Chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm

tỏ bệnh do mầm bệnh tương ứng đang tiến triển. Về mặt kỹ thuật mặc dù nguyên tắc của phản ứng kháng nguyên - kháng thể là đơn giản, nhưng tổ hợp kháng nguyên - kháng thể được hình thành thường khó phát hiện nếu không có những thủ thuật thích hợp. Chính vì vậy, xuất hiện những phương pháp phân tích khác nhau. Có thể nói, mỗi phương pháp là một thủ thuật phát hiện tổ hợp kháng nguyên - kháng thể. Ngoài ra, các phản ứng định lượng (thường bán định lượng) như xác định hiệu giá kháng thể có ý nghĩa quan trọng trong đánh giá đáp ứng miễn dịch tập đoàn. 1.1. Phản ứng kết tủa Phản ứng kết tủa là phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng nguyên khi có kháng thể biết trước và để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên biết trước thông qua việc phát hiện sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu, trong đó kháng nguyên là chất tan. Do kháng nguyên là chất tan nên phản ứng dù xảy ra cũng có thể không được nhận biết bởi vì tổ hợp kháng nguyên kháng thể sau khi hình thành có thể hòa lẫn (xáo trộn) cùng với dung dịch do tác động của dòng đối lưu. Để khắc phục, phản ứng này được thực hiện trong điều kiện giảm thiểu dòng đối lưu của dung dịch. Có thể thực hiện phản ứng kết tủa trong ống nghiệm nhỏ và trong keo (gel) agar (hoặc agarose). Với ống nghiệm nhỏ người ta cho kháng nguyên (dịch chiết từ bệnh phẩm, phải trong suốt) vào ống sau đó bằng ống hút (pipet) có đầu nhỏ lấy một lượng tương đương kháng huyết thanh (kháng thể), đưa đầu ống pipet vào sâu tận đáy ống nghiệm rồi nhả từ từ cho kháng huyết thanh đội dần lớp kháng nguyên lên. Kết quả ta có hai lớp dịch trong ống. Để yên ở nhiệt độ phòng, sau một thời gian (vài chục phút) nếu có phản ứng xảy ra ta sẽ thấy một vòng kết tủa màu trắng gần giữa hai lớp dịch (thường thấp hơn ranh giới giữa hai lớp dịch một chút). Kỹ thuật này thường dùng phát hiện kháng nguyên giáp mô vi khuẩn nhiệt thán (phản ứng Ascoli). Phản ứng kết tủa khuyếch tán trong thạch có một số biến thể: khuyếch tán một chiều, khuyếch tán hai chiều. Kỹ thuật khuyếch tán một chiều ít được sử dụng do phải tiêu tốn lượng lớn yếu tố phản ứng (kháng huyết thanh hoặc kháng nguyên). Người ta pha thạch (agar hoặc agarose) vào dung dịch sinh lý NaCl 0,8 - 0,85% (pH 7,2) ở nồng độ thạch khoảng 1% (0,8 - 2,0% agar, phụ thuộc vào chất lượng thạch, có thể kiểm tra bằng thực nghiệm), đun tan chảy đều rồi ủ duy trì ở 50 °C. Ở nhiệt độ này thạch ở trạng thái lỏng, có thể cho vào đó một lượng kháng nguyên (hoặc kháng thể), trộn đều rồi đổ thành bản thạch trên phiến kính (hoặc trong đĩa Petri), đục lỗ, mỗi lỗ cho một loại mẫu cần xét nghiệm. Nhỏ vào đó một lượng kháng thể (hoặc kháng nguyên). Ủ vào buồng ẩm ở nhiệt độ phòng hoặc 4 °C. Sau một thời gian nếu có phản ứng xảy ra ta sẽ thấy vòng kết tủa trắng xuất hiện quanh lỗ tương ứng. Phản ứng kết tủa khuyếch tán hai chiều được thực hiện một cách đơn giản nhất với hai lỗ nhỏ được đục trong khối thạch agarose, một lỗ chứa kháng nguyên còn lỗ kia chứa kháng thể. Ủ trong buồng giữ ẩm một số ngày và theo dõi hàng ngày, nếu