Báo cáo Xác định giá trị sinh học – giá trị nhiệt lượng của thực phẩm

(CS-Chemical Score) Tỷ số các axit amin cần thiết trong protein nghiên cứu so với axit amin trong protein chuẩn (thường dùng trứng hay mô hình axit amin mà tổ chức Nông Nghiệp và Lương Thực thế giới (FAO) / Tổ chức Y Tế thế giới (WHO) đưa để làm protein tham khảo). CS = a x 100 b Trong đó: a = hàm lượng axit amin có trong protein nghiên cứu ( mg/g protein) b = hàm lượng axit amin cùng loại trong protein tham khảo ( mg/g protein) Axit amin có chỉ số hoá học thấp nhất sẽ là “yếu tố hạn chế thứ nhất”. Axit amin hạn chế phần nhiều là methionein + cysteine, lysine, tryptophan, threonine nên thường chỉ so sánh 4 loại axit amin này. Đây là phương pháp phân tích đối chiếu các axit amin để tính tỉ lệ tận dụng protein thức ăn, còn gọi là phân loại axit amin. => Việc xác định giá trị dinh dưỡng của protein giúp ta xác đinh được lượng protein đưa vào cơ thể ,từ đó có sự điều chỉnh cho hợp lý Tỉ lệ tiêu hoá protein (TD): Lượng hoặc mức độ protein thức ăn được hấp thụ sau khi đã qua tiêu hóa: tỉ lệ tiêu hoá protein được tính dựa vào việc đo lượng nitơ trong phân và trong thức ăn TD(%) = I-(F-Fm) x 100% I Trong đó: I : Nitơ thức ăn F : Nitơ phân Fm : Nitơ chuyển hoá phân(Nitơ vi sinh vật đường ruột) – được đo trong phân trong trường hợp cơ thể được nạp thức ăn đầy đủ năng lượng nhưng hoàn toàn không hấp thu protein) Nếu bỏ qua Fm thì kết quả có được sẽ gọi là “ tỉ lệ tiêu hoá bề ngoài“, nếu tính cả Fm thì gọi là “tỉ lệ tiêu hoá thực“ hay “tỉ lệ tiêu hoá“. Ví dụ: Tỉ lệ tiêu hoá albumin trong trứng các loại là 98% nghĩa là: khi ăn 100 g protein trong trứng các loại sẽ có 98g được hấp thu vào cơ thể thông qua tiêu hoá , 2g không được tiêu hoá hấp thu, thải ra ngoài theo phân . Lưu ý: Tỉ lệ tiêu hoá của protein động vật thường cao hơn thực vật. Tỉ lệ này phụ thuộc vào 2 yếu tố: cơ thể (trạng thái toàn thân,tinh thần, tình cảm, cảm quan đối với thức ăn, tập quán ăn uống, chức năng tiêu hoá…) và thức ăn (thuộc tính, cách chế biến, thức ăn ăn cùng…). Để xác định lượng nitơ trong các mẫu ta sẽ sử dụng phương pháp Kjeidahl Giá trị sinh học protein (BV-Biological Value): Giá trị sinh học protein hay tỉ lệ tận dụng protein thức ăn: tỉ lệ phần trăm của Nitơ tích trữ chiếm trong lượng Nitơ hấp thu. BV = Lượng Nitơ tích trữ x 100 Lượng Nitơ hấp thu Trong đó: Lượng Nitơ tích trữ = I - ( F - Fm) - ( U - Um) Lượng Nitơ hấp thụ = I - ( F – Fm ) Với I, F, Fm giống như trên U: Nitơ niệu Um: Nitơ có từ trong nước tiểu (Nitơ niệu khi trong bữa ăn không có protein ) BV cao hay thấp phụ thuộc vào sự cấu thành các axitamin của prôtein (về chủng loại , số lượng , tỉ lệ tương hỗ lẫn nhau của các axitamin cần thiết có trong đó). Nếu sự cấu thành các axitamin gần hoặc tiếp cận với loại protein mà cơ thể đòi hỏi thì giá trị sinh học của nó cao,ngược lại sẽ thấp. BV chỉ phản ánh mức độ tận dụng protein sau khi được tiêu hoá hấp thu khi vào cơ thể , còn quá trình tiêu hoá hấp thu protein phải chịu ảnh hưởng của rất nhiều nhân tố .Vì thế ta lại có thêm tỉ lệ tận dụng protein NPU. => Nguyên tắc : Nên dùng động vật làm đối tượng thử nghiệm, lấy