Các kỹ thuật chủ yếu trong phân tích axit nucleic

Các kỹ thuật chủ yếu trong phân tích axit nucleic Các phương pháp tách chiết DNA, RNA Các phương pháp phân tích DNA Kỹ thuật PCR và nhóm phương pháp phụ thuộc PCR Lai phân tử Giải trình tự Tách chiết, định lượng và định tính axít nucleic Yêu cầu: DNA đảm bảo độ tinh khiết Đảm bảo nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp Các bước chính: Phá vỡ tế bào (vật liệu ban đầu) giải phóng các DNA/RNA: cơ học, nitơ lỏng, chất tẩy (SDS) là phân tử lưỡng cực kết hợp với protein màng và photpholipid làm phá vỡ màng tế bào và nhân Bổ sung các chất chống các chất hoạt hóa enzyme DNAase và làm biến tính các phân tử protein, các chất hữu cơ,.. Tách DNA khỏi các tạp chất khác Thu, rửa, và hòa tan DNA Quy trình chung: 1. Phá vỡ tế bào: Nghiền mẫu trong nito lỏng thành bột mịn Xử lý mẫu trong đệm CTAB ở 55-65 C 2. Loại bỏ protein và photpholipid: Ly tâm loại cặn, thu dịch nổi Xử lý với chloroform:isoamil Ly tâm loại bỏ các protein 3. Thu nhận DNA: Tủa DNA bằng isopropanol or ethanol Ly tâm thu tủa DNA và rửa lại bằng ethanol 70% Hòa tan DNA trong TE or nước cất Bảo quản 4C hoặc -20 đến -80 C Vai trò một số chất thông dụng: Nito lỏng: làm cho màng (thành) tế bào cứng, giòn, dễ vỡ. Hạn chế hoạt động của các enzyme phá hủy nucleotide EDTA: Hạn chế các enzyme phân hủy nội bào vì sự liên kết các ion liên quan quá trình xúc tác thủy phân DNA (ion hóa trị 2 Mg, Ca,..) Tris: điều chỉnh pH, tránh sự đứt gãy DNA trong môi trường kiềm or acid CTAB (cetryl ammonium bromide): loại bỏ polysacaride hòa tan DNA cao, hiệu quả cao ở 55-65 C. Chloroform: làm biến tính protein và loại bỏ liên kết DNA-CTAB Ethanol (2:1): tủa DNA trong điều kiện có lực ion, nồng độ muối cao isopropanol (2:1) tủa DNA trong điều kiện không có muối, loại bỏ RNA, DNA đứt gãy,.. RNAse: loại bỏ RNA, Dnase: loại bỏ DNA TE/nước cất: hòa tan và bảo vệ DNA/RNA 1.1. Phương pháp tách chiết ADN DNA có kích thước lớn do đó cần tránh các tách nhân gây đứt gãy. DNA genome (ĐV, TV) sau khi tách chiết phải có kích thước lớn (15kb-300kb). Phương pháp tách chiết cơ bản gồm 4 bước: Bước 1. Phá vở màng tế bào và màng nhân. Ở tế bào ĐV hoặc TV, bằng cách nghiền tế bào hoặc mô trong nitơ lỏng – 1960C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarcosyl) và proteinase K. Bước 2. Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu, như các protein, polysaccharide. Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamine tỉ lệ 25:24:1), lắc mạnh cho đến khi dung dịch có dạng trắng sữa (Do protein bị biến tính và kết tủa). Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha: + Pha trên cùng là pha nước chứa DNA, RNA. + Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa. + Phá dưới là dung dịch phenol: chloroform: isoamine Bước 3. Tủa axít nucleic + Tủa bằng ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở -20oC trong 30 phút hoặc ở 0oC qua đêm. Hầu như toàn bộ các phân tử axít nucleic đều kết tủa. + Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1) ở 0oC, các phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa. >>> Sau đó ly tâm ta sẽ thu được cặn (DNA, RNA), cặn được rửa bằng cồn 70% để loại bỏ muối và isopropanol còn lại. Bước 4. Hoà tan căn (DNA, RNA) và xử lý loại bỏ RNA bằng enzyme Rnase. Sau đó kết tủa lại được DNA. 1.