phản ứng xảy ra ta sẽ thấy đường kết tủa trắng xuất hiện giữa hai lỗ (ở vùng có tỷ lệ hóa trị kháng thể và hóa trị kháng nguyên xấp xỉ 1). Tuy nhiên, phản ứng này thường có độ nhạy rất thấp do đó cần vận dụng phương pháp cải tiến như dưới đây. Trên một phiến thạch cần đục 7 lỗ (đường kính khoảng 3 mm, một lỗ ở tâm và sáu lỗ ở xung quanh (biên), đều cách lỗ tâm và cách nhau khoảng 3 - 3,5 mm. Như vậy ba lỗ liền kề nhau luôn tạo một tam giác đều. Nếu để phát hiện kháng nguyên thì nhỏ vào lỗ tâm một lượng kháng huyết thanh chuẩn (kháng thể) rồi nhỏ vào hai lỗ biên đối diện nhau một lượng kháng nguyên chuẩn. Còn bốn lỗ biên còn lại dùng để chứa các mẫu kháng nguyên cần kiểm. Ủ vào buồng ẩm, kiểm tra kết quả hàng ngày. Nếu các lỗ kiểm đều không chứa kháng nguyên tương ứng thì giữa kháng nguyên chuẩn và kháng thể chuẩn phải xuất hiện đường tủa chuẩn thẳng kéo dài từ phía một lỗ cần kiểm sang phía một lỗ cần kiểm đối diện. Nếu có kháng nguyên ở lỗ cần kiểm nào đó thì đường kết tủa chuẩn sẽ uốn cong trước lỗ đó và hướng về phía lỗ tâm. Trong trường hợp kháng nguyên ở lỗ cần kiểm có nồng độ cao, đường kết tủa trắng sẽ xuất hiện giữa lỗ đó với lỗ tâm và cùng với đường kết tủa chuẩn tạo thành một đường cong liên tục. Sự giao cắt của hai đường tủa (chuẩn và kiểm) chứng tỏ thành phần kháng thể trong kháng huyết thanh chuẩn là đa giá còn kháng nguyên kiểm, ít nhất là, có thành phần không cùng nhóm với kháng nguyên chuẩn. Để phát hiện kháng thể thì cho kháng nguyên chuẩn vào lỗ tâm, một cặp lỗ đối diện chứa kháng huyết thanh chuẩn, bốn lỗ còn lại chứa huyết thanh cần kiểm. Kết quả biểu hiện dưới dạng các đường kết tủa tương tự trường hợp trên. 1.2. Phản ứng ngưng kết Phản ứng ngưng kết là phản ứng huyết thanh học để phát hiện kháng nguyên khi có kháng thể biết trước và để phát hiện kháng thể khi có kháng nguyên biết trước thông qua việc phát hiện sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu, trong đó kháng nguyên là hữu hình (tế bào vi khuẩn, hạt nhỏ, tế bào hồng cầu,...). Nếu để phát hiện kháng thể, kháng nguyên là tế bào vi khuẩn có thể được nhuộm màu (bằng crystal violet, rose bengal), khi đó có thể thực hiện phản ứng ngưng kết nhanh với huyết thanh, với máu nguyên hoặc với sữa nguyên. Phản ứng ngưng kết nhanh với máu nguyên được thực hiện bằng cách trộn một giọt máu nguyên vừa lấy từ động vật bằng một vòng (khuyên cấy vi khuẩn) trộn với một giọt nhỏ dịch kháng nguyên đã được nhuộm màu đặt sẵn trên một phiến kính. Kết quả dương tính biểu hiện dưới dạng các hạt trong giọt co cụm lại làm cho dịch còn lại trở nên trong. Nếu không phản ứng (âm tính) các tế bào vi khuẩn nhuộm màu vẫn phân bố đều trong giọt làm dịch tiếp tục đục đều. Phản ứng này dùng để phát hiện nhanh tình hình nhiễm Salmonella gallinarum-pullorum (hay Salmonella Gallinarum-Pullorum gây bệnh bạch lị gà con và thương hàn gà trưởng thành) trong đàn gia cầm và một số bệnh nhiễm khuẩn khác. Phản ứng ngưng kết nhanh với sữa nguyên được thực hiện để phát hiện bò cái, cừu cái mang mầm bệnh sẩy thai truyền nhiễm và một số bệnh nhiễm khuẩn khác. Cho một ít sữa tươi mới vào ống nghiệm rồi cho kháng