protein được tính làm nguồn nitơ duy nhất trong bữa ăn. Bảng: Giá trị sinh học của protein thức ăn thường dùng. Protein Giá trị sinh học Protein Giá trị sinh học Protein trứng gà 94 Đậu nành sống 57 Lòng trắng trứng gà 83 Khoai lang 72 Lòng đỏ trứng gà 96 Khoai tây 67 Sữa bò tách bơ 85 Ngô 60 Cá 83 Đậu nành chín 64 Thịt bò 76 Lạc 59 Thịt lợn 74 Tỉ lệ tận dụng protein (NPU-Net Protein Utilization): Tỉ lệ lượng Nitơ giữ lại so với lượng Nitơ ăn vào hay tỉ lệ protein giữ lại so với protein ăn vào, bao gồm cả giá trị sinh học BV và hệ số tiêu hoá D của protein. NPU = BV. D = Nitơ giữ lại x 100% Nitơ ăn vào NPU gồm cả quá trình tiêu hoá và hấp thu. Hiện nay khẩu phần ăn với protein có NPU xung quanh 70 được khuyến cáo là thích hợp cho phần lớn đối tượng ,tuy nhiên ở trẻ em chất kượng protein đòi hỏi tốt hơn là do trong những tháng đầu protein là từ sữa mẹ , sau đó mới chyển dần sang chế độ ăn bổ sung vì vậy chất lượng proteincũng giảm dần ở những lứa tuổi lớn gần với chế độ ăn của người trưởng thành. Tỉ lệ hiệu quả của protein hay Hệ số tăng trọng (PER: Protein Efficiency Ratio): Phản ánh tỉ lệ hiệu quả mà protein được tận dụng cho sự sinh trưởng của chuột theo những điều kiện quy định ( hay hiểu đơn giản hơn : tỷ số phản ánh số g trọng lượng chuột tăng lên trên số gam protein sử dụng ở chuột đang lớn ). Hệ số tăng trọng càng cao chứng tỏ protein càng tốt PER = Trọng lượng tăng thêm của động vật (g) x 100 Protein đã ăn (g) => PER dùng để đánh giá chất lượng của protein. Phần trăm năng lượng protein được sử dụng (NDp Cals%: Net-Dietary calories percent): Các xét nghiệm trên chỉ đánh giá về chất lượng protein . Để thể hiện về chất và lượng protein trong khẩu phần ăn, ta sẽ xem xét đến NDp Cals % (phần trăm năng lượng protein được sử dụng ) NDp Cal% = ( NPU) . (% năng lượng do protein) Tỉ lệ protein tịnh NPR: Tỉ số giữa nhóm động vật chênh lệch về cân nặng được nuôi lần lượt bằng protein thức ăn thử nghiệm và bằng thức ăn không có protein có năng lượng tương đương với lượng protein ăn vào. NPR = Trọng lượng tăng bình quân (g) + Trọng lượng giảm bình quân (g) Protein ăn vào (g) NPR dùng để tính tỉ lệ tận dụng protein thức ăn . Phương pháp phân tích thành phần acid amin: Axit amin là đơn vị cấu tạo cơ sở của peptit và protein, các axit amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit (-CO-NH-) tạo thành peptit có chiều dài mạch khác nhau gọi là polypeptit, một phân tử protein có một hay nhiều chuổi polypeptit. Như vậy thông qua liên kết peptit, các gốc axit amin, nhóm amin tự do đầu N của chuỗi polypeptit ta có những phản ứng đặc trưng để định tính và định lượng protein. Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau để xác định giá trị protein của thức ăn. Một protein thức ăn có giá trị cao khi nó được sử dụng hữu hiệu, nghĩa là protein ấy có một số lượng đúng các axit amin thiết yếu và số lượng đầy đủ các axit amin không thiết yếu. Đã từ lâu việc phân tích định tính và định lượng amino acid thường là sự kết hợp của nhiều phương pháp hoá lí và sắc ký. Có thể dựa vào phổ hấp phụ các amino acid không giống nhau để phân tích. Hoặc dựa và cấu trúc của