Chiết tách và xác định cấu trúc hóa học của limonin và obAcunon từ hạt cam sành Việt Nam

25 Tạp chí Hóa học, T. 38, số 4, Tr. 25 - 30, 2000 chiết tách và xác định cấu trúc hóa học của limonin và obAcunon từ hạt cam sành Việt Nam Đến Tòa soạn 18-02-2000 Bùi Kim Anh, Dơng Anh Tuấn Viện Hóa học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên v* Công nghệ Quốc gia Summary From seeds of Citrus nobilis two limonoids of limonin and obacunon have been isolated. Their structures were determined by spectroscopic methods, especially by 1D- and 2D-NMR spectroscopy as well as by physical constants. Mở đầu Các hợp chất limonoit thuộc lớp tetranortritecpen. Trong giới thực vật chúng tồn tại chủ yếu ở họ cam quýt (Rutaceae), họ xoan (Meliaceae) v- họ Cneoraceae. Các limonoit có nhiều hoạt tính sinh học: tác dụng hạ sốt, chữa sốt rét, chống các khối u [1, 7, 8, 9] v- đặc biệt chúng có tác dụng gây ngán ăn ở côn trùng. Một số hợp chất limonoit có tác dụng tGơng tự nhG hoocmôn lột xác đối với các ấu trùng của côn trùng [1, 6]. Nhằm thăm dò khả năng dùng các hợp chất limonoit từ hạt cam, chanh của Việt Nam l-m chất bảo vệ thực vật, trGớc đây chúng tôi đP thông báo kết quả xác định h-m lGợng v- hoạt tính gây ngán ăn cho côn trùng của limonin từ hạt chanh của Việt Nam [2,10,11]. Trong b-i n-y chúng tôi thông báo việc phân lập v- xác định cấu trúc hóa học của limonin (1) v- obacunon (2), tách từ hạt cam s-nh Việt Nam. Kết quả v thảo luận Hạt cam s-nh (Citrus nobilis Lour.) sau khi đP đGợc rửa sạch, xay nhỏ v- loại chất béo bằng n-hexan, đGợc chiết bằng axeton. Dịch chiết axeton sau khi cất loại dung môi, đGợc loại tạp chất bằng ete dầu hỏa. Sau đó chiết tiếp với cồn 95% đP thu đGợc hỗn hợp limonoit l- chất rắn, m-u v-ng rơm. Phần n-y chứa chủ yếu limonin (1). Limonin đGợc tinh chế bằng cách kết tinh trong hỗn hợp diclometan/isopropanol. NGớc cái sau khi lọc tủa đGợc cô đặc dGới áp suất giảm. Cặn đGợc đGa lên cột silicagel. Giải hấp bằng CHCl3 với lGợng MeOH tăng dần sẽ thu đGợc obacunon (2). Chất 1 đGợc xác định l- limonin dựa trên các dữ liệu phổ nhG sau: phổ hồng ngoại (FTIR) cho đỉnh tại
* (KBr) 1756,7 & 1720 cm-1 (lacton v- xeton cacbonyl). Phổ khối va chạm electron (EIMS) không cho pic phân tử m- chỉ cho mảnh ở m/z = 347(100). Song, phổ khối ion hóa hóa học (CIMS) cho pic m/z = 471 [M+H]+ (100). Khối phổ ion hóa hóa học phân giải cao cho pic[M+H]+ tại m/z = 471,20204 (100) phù hợp với công thức phân tử C26H30O8. Kết quả n-y cũng đGợc khẳng định qua phổ 13C-NMR với tín hiệu