nguyên vi khuẩn đã nhuộm vào lắc trộn đều. Nếu phản ứng dương tính, các tế bào vi khuẩn sẽ co cụm lại với nhau và bám vào lớp kem nổi lên bề mặt sữa với màu thuốc nhuộm vi khuẩn kháng nguyên. Ngược lại các tế bào vi khuẩn có màu phân bố đều trong sữa khi phản ứng âm tính. Phản ứng ngưng kết nhanh cho kết quả nhanh nhưng độ nhạy thấp và không thể định lượng để so sánh hàm lượng kháng thể như phản ứng chậm trong ống nghiệm. Cho vào mỗi ống của một dãy ống nghiệm 1 phần (hoặc 4 phần, hoặc 9 phần) nước sinh lý rồi cho vào ống nghiệm thứ nhất (đầu dãy) 1 phần huyết thanh, trộn rồi chuyển sang ống nghiệm tiếp theo bằng lượng huyết thanh đã đưa vào (1 phần) và cứ tiếp tục trộn và chuyển như vậy cho đến hết dãy thì vứt bỏ bằng lượng đó. Ta có dãy huyết thanh pha loãng 2 lần (hoặc 5 lần, hoặc 10 lần). Cho vào tất cả các ống nghiệm một lượng ổn định kháng nguyên (vi khuẩn đã biết), trộn đều rồi để yên ở nhiệt độ phòng, kiểm tra phản ứng sau khoảng 10 - 30 phút. Phản ứng dương tính thể hiện ở dạng các tế bào vi khuẩn ở ống tương ứng ngưng tụ lại làm đục cả ống nghiệm, trong khi ở các ống âm tính vi khuẩn (kháng nguyên) chìm xuống đáy ống làm dịch trở nên trong. Ngưng kết thấy rõ ở những ống nghiệm có nồng độ kháng nguyên và kháng thể gần bằng nhau, vì vậy ở những ống có nồng độ kháng thể cao (đầu dãy) có thể không thấy ngưng kết. Nhờ phản ứng này ta có thể xác định được hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bị kiểm. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh (hoặc nhũ thanh,...) còn cho phản ứng dương tính. Phản ứng ngưng kết có thể thực hiện theo chiều khác để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu tức là xác định typ/dạng huyết thanh học của vi khuẩn hoặc vi sinh vật khác. Khi đó thường phải có bộ kháng huyết thanh đa giá (xác định nhóm) và đơn giá (xác định typ). Trong thực tế các virut được coi là kháng nguyên hòa tan và không thể thực hiện phản ứng ngưng kết. Tuy vậy, bằng cách gắn kết virut lên hồng cầu người ta có thể tạo được kháng nguyên hữu hình đặc hiệu virut có tính ngưng kết hoàn hảo với kháng thể và được áp dụng trong một biến thể của phản ứng huyết thanh học, phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp phát hiện và bán định lượng kháng thể. Đồng thời, kháng nguyên này cũng còn được sử dụng trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp phát hiện kháng nguyên bằng cách lấy kháng huyết thanh chuẩn cho tiếp xúc trước với bệnh phẩm chứa kháng nguyên nghi rồi đo lại hàm lượng (hiệu giá) kháng thể bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp. Sự sụt giảm hiệu giá kháng thể trong kháng huyết thanh chuẩn chứng tỏ có kháng nguyên đặc hiệu trung hòa kháng thể đó. 1.3. Phản ứng cố định bổ thể Phản ứng cố định bổ thể (CFR) hay còn gọi là phản ứng kết hợp bổ thể là phản ứng huyết thanh học phát hiện tổ hợp kháng nguyên - kháng thể thông qua vận dụng thuộc tính gây dung giải tế bào, kể cả tế bào hồng cầu, của hệ thống bổ thể (các enzym trong huyết tương động vật có vai trò trong miễn dịch không đặc hiệu) một khi hệ thống này được hoạt hóa nhờ kháng thể khi kháng thể hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể. Phản ứng này gồm hai hệ thống: 1) hệ thống phản ứng chính và 2) hệ thống phản ứng hiển thị (hệ thống phụ, hay hệ thống dung huyết). Bổ thể là một hệ thống gồm 9 protein (C1 đến C9) hòa tan trong huyết tương ở trạng thái vô hoạt và có thể được hoạt hóa theo phản ứng dây chuyền từ C1 đến C9 một khi C1 được hoạt hóa (con đường cổ điển) hoặc C3 được hoạt hóa (con đường nhánh). Yếu tố C1 được hoạt hóa nhờ phần Fc của kháng thể khi kháng thể kết hợp với kháng nguyên (Fc từ trạng thái vô hoạt sang trạng thái hoạt động của một enzym). Khi tổ hợp bổ thể được hoạt hóa một số yếu tố sản phẩm của bổ thể được hình thành và gắn kết lên cấu trúc màng tế bào chất làm hình thành tổ hợp tấn công màng (MAC - membrane attacking complex) là những lỗ khổng bất thường trên màng tế bào chất qua đó tế bào chất bị thoát ra ngoài (dung bào) (bên cạnh các phản ứng quá mẫn, viêm và hoạt hóa thực bào,...). Tuy nhiên, các bổ thể là những protein mẫn cảm với nhiệt. Đun ở 56 - 58 °C nhanh chóng làm biến tính bổ thể, trong khi nếu đun ở nhiệt độ này sau 30 phút kháng thể vẫn giữ nguyên hoạt tính. Ở hệ thống phản ứng chính người ta trộn kháng nguyên chuẩn (1 ml) với huyết thanh (1 ml) cần kiểm đã được đun nóng vô hoạt bổ thể rồi thêm vào đó một lượng ở nồng độ làm việc của bổ thể là huyết thanh chuột lang tươi mới. Sau khi ủ 15 phút ở 37 °C thì cho thêm vào đó một lượng nhất định (1 ml) hỗn hợp hệ thống phụ pha sẵn. Lại ủ như trên, sau 15 phút kiểm tra kết quả. Phản ứng chính dương tính thể hiện dưới dạng hồng cầu chìm xuống đáy ống nghiệm (phản ứng phụ âm tính). Ngược lại, phản ứng chính âm tính thể hiện dưới dạng dịch trong ống nghiệm có màu đỏ của hemoglobin (phản ứng phụ dương tính). Nồng độ làm việc của bổ thể được xác định trước (vào đầu ngày làm việc) nhờ dãy ống pha loãng dần huyết thanh chuột lang trong nước sinh lý (1 ml mỗi ống) rồi cho vào tất cả các ống trong dãy một lượng (1 ml) hỗn hợp hệ thống phụ pha sẵn. Trong hệ thống phụ này có kháng nguyên là huyền dịch 6% tế bào hồng cầu cừu trộn đều với kháng thể là kháng huyết thanh thỏ tối miễn dịch (mẫn hóa) với hồng cầu cừu gọi là hemolysin. Sau khi ủ 15 phút ở 37 °C, trong ống nghiệm có đủ bổ thể sẽ thấy dung huyết (dịch đỏ đều) còn các ống có nồng độ bổ thể quá thấp sẽ không xuất hiện dung huyết (hồng cầu chìm xuống đáy ống, dịch trên trong). Nồng độ làm việc của bổ thể là ở ống có độ pha loãng lớn nhất còn cho phản ứng dung huyết. Pha huyết thanh chuột lang tươi mới ở nồng độ này ta sẽ có dung dịch bổ thể ở nồng độ làm việc. Lượng làm việc của bổ thể được giữ ổn định (1 ml) trong quá trình thực hiện phản ứng. 1.4. Phản ứng HI (ngăn trở ngưng kết hồng cầu) Nhiều virut có thuộc tính ngưng kết hồng cầu. Chúng có thụ thể tương ứng với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, do đó kết nối các hồng cầu liền kề lại với nhau thành mạng đa chiều không chìm xuống đáy tự nhiên nhờ tỷ trọng của hồng cầu cao hơn tỷ trọng dung dịch sinh lý. Phản ứng ngưng kết hồng cầu của virut giúp ta phát hiện được sự hiện diện cũng như bán định lượng virut tương ứng. Đồng thời, người ta còn lợi dụng