amino acid tự do sau khi chuỗi polypeptide đã bị thuỷ phân, có thể định lượng amino acid đầu N-tận cùng bằng phản ứng Sanger hoặc Edman. Cũng như vậy, có thể xác định amino acid đầu C tận cùng nhờ phản ứng khử nhóm carboxyl với tác nhân khử NaBH4, hoặc sử dụng enzyme carboxypepitdase.. Sắc ký: Người ta có thể dùng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, ở đây chỉ giới thiệu nguyên tắc của một số phương pháp thông dụng để phân tích amino acid. Sắc ký giấy. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố giữa hai pha dung môi: dung môi cố định và dung môi di động. Dung môi cố định thường là nước giữ ở giấy sắc ký (trong điều kiện bảo hoà hơi nước, giấy có thể giữ 15-22% nước tính theo trọng lượng giấy). Dung môi di động thường là một dung môi hữu cơ bão hoà nước di chuyển trên tờ giấy theo mao dẫn kéo theo các chất trong dung dịch. Tốc độ di chuyển của từng chất không giống nhau và mỗi chất được đặc trưng bởi một trị số nhất định gọi là Rf. Có nhiều kiểu sắc ký giấy khác nhau đó là sắc ký một chiều đi lên, sắc ký một chiều đi xuống, sắc ký vòng nằm ngang và sắc ký hai chiều. Loại giấy thường dùng là Whatman số 1 và Schleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất như 4 Butanol:1 Acetic acid: 5 Nước (dùng cho chiều thư nhất); 3 Phenol: 1 Nước (dùng cho chiều thứ hai). Sắc ký lớp mỏng. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên lý thuyết của sắc ký giấy, nghĩa là cũng dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: chất hấp phụ được tráng rộng trên một phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là dung môi thích hợp. Dung môi di chuyển làm dịch chuyển các chất trong mẫu thử. Các chất hấp phụ thường dùng là silicagel, alumin oxyt, sephadex ,v.v...được kết hợp với thạch cao (gypse) để dán vào phiến kính Sắc ký khí. Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng tính chất khó bay hơi của các amino acid nên có thể sử dụng chương trình nhiệt để chuyển chúng thành các dẫn xuất (thường là N-acetyl-amin). Cho tác dụng amino acid với cồn amylic và HBr khan, sau đó cho tác dụng hỗn hợp này với anhydrit acetic. Cột thường dùng là loại Chromosorb W (60-80 mesh) có một lớp polyetylenglycol 1% (carbowax 1564 hoặc 6000). Chương trình nhiệt giữa 125o C và 155oC, tốc độ chảy 60-240 ml/phút. Phân tích bằng máy tự động Xác định trình tự (sequence) amio acid trong chuỗi polypeptid Máy phân tích amino acid trong chuỗi polypeptide tự động dựa trên nguyên tắc của phương pháp Edman, nghĩa là tách tách lần lượt từng amino acid ở đầu N tận cùng và xác định lần lượt theo thứ tự từng amino acid được tách ra đó, vì vậy có thể xác định chính xác trình tự sắp xếp của các amino acid trong chuỗi. Xác định thành phần amio acid trong chuỗi polypeptide bằng máy sắc ký lỏng cao áp-HPLC (High Liquid Pressor Chromatography ) Trước hết protein hay peptide phải được thuỷ phân băng HCl 6N ở 1100C trong ống hàn kín chứa nitrogen (để tránh sự oxy hoá phá huỷ amino acid) trong thời gian 12-15 giờ. Sau đó trung hoà hỗn hợp dịch thuỷ phân amino acid và cho vào máy phân tích tự động HPLC thành phần amino acid cùng với mẫu chuẩn amino acid. Máy