của 26 cacbon v- phổ 1H- NMR với tổng số 30 proton. Phổ 1H-NMR cho 4 singulet của 4 nhóm metyl ở 1,12; 1,15; 1,20 v- 1,23 ppm. Các proton của nhóm metylen ở vị trí 12 (CH2-12) xuất hiện tại 1,48 (m) v- 1,89 (m) v- vị trí H2-11 ở 1,99 (m), trong khi các metylen proton ở vị trí 6 (H2-6) xuất hiện ở 2,41 (dd, J = 3,41; 14,78 Hz; H- 6a) v- 3,19 (t, J = 15,22 Hz; H-6b). Phù hợp với 26 số liệu đó l- tín hiệu của H-5 tại 2,55 (dd, J = 3,34; 15,72 Hz). Tín hiệu của nhóm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2122 23 24 2526 O O O O O O O O H H O O O O O O O 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2526 1 2 metylen ở vị trí 2 (H2-2) xuất hiện tại 2,74 (dd, J = 4,01; 16,45 Hz, H-2a) v- 2,87 (dd, J = 1,41; 16,46 Hz, H-2b) do tGơng tác với H-1. Tín hiệu của H-1 xuất hiện nhG một dublet rộng ở 4,27 (bd, J = 3,85 Hz). Tín hiệu của H- 9 l- một triplet ở 2,80 (t, J = 5,63 Hz), trong khi tín hiệu của proton H-15 ở vòng epoxy thuộc vòng D-lacton l- một singulet ở  4,08. Tín hiệu của nhóm metylen ở vị trí 19 thuộc vòng A-lacton xuất hiện dGới dạng 2 doublet ở 4,64 (d, J = 13,15 Hz, H-19a) v- 4,99 (d, J = 13,15 Hz, H-19b). Tín hiệu của H-17  l- một singulet tại 5,53 ppm. Sau cùng l- tín hiệu của các proton vòng furan ở vùng trGờng thấp. Tín hiệu của H-21 l- một dublet với hằng số tGơng tác vinylic nhỏ tại 7,62 (d, J = 0,85 Hz), trong khi tín hiệu của H-23 xuất hiện tại 7,56 v- H- 22 tại 6,51 (d, J = 1,73 Hz). TrGớc đây Dreyer [12] đP nghiên cứu phổ 1H-NMR của nhiều hợp chất limonoit, trong đó có limonin. Song, chỉ những tín hiệu của proton vòng furan, H-17, H- 19, H-1, H-15 v- của các nhóm metyl l- đGợc nghiên cứu. Phổ 13C-NMR của 1 cũng cho kết quả phù hợp với cấu trúc của limonin. Tín hiệu của xeton cacbon (C-7) xuất hiện tại vùng trGờng thấp 208,25 ppm, tiếp đó l- tín hiệu của 2 lacton cacbon tại 170,10 (C-3) v- 167,68 ppm (C-16). Tín hiệu của các cacbon olefinic của vòng furan xuất hiện tại 144,14 (C-23), 142,51 (C-21), 121,74 (C-20) v- 111,00 (C-22). Những tín hiệu của cacbon mang nhóm chứa oxi xuất hiện tại 80,62 (C-4), 80,07 (C-1) v- 78,58 (C-17). Hai cacbon của vòng epoxy có tín hiệu tại 67,32 (C-14) v- 54,92 (C-15). Phổ 13C-NMR của limonin trong các dung môi khác dung môi chúng tôi sử dụng (axeton - d6) đP đGợc một số tác giả công bố trGớc đây [13, 14]. Việc gán phổ 1H- v- 13C-NMR của limonin đGợc thực hiện dựa trên cơ sở phân tích phổ 1H- COSY; 1H, 13C-HMBC (bảng 1), 1H, 13C-HSQC- DEPT v- 1H-NOESY. Kết quả đGợc đGa ra ở bảng 3. Chất 2 đGợc xác định