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và mRNA Chú ý: + Phân tử RNA không bên, dễ bị phân huỷ bởi enzyme Rnase. + Rnase lại có mặt khắp nơi (ở đầu ngón tay, trong nước bọt, trong không khí…). + Rnase là một enzyme có hoạt tính cao, bền nhiệt. Do đó: Thao tác tách chiết RNA tốt nhất là ở điều kiện vô trùng, tránh tiếp xúc bằng tay trần. Tách RNA tổng số: tương tự 3 bước khi tách chiết DNA. Ngoại trừ: Tránh sự dễ phân hủy của RNA bởi enzyme RNase,tất cả các dung dịch và dụng cụ thí nghiệm được xử lý DEPC và khử trùng ở nhiệt độ cao. Cẩn thận các thao tác tránh sự nhiễm Rnase từ môi trường. Nghiền mẫu trong chất tẩy mạnh (SDS, sarcosyl), chất gây biến tính (guamidium thiocyanate), chất khử (mercaptoethanol) để ức chế Rnase nội bào và tách protein liên kết. Loại bỏ DNA bằng Dnase Tinh sạch mRNA: rRNA (80-85%); tRNA(15-20%),mRNA(1-5%), snRNA(<1%) Tách mRNA bằng đuối polyA (~100A): sắc ký ái lực trên cột (or bề mặt hạt) oligodT-cellulose Phương pháp tách chiết RNA tổng số và mRNA Tách chiết mRNA Dựa vào phân tử mRNA có đuôi poly A Do đó sau khi tách chiết được RNA toàn phần, cho qua cột sắc ký ái lực (oligod T-cellulose hoặc các viên bi từ gắn đoạn oligod T). mRNA có đuôi poly A sẽ tiên kết bổ sung với đoạn oligod T. Dùng dung dịch rửa cột, các rRNA, tRNA sẽ bị rửa trôi chỉ còn mRNA được giữ lại. Sau đó dùng dd có nồng độ muối thấp rửa cột hoặc li tâm sẽ thu được các phân tử mRNA. 2. Các phương pháp phân tích định tính và định lượng axít nucleic 2.1. Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế Các axit nucleic trong dung dịch sẽ hấp thụ ánh sáng tia cực tím (UV) trong dải từ 210 nm đến 300 nm với độ hấp thụ cực đại ở 260 nm. Vì các DNA và RNA và các nucleotide cùng có độ hấp thụ cực đại ở 260 nm, nên DNA không thể xác định bằng máy đo quang phổ trong vùng cực tím khi dung dịch bị nhiễm nucleotide và RNA. Do vậy RNA cần được loại bỏ bằng phương pháp thuỷ phân với enzyme RNase. Các nucleotide và oligonucleotide thu được từ thuỷ phân RNA cũng cần được loại bỏ, nếu không loại bỏ sẽ dẫn đến đánh giá thừa hàm lượng DNA của mẫu thử. Ngoài ra DNA xoắn kép hấp thụ ánh sáng UV ít hơn DNA xoắn đơn nên cần lưu ý đến hệ số hấp thụ khi tính toán nồng độ. Kiểm tra bằng quang phổ kế: DNA: OD260nm/OD280nm~1,8-2,0 RNA: ~2,0 Nồng độ: 1OD260nm~50ug/ml (DNA mạch kép) ~40ug/ml (RNA) ~33ug/ml (DNA mạch đơn) 2.2. Phân tích định tính bằng Phương pháp điện di Nguyên tắc của điện di: Dựa vào đặc tính phân tử (DNA, RNA) mang điện tích âm. DNA được phân tách bằng phương pháp điện di dựa trên điện tích và phân tử lượng của chính nó. Ethidium bromide (EtBr) liên kết vào các phân tử DNA và khi được kích thích bằng ánh sáng UV sẽ phát huỳnh quang da cam. Do lượng huỳnh quang tỉ lệ với lượng DNA tổng số, nên số lượng DNA có trong mẫu có thể được ước tính bằng cách so sánh huỳnh quang được tạo ra bởi mẫu chưa biết với một dãy định lượng chuẩn. Để định lượng chính xác hơn về hàm lượng DNA thì RNA phải được loại bỏ bằng phương pháp enzyme Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào: + Điện tích, kích thước và cấu trúc không gian của phân tử. + Nồng độ của chất cấu thành gel. - Gel sau khi điện di được nhuộm với chất ethidium bromide, EtBr xen vào giữa các base và soi dưới tia UV (  300nm) axit nucleic sẽ có màu đỏ da cam. Có 2 loại gel sử dụng điện di: + Gel agarose dùng điện di axít nucleic + Gel polyacrylamide dùng để điện di axit nucleic và protein. - Việc chọn loại gel và nồng độ gel tuỳ thuộc vào kích thước đoạn axít nucleic cần phân tách. Kiểm tra bằng điện di: So sánh với mẫu chuẫn để kiểm tra nồng độ (tương đối) - agarose 0,8-1,5% và nhuộm gel bằng EtB Polyacrylamide: Xác định trình tự DNA, tách các đoạn nhỏ Gel agarose: Đây là loại gel thông dụng nhất, sử dụng đơn giản Dùng để tách các đoạn (DNA, RNA) có kích thước từ 0,2-20Kb. Gel đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di theo phương nằm ngang. Gel polyacrylamide Dùng để tách các đoạn (DNA, RNA có khích thước nhỏ dưới 1000 cặp base. Thao tác phức tạp hơn gel agarose Mục đích sử dụng: + Tính sạch các đoạn oligonucleotide tổng hợp + Xác định trình tự DNA + Tách đoạn DNA nhỏ (trong kỹ thuật SSR, AFLP, RFLP…) + Điện di protein - Gel được đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và điện di theo chiều thẳng đứng. - Thường nhuộm bạc,có độ nhạy cao.