tự động sẽ cho biết hàm lượng (tỷ lệ %) của từng amino acid dựa theo các đỉnh (peak) của amino acid chuẩn. cần nhớ mấy HPLC chỉ cho biết thành phần (composition) của từng amion acid chư không cho biết trình tự các amino acid Điện di Dựa vào tính chất tích điện của các amino acid trong môi trường có pH nhất định, mà có thể phân tích amino acid bằng kỹ thuật điện di. Dưới tác dụng của điện trường các amino acid tích điện dương (+) sẽ chạy về phía cực (-), các amino acid tích điện âm sẽ chay về cực (+). Do khả năng tích điện không giống nhau giữa các amino acid vì vậy chúng di chuyển không giống nhau trong điện trường. Kết qủa các amino acid phân bố trãi ra trên giá thể (giấy hoạc tấm polyamide). Phân tích bằng quang phổ khối Quang phổ khối (MS- mass spectrophotometer) là một công cụ phân tích với độ chính xác cao. Nguyên tắc của phương pháp này là: Dùng một chùm electron bắn vào một lượng chất thử rất nhỏ, các phân tử chất thử trước hết được phá thành nhiều mảnh ion mang điện dương trong điều kiện chân không. Các mảnh ion nhờ một bộ phân phát hiện và ghi thành pic với cường độ khác nhau tương ứng với khối lượng của mỗi ion - đó là khối phổ. Hình 1 Có nhiều loại máy quang phổ khối với mức độ phân giải khác nhau, máy có độ phân giải cao là máy có khả năng tách được hai mảnh ion có khối lượng chỉ chênh nhau phần trăm đơn vị khối. Phương pháp đồng vị Phương pháp đồng vị có thể sử dụng để xác định một hoặc vài amino acid trong hỗn hợp có nhiều loại amino acid khác nhau, hay một amino acid cần được xác định trong nhiều mẫu của một loạt thí nghiệm. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào hoạt tính phóng xạ của amino acid cùng một loại đã đánh dấu để xác định ví trí và số lượng của amino acid đó trong chuỗi polypeptide. Ngoài ra người ta có thể dùng phương pháp này để nghiên cứu tính đặc hiệu của các amino-acyl-tRNAsynthetase và tRNA Phương pháp enzyme Có thể xác định amino acid bằng phương pháp enzyme dựa trênnguyên tắc mỗi một loại enzyme có khả năng phân giải đặc hiệu một loại L-amino acid nhất định. Xác định sản phẩm tạo thành sau phản ứng với enzyme tương ứng có thể biết được amino acid trong hỗn hợp. Phương pháp vi sinh vật Một số vi khuẩn sinh trưởng trong một điều kiện thích hợp, chúng rất nhạy cảm với pH để sản xuất ra các enzyme L-amino aciddecarboxylase đặc hiệu với từng loại amino acid và hoạt động của chúng giải phóng CO2 trong môi trường. Xác định nồng độ CO2 bằng áp kế Warburg để suy ra thành phần của amino acid. Phần lớn trường hợp điều kiện pH thích hợp thường nằm trong vùng acid, ví dụ: ở pH 4,5 tạo ra L-glutamate 1-carboxy-lyase; EC 4.1.1.15 xúc tác chuyển hoá L-glutamic thành γ-amino butyric; ở pH 5,5 tạo ra L-tyosinecarboxy-lyase, EC 4.1.1.25 xúc tác chuyển hoá L-tyrosine thành Tyramine v.v... Xác định giá trị sinh học của lipid: Ta xác định giá trị sinh học của lipid bằng cách xác định thành phần acid béo không no, không thay thế trong thành phần thực phẩm có chứa lipid. Quan trọng nhất là xác định DHA Nguyên liệu Trích ly bằng dung môi chiết lỏng siêu tới hạn tổng chất chiết Chiết phân đọan lipid Phân đoạn lipid Phân tích trực