đặc tính này của virut để xác định sự hiện diện cũng như hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cần kiểm dưới dạng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI: hemagglutination inhibition reaction). Trước tiên người ta phải thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu để xác định hiệu giá của virut chuẩn rồi trên cơ sở đó pha dịch virut làm việc với hiệu giá 4 đơn vị ngưng kết (4 HA). Phản ứng này được thực hiện trên khay nhựa vi chuẩn độ (Microtitration plate) 96 lỗ (mỗi lỗ chứa khoảng 0,4 ml) đáy U hoặc V. Cho vào mỗi lỗ 50 μl nước sinh lý NaCl rồi cho vào lỗ thứ nhất 50 μl virut, trộn và chuyển sang lỗ thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển như vậy đến hết lỗ thứ 10 thì vứt bỏ 50 μl. Hai lỗ 11 và 12 dùng làm đối chứng âm tính chỉ chứa nước sinh lý để xác định thời điểm đọc kết quả tốt nhất. Cho 50 μl huyền dịch hồng cầu thích hợp (0,5% hoặc 1%, khối lượng tươi trên thể tích, luôn ở trạng thái khuấy đều). Trộn đều rồi để yên ở nhiệt độ phòng 15 đến 60 phút, đọc kết quả khi hai lỗ 11 và 12 có hồng cầu chìm xuống tâm đáy lỗ hoàn toàn. Hồng cầu ngưng kết tạo mạng đa chiều không chìm xuống tâm đáy lỗ khay mà dàn trải đều khắp lỗ hoặc nếu chìm chúng cũng tỏa rộng và thường tạo một lớp nhăn nheo khắp mặt đáy lỗ. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất còn cho kết quả dương tính. Nồng độ virut làm việc phải chứa 4 HA chính là nồng độ của virut ở độ pha loãng cách đó hai lỗ khay (22=4). Pha virut gốc để có nồng độ này rồi kiểm tra lại với phản ứng trong 4 lỗ khay có nồng độ 2 HA, 1 HA, 1/2 HA và 1/4 HA. Nếu dịch virut bị nhạt (tức ít nhất có một trong hai lỗ nửa bên trái không ngưng kết) thì pha thêm virut cho đủ sao cho hai lỗ đầu có ngưng kết rõ còn hai lỗ sau không thấy ngưng kết. Ngược lại nếu virut quá đặc (có ít nhất ba lỗ ngưng kết) thì pha thêm nước sinh lý để vừa đủ tạo ngưng kết ở hai lỗ. Phản ứng HI cũng được tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ, mỗi dãy lỗ khay cho một phản ứng. Đầu tiên pha huyết thanh theo cấp số 2. Cho vào mỗi lỗ 50 μl nước sinh lý NaCl rồi cho vào lỗ thứ nhất 50 μl huyết thanh kiểm, trộn và chuyển sang lỗ thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển như vậy đến hết lỗ thứ 10 thì vứt bỏ 50 μl. Cho vào mỗi lỗ từ lỗ 1 đến lỗ 11 (đối chứng âm) 50 μl dịch virut làm việc 4 HA, trộn đều và ủ 5 - 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào tất cả các lỗ (lỗ 1 đến 12) 50 μl huyền dịch hồng cầu đã dùng để xác định hiệu giá HA. Hai lỗ 11 và 12, như vậy, dùng làm đối chứng âm tính (chứa chỉ virut và hồng cầu) và dương tính (chứa chỉ nước sinh lý và hồng cầu). Để ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 15 đến 60 phút phụ thuộc vào kết quả chìm hồng cầu ở lỗ thứ 12 (đối chứng HI dương tính: hồng cầu phải chìm hoàn toàn xuống tâm đáy lỗ khay). Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà ở đó còn thấy ngăn trở được ngưng kết (hồng cầu chìm xuống đáy lỗ). 