l- obacunon dựa trên các dữ liệu phổ nhG sau: Phổ hồng ngoại cho đỉnh hấp thụ của nhóm cacbonyl tại 1743,3 v- 1703 cm-1. Phổ khối va chạm electron (EIMS) không cho pic phân tử (hoặc pic phân tử quá nhỏ), m- cho pic cơ bản tại m/z 331. Song, phổ khối ion hóa hóa học (CIMS) cho pic cơ bản tại m/z 455 [M+H]+, nhG vậy chất 2 có trọng lGợng phân tử l- 454. Phổ khối ion hóa hóa học phân giải cao cho pic cơ bản tại m/z 455,20611 phù hợp với pic [M+H]+ của công thức cấu tạo C26H30O7 của chất 2 v- phù hợp với kết quả trên phổ 1H- v- 13C-NMR với tín hiệu của 30 proton v- 26 cacbon. ở phổ 1H-NMR, 5 singulet của nhóm metyl xuất hiện tại  1,12, 1,30, 1,41, 1,50 v- 1,53 ppm. Đáng chú ý ở đây l- tín hiệu của 3 nhóm metyl 19, 25 v- 26 bị dịch chuyển về trGờng thấp do ảnh hGởng không đẳng hGớng của 27 nhóm cacbonyl v- nối đôi. Tín hiệu của proton H-12a xuất hiện tại 1,49 v- bị che lấp bởi tín Bảng 1: Phổ tGơng tác xa 1H-, 13C-HMBC của limonin (1) H1 H2 H5 H6 H9 H11 H12 H15 H17 H18 H19 H21 H22 H23 H24 H25 H26 C1 x x x C3 x x C4 x x x C5 x x x x C7 x x C8 x x C9 x x x C10 x C11 x C12 x C13 x x C14 x x x C16 x C17 x x C18 x x C20 x C21 x x x C22 x C23 x x C25 x C26 x Bảng 2: Phổ tGơng tác xa 1H, 13C-HMBC của obacunon (2) H1 H2 H5 H6 H9 H11 H12 H15 H17 H18 H19 H21 H22 H23 H24 H25 H26 C1 x C3 x x C4 x x x C5 x x x x x C6 x C7 x x x C8 x C9 x x 28 C10 x x x x x C11 x x C12 x x x C13 x x C14 x x x C15 x C16 x C17 x x C18 x C19 x C20 x x x x C21 x x x C22 x x C23 x x C25 x x C26 x Bảng 3: Số liệu phổ 1H- v- 13C-NMR của limonin (1), obacunon (2) Limonin (1) Obacunon (2) Vị trí  13C  1H  13C  1H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 78,29 35,64 169,23 79,72 59,24 36,43 207,46 51,23 47,66 45,95 18,27 30,30 4,27 (bd, J = 3,85) 2,87 (dd, 1,41 v- 16,46) 2,74 (dd, 4,01 v- 16,46) 2,55 (dd, 3,31 v- 15, 72) 2,41 (dd, 3,41 v- 14,78 3,19 (t, 15,22) 2,80 (t, 5,63) 1,99 (m) 1,48 (m); 1,89 (m) 158,54 123,02 167,42 84,26 57,52 40,50 208,68 53,64 49,69 44,00 20,06 33,14 6,80 (d, J = 11,75) 5,86 (d, J = 11,75) 2,79 (dd, J = 5,3; 14,1) 2,28 (trùng); 3,15 (t, J = 14,1) 2,30 (trùng) 1,87 - 2,02 (m) 1,49 (trùng); 1,87 - 2,02 (trùng) 13 38,31 38,21 14 66,37 66,12 15 54,03 4,08 (s) 54,04 3,68 (s) 16 167,10 167,24 29 Limonin (1) Obacunon (2) Vị trí  13C  1H  13C  1H 17 77,85 5,53 (s) 78,67 5,50 (s) 18 19,92 21,29 1,12 (s) 19 65,03 4,64 (d, 13,15); 4,99 (d, 13,15) 16,86 1,53 (s) 20 121,14 121,64 21 141,62 7,62 (d, 0,85) 142,39 7,65 (bs) 22 110,01 6,51 (d, 1,73) 111,01 6,51 (bs) 23 143,40 7,56 (d, 