tiếp TLC-FID FAB-MS HPLC- MS HPLC Phân tích và phân tách bằng dung môi CC SF TLC Chú thích : TLC (Thin-Layer Chromatography) sắc kí lớp mỏng FID (Flame Ionization Detection) sắc kí khí đầu dò ion hoá ngọn lửa FAB (Fast Atom Bombardment) : bắn phá nguyên tử MS (Mass Spectrometry) : khối phổ HPLC ( High-Perfomance Liquid Chromatograph) sắc kí lỏng cao áp CC (Column Chromatograph) : sắc kí cột SF (Solvent Fractional) : trích ly phân đoạn LIPID Ít phân cực Rất phâncực DUNG MÔI Hydrocacbons Wax ester Aldehydes Triacylglycerol Fatty alconhols Fatty acids Sterol Dyacylglycerols Monoacylglycerol Phospholipids Hexane Cyclohexan Dyethyleter Chloroform Acetone Acetonitrile Etanol metanol Phân tích DHA: Giới thiệu về acid docosahexaenoic (DHA) Acid docosahexaenoic (DHA) là một acid béo bất bão hòa đa thuộc nhóm Ω-3. DHA chứa 22 nguyên tử carbon và 6 nối đôi, có công thức tổng quát là : CH3(CH2-CH=CH)6(CH2)2COOH Trọng lượng phân tử của DHA là 328,6 và điểm nóng chảy là -440C. DHA còn được kí hiệu là 22:6n-3 và trong tự nhiên có dạng acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic. 2 3 Phương pháp ly trích, cô lập và tinh sạch DHA: Phương pháp tách phân đoạn bằng li tâm phân tử (molecular centrifugal) Acid béo của dầu cá mòi (10% DHA) được phân chia thành những phân đoạn bằng ly tâm phân tử cho đến khi được những phân đoạn chứa 5, 11, 20, 21 và 30%. Phân đoạn cuối cùng được khuấy với urê trong MeOH ở 450C, làm lạnh trong 18 giờ ở 160C, lọc, nước lọc cho tiếp xúc với nhiều urê hơn, làm lạnh ở 130C qua đêm, lọc, nước lọc được cô đặc và tái xử lý với urê. Nước lọc cuối cùng được rót vào nước, dung dịch nước này được trích ly với ether, , làm khan dung dịch eter với Na2SO4 và dung môi được loại bỏ. Sản phẩm bây giờ chứa 88% DHA, và được làm tinh khiết hơn bằng cách chuyển thành methyl ester, đi qua silica gel, giải li bằng dung môi ether dầu hỏa, và loại bỏ những tạp chất còn dư bởi sự chưng cất phân tử. Phương pháp CO2 siêu tới hạn (supercritical carbon dioxide) CO2 siêu tới hạn (SC-CO2) là một chất thích hợp để trích ly các chất không phân cực (triacylglycerol). Hiệu quả trong việc sử dụng SC-CO2 và hỗn hợp ethanol để trích ly và phân đoạn các phospholipid từ trứng cá hồi đã được khảo sát. Sự trích ly được thực hiện ở nhiệt độ 330C và áp suất thấp 17,7MPa để tránh sự oxide hóa các acid béo bất bão hòa đa. Các phospholipid đươc trích ly hiệu quả với 10, 15 hay 20% ethanol trong SC-CO2. Lượng phospholipid được trích ly tăng cùng với sự bổ sung ethanol (với hỗn hợp 20% ethanol, có 80% các phospholipid được thu nhận). Phương pháp trích bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid extraction – SFE) Các acid béo được trích ly bằng cách sử dụng “máy trích CO2 lỏng siêu tới hạn” (Supercritical Fluid CO2 Extraction Machine). 