1.5. Các phương pháp kháng thể đánh dấu Các phương pháp kháng thể đánh dấu gồm phương pháp miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch phóng xạ, miễn dịch enzym và miễn dịch ferritin. Phương pháp cuối cùng áp dụng với kính hiển vi điện tử để kiểm tra cấu trúc phân tử trên bề mặt tế bào hoặc tổ chức nhờ mật độ điện tử cao của ferritin, không phổ biến trong chẩn đoán. Bản chất các phương pháp này là sử dụng các kháng thể (thường là kháng thể đơn dòng) được gắn kết (đánh dấu) với một chất phát huỳnh quang (kháng thể đánh dấu huỳnh quang), hoặc chất phóng xạ (kháng thể đánh dấu phóng xạ), hoặc một enzym chuyển hóa làm cơ chất không màu phát màu (kháng thể đánh dấu enzym). Chúng còn được gọi chung là conjugat (conjugate). Ta có conjugat trực tiếp nếu đó là kháng thể đặc hiệu epitop của mầm bệnh hay đối tượng cần nghiên cứu, hoặc là conjugat gián tiếp nếu đó là kháng thể đặc hiệu gamma-globulin của loài động vật cần nghiên cứu. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp bắt đầu bằng việc cố định kháng nguyên cần kiểm lên phiến kính hiển vi (thường bằng aceton lạnh), sau đó phủ conjugat trực tiếp 30 phút trong buồng ẩm. Rửa bằng nước rồi soi kính hiển vi huỳnh quang (trong tối) với bức xạ kích thích thích hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang gắn conjugat, nếu thấy tiêu bản phát màu huỳnh quang đặc hiệu là kết quả dương tính. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp bắt đầu bằng việc cố định kháng nguyên chuẩn nếu để phát hiện kháng thể (hoặc kháng nguyên cần kiểm) lên phiến kính hiển vi, sau đó phủ huyết thanh cần kiểm (hoặc kháng huyết thanh chuẩn), cho tiếp xúc 30 phút ở trong buồng ẩm, rửa bằng nước rồi lại phủ bằng conjugat huỳnh quang gián tiếp chống gamma-globullin loài cho huyết thanh lần phủ trước. Sau 30 phút tiếp xúc lại rửa, để khô và hiển vi huỳnh quang. Kết quả dương tính tương tự phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp. Tuy nhiên, phương pháp gián tiếp có độ nhạy cao hơn và tiện hơn do có thể nghiên cứu kháng nguyên lẫn nghiên cứu kháng thể. Phản ứng miễn dịch phóng xạ sử dụng conjugat phóng xạ. Tiến trình cũng bắt đầu bằng việc cố định (trên phiến kính hoặc trên màng), phủ và rửa tương tự phản ứng miễn dịch huỳnh quang. Tuy nhiên, kết quả phản ứng được đọc nhờ ép bản phản ứng lên một phim X-quang, để khoảng 30 - 60 phút thì rửa hiển thị phim. Vệt đen trên phim tương ứng vị trí tiêu bản cho phép kết luận kết quả dương tính. Cũng có thể đọc kết quả nhờ ống đo phóng xạ (scintillation counter) bằng cách cho tiêu bản tiếp xúc với đầu dò đọc của thiết bị. Phản ứng miễn dịch enzym gồm nhiều biến thể, sử dụng khay nhựa polystyren để hấp phụ protein (ELISA) hoặc cố định protein lên màng nitrocelluloza hay nylon (immunoanalysis, hay Western analysis). Các biến thể này đều có thể sử dụng conjugat trực tiếp lẫn conjugat gián tiếp. Phản ứng trực tiếp chỉ phát hiện được kháng nguyên trong khi phản ứng gián tiếp phát hiện được cả kháng nguyên (nếu có kháng thể đặc hiệu) và kháng thể (nếu có kháng nguyên đặc hiệu). Phương pháp ELISA trực tiếp bắt đầu từ việc cố định (hấp phụ) protein kháng nguyên cần kiểm lên đáy và thành của lỗ khay chuyên dụng (khay ELISA) nhờ phản ứng kiềm của môi trường trong một đêm. Sau khi rửa khay bằng dung