1,73) 144,11 7,57 (bs) 24 16,94 1,15 (s) 17,11 1,30 (s) 25 20,94 1,12 (s) 32,14 1,41 (s) 26 29,41 1,23 (s) 27,18 1,50 (s) *) Hằng số tGơng tác tính bằng Hz để trong ngoặc. *) s: singulet; d = dublet; bd = dublet tù; bs = singulet tù; m = multiplet; dd = dublet kép *) Dung môi: axeton - d6 hiệu của 2 nhóm metyl, trong khi tín hiệu của proton H-12b cùng với 2 proton H2-11 xuất hiện tại vùng từ 1,87 - 2,02 ppm dGới dạng một multiplet. Tín hiệu của proton H-6a v- H-9 cùng xuất hiện nhG một multiplet ở vùng từ  2,27 - 2,34, trong khi tín hiệu của H-6b l- một triplet tại 3,15 ppm (J = 14,1 Hz). Tín hiệu của proton H-5 l- một dublet kép tại 2,79 ppm (J = 5,3, 14,1 Hz) do tGơng tác với H-6a v- H- 6b. Tín hiệu của proton vòng epoxy H-15 l- một singulet tại 3,68 ppm. So với limonin (4,08 ppm) thì H-15 của obacunon đP dịch chuyển về trGờng cao hơn ( = 0,40 ppm). Nguyên nhân l- đP có sự khác nhau về cấu dạng ở vòng A giữa 2 chất. Proton H-17 cũng cho một singulet tại 5,50 ppm. Hai proton olefinic H-1 v- H-2 cho 2 dublet tại  6,80 v- 5,86 ppm tGơng ứng với hằng số tGơng tác J = 11,75 Hz. Giá trị hằng số tGơng tác lớn chứng tỏ H-1 v- H-2 ở vị trí trans với nhau. Các proton của vòng furan cho các tín hiệu tại 7,65 (H-21), 7,57 (H-23) v- 6,51 (H-22) (bảng 3). Phổ 13C-NMR của 2 cũng cho các số liệu phù hợp với phổ 1H-NMR. Tín hiệu của xeton cacbonyl xuất hiệu tại 208,68, của A v- D- lacton cacbonyl tại 167,42 v- 167,24. Tín hiệu của hai cacbon olefinic ở vòng A-lacton xuất hiện tại 158,54 v- 123,02 (C-1 v- C-2). Bốn nguyên tử cacbon olefinic của vòng furan cho tín hiệu tại 144,11 (C-23); 142,39 (C-21); 121,64 (C-20) v- 111,01 (C-22). Các nguyên tử cacbon mang nhóm oxy của vòng A v- D- lacton cho tín hiệu phù hợp tại 84,26 v- 78,67ppm. Việc gán tất cả các tín hiệu trong phổ 1H- v- 13C-NMR của chất 2 dựa trên cơ sở phân tích các phổ 1H-COSY, 1H-NOESY, 1H, 13C-HSQC- DEPT v- 1H, 13C-HMBC (bảng 2). Phần thực nghiệm Thiết bị v hóa chất Hạt cam s-nh đGợc thu tại H- Bắc từ tháng 11/1997 đến tháng 3/1998. Phổ hồng ngoại có biến đổi Fourier (FTIR) đGợc đo trên máy IMPACT 410 của hPng Carl Zeiss Jena, CHLB Đức. Phổ khối EI-MS đo trên máy Micromass (Anh) CI-MS phân giải thGờng v- phân giải cao đGợc ghi trên máy Finigan Mỹ. Phổ 1H- v- 13C- NMR đo trên máy Bruker 400 MHz cho 1H- v- 100 MHz cho 13C-NMR. TMS đGợc sử dụng 30 l-m nội chuẩn cho 1H-NMR v- tín hiệu dung môi l-m chuẩn cho 13C-NMR. Điểm nóng chảy đo trên máy Boetius của Đức v- không hiệu chỉnh. []D đGợc đo trên máy DIP 1000 Digital Polarimeter Ver. 100-19, Đức. Sắc ký cột dùng silicagel Merck 60G, sắc ký lớp mỏng phân tích dùng bản SiO2 tráng sẵn trên đế nhôm của Merck. 