3 mức áp suất khác nhau (200, 240 và 280 bar), 3 mức nhiệt độ khác nhau (35, 40 và 450C) và 5 khoảng thời gian khác nhau (60, 120, 180, 240 và 300 phút) được chọn. Điều kiện lý tưởng nhất cho sự trích ly acid béo bất bão hòa đa được xác định là áp suất 280 bar ở nhiệt độ 400C và 300 phút. Phương pháp sắc ký cột CC (Column Chromatography) Các acid béo bất bão hòa (C ≥ 16) và những dẫn xuất của chúng được tách bởi sắc ký cột sử dụng CO2 siêu tới hạn hoặc CO2 lỏng như là pha động và oxit nhôm đã xử lý với kiềm như là pha tĩnh. Phosphate kim loại cũng được sử dụng như là tác nhân tách chiết các acid béo bất bão hòa và các chất tương đồng của chúng. Các tác nhân tách chiết bao gồm các muối phosphoric acid với Ag (và các kim loại khác). Hỗn hợp chứa ethyl eicosapentaenoate và ethyl docosahexaenoate được: Đưa lên sắc ký cột silica gel phủ Ag phosphate Cột được giải li với hỗn hợp n-hexane và n-hexane-isopropanol để thu nhận lượng ester. Phương pháp sắc ký cột ion bạc cũng được dùng để thay thế cho việc trích pha rắn để tách các acid béo methyl ester. Cột trích pha rắn loại Bond Elut SCX (0.5g propylbenzene sulphonic acid) được cân bằng bởi 5ml NaOH 1M, 10ml nước, 5ml HCl 4M, nước cho đến khi đạt pH trung tính và tiếp tục với acetonitrile-nước (10:1). Cột được bọc lại trong cuộn nhôm để tránh ánh sáng.Cột được chuyển sang dạng ion bạc bằng cách cho ngấm kiệt từ từ 1ml dung dịch AgNO3 (40mg AgNO3 trong 1ml acetonitrile-nước 10:1). Sau đó cột được giải ly lần lượt với 5ml acetonitrile, 5ml acetone và 10ml dichloromethane, 0,1ml dichloromethane chứa không quá 1mg acid béo methyl ester. Các (hệ) dung môi dùng để giải ly có độ phân cực tăng dần (từ dichloromethane đến acetone-acetonitrile) theo số liên kết đôi của acid béo (từ acid béo bão hòa đến acid béo 6 nối đôi). Sự giải ly tiến hành ở áp suất khí quyển (vận tốc dòng chảy 0,5ml/phút). Phương pháp bạc nitrate (silver nitrate method) DHA và các dẫn xuất của nó được cô lập từ hỗn hợp các acid béo bất bão hòa đa từ nguồn tự nhiên bằng phương pháp bạc nitrate. Phương pháp bao gồm sự tính toán lượng bạc nitrate cần để tạo phức với các acid bất bão hòa đa dựa trên số mol nối đôi có trong acid béo bất bão hòa. DHA được tách chiết và tinh sạch từ dầu cá ngừ bằng phương pháp tách chiết nhiệt độ thấp kết hợp với phương pháp kết tinh sắc ký cột Ag+/silica gel hoặc phương pháp riêng lẻ với sắc kí cột Ag+/silica gel. Dung môi giải ly cột là hỗn hợp của aceton (hoặc diethyl ether)-hexane. Một phương pháp khác được sử dụng để tinh sạch hỗn hợp các acid béo methyl ester từ dầu cá hoặc dầu thực vật là phương pháp sắc ký lớp mỏng ion bạc. Các bản mỏng silica gel được nhúng trong 1 phút vào dung dịch bạc nitrate 4% trong methanol-nước (9:1). Sau đó bản mỏng được sấy khô 2 phút dưới ánh sáng mờ trong tủ sấy thông gió và tiếp tục trong 20 phút ở 1000C. Chúng được giữ trong 1 hộp được đậy kín ở trong tối. Dung môi giải ly có thể là hexane-diethyl ether (9:1) để tách các acid béo bão hòa, acid béo có 1 nối đôi và acid béo có 2 nối đôi, hoặc là toluen-ethyl acetate (9:1) để tách tất cả các loại acid béo theo độ bất bão hòa. Tỷ lệ dung môi có thể thay đổi 1 ít theo điều kiện thí nghiệm (loại bản mỏng, độ ẩm, nhiệt độ, hình dạng của bình giải ly …) để nâng cao hiệu quả của việc phân tách. Việc thêm 1% acid acetic theo thể tích vào pha động cho phép các vết acid béo đạt độ phân giải tốt. Bảng mỏng được sấy trong tủ sấy thông gió, nhúng vào dung dịch nước đã bão hòa sodium thiosulphate