dịch PBS (3 lần, có pha Tween 20 ở mức 0,5%), khay được phủ bổ sung bằng dung dịch protein huyết thanh bê hoặc albumin trứng (blocking), rửa lại rồi cho conjugat trực tiếp tiếp xúc kháng nguyên trong khoảng 1 giờ, rửa rồi cho dung dịch cơ chất của enzym vào lỗ. Nếu phản ứng kháng nguyên - kháng thể dương tính, cơ chất enzym sẽ chuyển từ không màu sang có màu và có thể đo được bằng quang phổ kế. Phản ứng chuyển màu có thể dừng bằng dung dịch NaOH hoặc H2SO4. Enzym có thể là phosphataza kiềm hoặc peroxidaza. Cơ chất enzym có thể là tetramethyl benzidin hoặc axit 5-aminosalicylic đối với enzym peroxidaza. Các chất này đều phải pha mới và pha thêm H2O2 3% trước khi dùng hiển thị phản ứng. Phương pháp ELISA trực tiếp còn có thể thực hiện dưới dạng phản ứng sandwich ("bánh mỳ kẹp thịt"), khi đó lỗ khay được gắn sẵn kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần kiểm để tăng hiệu quả gắn kết kháng nguyên với lỗ khay. Đầu tiên cho kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể gắn trong lỗ khay khoảng 30 phút rồi rửa các lỗ khay. Tiếp theo sau là phủ lỗ khay bằng conjugat đặc hiệu và các bước rửa và hiển thị như đã mô tả ở trên. Trong lỗ khay cho phản ứng dương tính như vậy có ba lớp, một lớp kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể, nên phương pháp được gọi là "bánh mỳ kẹp thịt". Phương pháp ELISA gián tiếp sử dụng conjugat gián tiếp, tức là kháng thể đặc hiệu với gamma-globulin loài cung cấp kháng huyết thanh đặc hiệu (trong phát hiện kháng nguyên) hoặc huyết thanh cần kiểm (trong phát hiện kháng thể) được đánh dấu enzym. Tương tự phương pháp ELISA trực tiếp, trong phương pháp ELISA gián tiếp để phát hiện kháng nguyên ban đầu người ta cố định dịch bệnh phẩm hay kháng nguyên (hấp phụ trong dịch pH cao, thường qua đêm) vào lỗ khay, rửa rồi phủ bổ sung (blocking) bằng dịch protein (không kháng thể, ở nhiệt độ thấp). Sau đó phủ kháng nguyên bằng kháng huyết thanh đặc hiệu mầm bệnh, rửa rồi lại phủ bằng dịch conjugat gián tiếp. Sau khi rửa kỹ, phủ lỗ khay bằng cơ chất enzym thích hợp. Phản ứng màu giúp ta xác định sự hiện diện của kháng nguyên đặc hiệu. Để phát hiện kháng thể bằng phương pháp ELISA gián tiếp, cần cố định kháng nguyên đặc hiệu vào lỗ khay, hấp phụ bổ sung bằng protein không kháng thể, sau khi rửa người ta cho huyết thanh cần kiểm vào cho tiếp xúc với kháng nguyên. Sau bước rửa, cho dịch conjugat gián tiếp, lại rửa kỹ rồi cho cơ chất enzym thích hợp để hiển thị. Phản ứng phát màu của cơ chất giúp ta xác nhận sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cần kiểm. 1.6. Phương pháp điện di miễn dịch Đây là phương pháp kiểm tra sự hiện diện kháng thể đặc hiệu virut có bề mặt tích điện âm mạnh và virut tích điện âm mạnh. Nếu cho kháng nguyên và huyết thanh cần kiểm được điện di song song trong một bản keo (gel) agarose hoặc agar thì nếu trong huyết thanh có kháng thể đặc hiệu sẽ xuất hiện vết kết tủa ở dải giữa hai làn điện di. Phương pháp này thường để kiểm tra bệnh cảm nhiễm virut Aleutian ở chồn mink. 2. Chẩn đoán bằng phản ứng quá mẫn muộn Phản ứng quá mẫn muộn để phát hiện miễn dịch tế bào ở trong cơ thể