500 g hạt cam s-nh đGợc l-m sạch khỏi các tạp chất cơ học, sấy khô ở 105°C trong 12 giờ, xay nhỏ v- chiết Soxhlet với 1 lít n-hexan trong 10 giờ để loại chất béo. Sau đó chiết với 1 lít axeton trong 12 giờ. Dịch chiết axeton đGợc cất loại dung môi dGới áp suất giảm, đem loại tạp chất bằng ete dầu hỏa, rồi chiết tiếp với cồn 95% đP thu đGợc 4 g hỗn hợp limonoit l- chất rắn m-u v-ng sáng. Phần n-y cho chủ yếu l- limonin (chất 1). Limonin đGợc tinh chế bằng cách kết tinh trong hỗn hợp diclometan- isopropanol thu đGợc 2,4 g limonin (hiệu suất 0,48 % theo trọng lGợng hạt khô). Limonin tinh chế đGợc có điểm nóng chảy 295 - 296°C; []D 20 = -113,5° [TLTK 1: []D 20 = -125°, axeton; mp.: 298°C]. Phần nGớc cái sau khi cô đặc thu đGợc 1,4 g. Cặn n-y đGợc đGa lên cột silicagel Merck (120 g SiO2) hệ dung môi rửa giải CHCl3-MeOH 99 : 1. Chúng tôi đP thu đGợc 3 mg obacunon có điểm nóng chảy 222- 225°C; []D 20 =- 49,7° (C = 0,6; cloroform) [TLTK 15: []D 20 = -50° (cloroform); mp.: 229- 230°C]. Lời cảm ơn: Chúng tôi xin chân th-nh cảm ơn TS. B. Fugmann v- TS. K. Justus (HPng Bayer AG, CHLB Đức) đP giúp ghi v- biện luận phổ MS v- NMR. Ti liệu tham khảo 1. W. Steglich, B. Fugmann, S. Lang- Fugmann. RệMPP Lexikon. Naturstoffe, Georg Thieme Verlag, Stuttgart. New York (1997). 2. Bùi Kim Anh. Luận văn thạc sĩ khoa học hóa học. Viện Hóa học, 1998. 3. M. J. Mendel et al. Physiology and Chemical Ecology, Vol. 22, No. 1, P. 167 - 173 (1993). 4. M. J. Mendel et al. Entomology Exp. Appl. 58, P. 141 - 4 (1991). 5. Yong-Biao Liu et al. J. of Economic Entomology, Vol. 84, No. 4, P. 1154 - 7 (1991). 6. M. J. Mendel et al. J. of Economic Entomology. Vol. 84, No. 4, P. 1158 - 1162 (1991). 7. H. Matsuda et al. Planta Medica, 64, P. 339 - 342 (1998). 8. H. Matsuda et al. Biol. Pharm. Bull. 20(3), P. 243 - 8 (1997). 9. E. G. Miller et al. Nutr. - Cancer. Hilsdale, N. J. Lawrence. Erlbaum. Assiates, Inc., Vol. 17 (1), P. 1 - 7 (1992). 10. DGơng Anh Tuấn, Bùi Kim Anh, Nguyễn Duy Trang, Phan Đình Châu. SO3B, p.100, Abstracts from ASOMPS IX. H- Nội, 24- 28 Sept. 1998. 11. DGơng Anh Tuấn, Bùi Kim Anh, Nguyễn Duy Trang, Phan Đình Châu. Tuyển tập báo cáo hội nghị hóa học to-n quốc lần thứ 3, tập 1, Tr. 52 - 55, H- Nội 10/1998. 12. D. L. Dreyer. Tetrahedron (1965), Vol. 21, P. 75-78. 13. Fortschritte in Chemie der Naturstoffe, Vol. 36. 14. Tetrahedron, Vol. 32, P. 2367 (1976).