trong 1 phút và rửa dưới dòng nước chảy trong 1 phút. Sau đó tiếp tục sấy khô và phun xịt với primuline để phát hiện các vết acid béo phát huỳnh quang dưới đèn UV. Phương pháp nhận danh DHA: Phương pháp sắc ký khí (gas chromatography – GC), sắc ký khí ghép khối phổ (gaschromatography/mass spectrometry – GC/MS) và sắc ký khí mao dẫn (capillary gas chromatography). Các acid béo tự do và acid béo trong triglyceride trong dầu cá biển sâu được biến đổi thành acid béo methyl ester bằng cách sử dụng tetramethylammonium hydroxide methanoal (N(CH3)4OH-CH3OH). Sau đó, các acid béo methyl ester này được phân tích bằng GC và GC/MS. Kỹ thuật sắc ký khí mao dẫn được áp dụng trong việc định danh các acid béo bão hòa chuỗi dài và acid béo bất bão hòa trong lòng đỏ trứng và gan gà. Mẫu trước tiên được làm đồng nhất và trích ly bằng cách sử dụng chloroform-methanol (CHCl3-MeOH) hay methylene chloride-methanol (CH2Cl2-MeOH) 2:1, những acid béo trong chất trích được methyl hóa với KOH-MeOH. Acid béo methyl ester được phân tích bằng sắc ký khí mao dẫn. Các Ω-3 LC PUFAs có hoạt tính sinh học dễ bị oxde hóa như EPA, DPA (docosapentaenoic acid, 22:5n-3) và DHA có thể được xác định bởi phương pháp này. Phương pháp ái lực pha rắn với ion bạc và sắc ký lớp mỏng có chỉnh đổi (affinity solidphasepurification with argentous ions and modified thin layer chromatography) Đây là phương pháp đơn giản để nhận danh DHA trong sữa bò. Phương pháp bao gồm ba bước : (1) sự methyl hóa DHA một lần trong sữa bò mà không cần phải loại béo trước (2) sự cô đặc methyl ester bằng sắc ký cột silica gel có chỉnh đổi với AgNO3 (3) sự phát hiện DHA methyl ester bằng cách sử dụng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao-tập trung vết (spot focusing-high performance thin layer chromatography). DHA được methyl hóa trực tiếp trong sữa bò và được cô đặc một cách có chọn lọc nhờ vào ái lực của nó với các ion bạc. Phương pháp này không cần sự trích ly lipid tốn hao lượng lớn dung môi hữu cơ và không cần hệ thống sắc ký khí. Phương pháp phổ hồng ngoại chuyển dạng Fourier (Fourier transform infrared spectroscopy – FT-IR) Những co giãn của nối =C-H alkene của các acid béo bất bão hòa trong dầu sẽ hấp thu ở bước sóng 3010cm-1 với những cướng độ khác nhau. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp này : nguồn sáng phát ra một chùm bức xạ đến gương cầu lõm, tại gương cầu lõm sẽ cho chùm tia phản xạ song song đập vào gương phẳng. Ánh sáng phản xạ từ gương phẳng sẽ đi vào giao thoa kế michelson rồi đi qua mẫu đến detector. Tín hiệu quang sau đó sẽ được biến đổi thành tín hiệu điện, qua bộ khuếch đại rồi và bộ máy tính lắp ghép với máy phổ. Máy tính sẽ xử lý tín hiệu và in ra phổ. Sự đo bằng FT-IR trên thực tế có thể dự đoán được thành phần của mỗi loại PUFA trong mẫu dầu được kiểm tra. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography – HPLC) hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp (high pressure liquid chromatography) Phương pháp HPLC thuộc loại sắc ký cột có pha động là chất lỏng. Khác với các loại sắc ký lỏng khác, hiệu quả phân tích của HPLC rất cao là do vật liệu nhồi cột có kích thước hạt rất bé (5-10 μm) và độ đồng nhất cao cùng với việc sử dụng nhiều đầu dò khác nhau. HPLC tỏ ra ưu việt hơn so với sắc ký khí khi phân tích thành phần của dầu cá do dầu cá không cần phải methyl ester hóa trước khi phân tích. Dầu cá khi phân tích sẽ được hòa tan vào dung môi thích hợp và được phân tích ở nhiệt độ phòng. Trong sắc ký phân bố, thông thường người ta sử dụng pha tĩnh phân cực hơn so với pha động và gọi là sắc ký thuận (normal phase). Nhưng trong kỹ thuật HPLC ngược lại người ta thường dùng pha tĩnh kém phân cực hơn và gọi đó là sắc ký pha đảo (inversed phase) (RP-HPLC). Dung môi sử dụng ở phương pháp này là dung môi phân cực, thường ít độc hại, rẻ tiền và không gây ô nhiễm môi trường (thường dùng nước có bổ sung methanol, ethanol hoặc acetonitrile). Sử dụng phương pháp tủa urê (urea complexation) để loại bỏ các acid béo bão hòa Theo những nghiên cứu gần đây, mỡ cá có vai trò rất quan trọng đối với con người bởi vì nó có chứa nhiều PUFA (polyunsaturated fatty acid – acid béo bất bão hòa đa), đặc biệt là DHA và EPA (acid eiscosapentaenoic). Tuy nhiên, lượng DHA và EPA này (đặc biệt là DHA) chiếm tỷ lệ rất thấp trong mỡ cá. Do đó đã có nhiều nghiên cứu về cách làm giàu PUFA trong mỡ cá để đưa vào sử dụng. Các PUFA có thể được làm giàu lên bằng nhiều phương pháp khác nhau như tạo tinh thể ở nhiệt độ thấp, tủa urê, lọc phân tử, tạo kết tủa với ion bạc hoặc bằng cách sử dụng lipase. Tuy nhiên, phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất để thu nhận những PUFA được làm giàu dưới dạng những acid béo tự do từ mỡ cá là phương pháp tủa urê. Đây là một phương pháp sử dụng urê để tạo tủa với các acid béo bão hòa, loại bỏ bớt các acid này ra khỏi hỗn hợp acid acid béo ban đầu. Phương pháp này dựa trên hiện tượng urê sẽ tạo thành tinh thể (kết tủa) ở nhiệt độ thấp và các acid béo bão hòa sẽ liên kết với những tinh thể urê. Bằng cách loại bỏ những kết tủa này có thể loại bỏ được những acid béo bão hòa trong hỗn hợp. Phương pháp này đã được áp dụng trên dầu gan cá tuyết và kết quả thu được là rất khả quan, hàm lượng DHA và EPA trong hỗn hợp tăng lên đến 60-85% . Cách tiến hành: Mỡ cá đem đi thủy giải để thu được những acid béo tự do. Acid béo tự do thu được sau đó sẽ được trộn lẫn với urê (10%, w/v) trong ethanol 95%. Hỗn hợp này được đun nóng kết hợp với khuấy kĩ ở 60 – 700C đến khi thành một dung dịch đồng nhất. Tỷ lệ của urê với lượng acid béo tự do theo nghiên cứu tốt nhất là 1 : 15 theo số mol. Dung dịch này sau đó được cho vào tủ đông -50C trong 22 giờ. Loại bỏ kết tủa tạo thành bằng phương pháp lọc. Nước lọc sau đó được pha loãng với một lượng nước cất và được acid hóa bởi acid H2SO4 6M sao cho pH= 2-3. Thêm vào dung dịch nước lọc một lượng hexan (hoặc ether dầu hỏa) và lắc kỹ. Dung dịch nước lọc sau đó sẽ tách làm hai lớp : lớp nước chứa urê nằm phía dưới và lớp hexan (ether dầu hỏa) chứa acid béo nằm phía trên. Thu lấy lớp hexan (ether dầu hỏa), làm khan nước, đem cô quay đuổi dung môi thu được acid béo tự do chứa chủ yếu là các acid béo bất bão hòa. Phương pháp sắc ký ghép khối phổ (gas chromatograph /mass spectrometry – G