và vận dụng với một số bệnh thú y hình thành miễn dịch tế bào như bệnh lao, bệnh tỵ thư, bệnh Johne (á lao) và bệnh sẩy thai truyền nhiễm. Lấy dịch chiết từ lứa cấy tế bào vi khuẩn nuôi cấy lâu ngày ta được "dị ứng nguyên quá mẫn muộn", với bệnh lao gọi là tubercullin, với bệnh sẩy thai truyền nhiễm là brucellin, với bệnh tỵ thư là mallein và với bệnh Johne là johnin. Ngoài ra phản ứng này còn thực hiện với bệnh sán lá gan, sán nang (Echinococcus), bệnh cảm nhiễm Toxoplasma, bệnh cảm nhiễm nấm Histoplasma và bệnh nấm sợi của da (do Trichophyton),... Các phản ứng này phát hiện cảm nhiễm trong quá khứ nhưng nhiều khi là bệnh đang tiến triển. Tiêm tubercullin vào trong da (nội bì) nếu phản ứng dương tính ta thấy chỗ tiêm viêm tấy đỏ và cứng vào khoảng 72 giờ. Các dị ứng nguyên quá mẫn muộn khác cũng có thể áp dụng và cho kết quả tương tự. Ngoài ra, ở động vật để tiện thực hiện, phản ứng có thể là dưới da (tiêm kháng nguyên vào dưới da), trong mắt (nhỏ kháng nguyên vào niêm mạc mắt). Phản ứng dưới da có thể xác định kết quả nhờ đo độ dày chỗ da bị tiêm trước khi tiêm và sau khi tiêm 1 - 3 ngày và có thể vận dụng với hầu hết tất cả các bệnh nêu trên. Riêng bệnh tỵ thư ở ngựa phản ứng trong mắt khá tiện lợi, buộc ngựa cần kiểm tra vào chỗ tránh gió lùa, nhỏ kháng nguyên vào một mắt để mắt kia làm đối chứng âm. Phản ứng dương tính biểu hiện viêm kết mạc mắt (sau một ngày) kèm theo dòng ghèn trắng đục, nhầy và dính chảy ra từ khóe mắt. IV. Chẩn đoán phân tử thông qua phân tích gen 1. Phương pháp lai phân tử (hybridization) Các phương pháp lai phân tử (hybridization) có nguyên lý chung là nếu ADN hai sợi và ARN hai sợi được biến tính bởi nhiệt hoặc kiềm thì trở thành một sợi. Nếu hỗn hợp axit nucleic một sợi này với axit nucleic một sợi khác thì khi gặp điều kiện nhiệt độ nhất định các đoạn axit nucleic một sợi có trình tự nucleotid tương bổ sẽ kết hợp với nhau nhờ liên kết hydro. Vì hình thành axit nucleic lai tạp (hybrid) nên phương pháp được gọi là hybridization (phương pháp lai, để thuận tiện trong tiếng Việt thường gọi lai phân tử). Với nguyên lý này, nếu có một đoạn ADN hoặc ARN có trình tự nucleotid đặc hiệu virut hoặc vi khuẩn ta có thể đánh dấu bằng (cho kết hợp với) đồng vị phóng xạ, biotin, hoặc digoxygenin rồi kiểm tra xem nó có lai với ADN hoặc ARN (ở trạng thái một sợi) trong bệnh phẩm hay không ta có thể phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh trong bệnh phẩm. ADN hoặc ARN một sợi được đánh dấu gọi là "dò" hay "mẫu dò" (probe). Phương pháp kiểm xuất biotin lợi dụng avidin và phương pháp kiểm xuất digoxygenin lợi dụng kháng thể đánh dấu enzym,... là những phương pháp phi phóng xạ được khai phát đã làm các phương pháp lai phân tử trở nên khả thi trong chẩn đoán. Các phương pháp này so với dùng đồng vị phóng xạ có nhiều lợi điểm như khả năng bảo quản dò được lâu và có thể áp dụng trong các phòng thí nghiệm thông thường, không lo ô nhiễm phóng xạ nên có thể tiếp xúc dễ dàng. Tuy nhiên do có độ nhạy thấp so với phương pháp PCR (sau đây) nên chúng chỉ được sử dụng trong việc đồng định hoặc định typ vi sinh vật đã phân lập thuần khiết