ. Đọc kết quả: + Sau 24 giờ lấy các đĩa petri này ra quan sát, ghi nhận khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus thông qua sự hình thành vòng vô khuẩn và đường kính của vòng vô khuẩn. + Cách đọc kết quả dựa theo phương pháp của Ngô Thị Phương Dung et al., 2012. Khả năng kháng khuẩn được chia thành 3 loại (+): vòng vô trùng<11mm; (++): vòng vô trùng11-16mm; (+++): Vòng vô trùng> 16mm. - Thử nghiệm khả năng tạo ra bacteriocin và tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic với Vibrio parahaemolyticus. Năm dòng vi khuẩn lactic có khả năng kháng mạnh Vibrio parahaemolyticus được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch như nêu trên nhưng có sự khác biệt là dịch nuôi cấy được điều chỉnh pH về 6,4. Phương pháp được thực hiện theo Schillinger (1989) và Venema et al (1997). Lấy 80 µl dung dịch bacteriocin nhỏ vào mỗi giếng của đĩa thạch đã được tán đều vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Tiến hành ủ mẩu ở 40 C trong 60 phút cho dung dịch trong giếng khuếch tán. Sau đó, đĩa được ủ ở 280 C trong 24 giờ. Xác định và chọn lọc tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic Hoạt tính kháng khuẩn của những dòng vi khuẩn lactic phân lập được tính bằng đường kính vô khuẩn quanh khuẩn lạc hay quanh miệng giếng trên đĩa. Tính kháng khuẩn được biểu hiện khi đường kính vòng vô khuẩn rộng hơn 2 mm. So sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng và chọn lọc những dòng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn cao. - Thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau ảnh hưởng lên mật số của vi khuẩn lactic (chọn 5 dòng kháng mạnh nhất). Mục tiêu: Xác địn