Đề án Phát hiện tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và dân tộc Nùng bằng phương pháp bán định lượng Formazan

thường nặng hơn. Nam giới XY: giả sử a là gen quy định tính trạng giảm G6PD sẽ có kiểu gen là XaY: ở nam giới chỉ cần người alen a ở X là có biểu hiện bị bệnh. Nữ giới XX: có 3 dạng XA XA: bình thường. XAXa: có thể bình thường hoặc thiếu hụt G6PD từ nhẹ đến trung bình, hiếm khi thiếu hụt nặng (trừ phi ở vùng trung tâm hoạt động). Nguyên nhân là do sự bất hoạt nhiễm sắc thể từ trong bào thai, trong quá trình phát triển của phôi tạo ra thể khảm giữa dòng tế bào lành và dòng tế bào bệnh, tỷ lệ giữa 2 loại tế bào này thay đổi rất lớn: tế bào giảm G6PD chiếm từ 1% -> 90%. XaXa: biểu hiện kiểu hình thiếu nặng nhưng tần suất gặp kiểu gen này rất nhỏ. Gen cấu trúc đột biến sẽ bây biến đổi về mặt chất lượng ngược lại gen điều hòa bị đột biến gây thiếu G6PD về mặt số lượng, nhưng biến đổi ở intron không gây biến đổi cấu trúc và sản lượng G6PD. Hoạt tính G6PD phụ thuộc vào cả chất lượng và số lượng. Ngày nay đã phát hiện được hơn 140 dạng đột biến khác nhau đại diện cho 442 biến thể khác nhau có tính chất đặc hiệu và phân biệt bằng các chỉ số sinh hóa. Do 1 axit amin có thể được quy định bởi người bộ ba nên có khi 2 biến đổi khác nhau trên AND chỉ gây nên một loại đột biến. Ví dụ như: - Dạng đột biến Aaches: đột biến nucleotid 1089C -> G - Dạng đột biến Loma Linda: 1089C -> A hai loại này đều làm thay đổi acid amin 363 Asn -> Lys. Dựa vào hoạt độ của enzym trong hồng cầu và những bệnh nhân lâm sàng của chúng, WHO đã chia các biến thể của thiếu hụt G6PD ra làm 4 lớp: + Lớp 1: thiếu enzym nặng với biểu hiện thiếu máu tan máu, hồng cầu hình không trò người mạn tính. + Lớp 2: Thiếu G6PD nặng (hoạt độ enzym < 10% so với bình thường + Lớp 3: Thiếu G6PD vừa đến nhẹ. (Hoạt độ từ 10 - 60% so với bình thường). + Lớp 4: thiếu rất nhẹ hoặc không thiếu G6PD (60 - 100%). Tuy vậy nhưng sự phân biệt này là không rõ ràng giữa các phân lớp. Lớp 1, lớp 2 là gây nguy hiểm nhất vì thường có tan máu cấp diễn. Hiện nay ở Việt Nam đã tìm thấy được các dạng đột biến khác nhau, trong đó có một dạng không làm ảnh hưởng đến sự mã hóa acid amin trong cấu trúc G6PD đó là dạng Silent tồn tại dạng còn lại đều là những dạng hay gặp ở các dân tộc châu Á. Dạng Silent xuất hiện là do đột biến thay nucleotid C thành nucleotid T dẫn đến bộ ba mã hoá TAC chuyển thành TAT vẫn mã hoá acid amin Tyrosin, đây cũng chính là một ví dụ cụ thể biểu thị tính bảo thủ của thông tin di truyền. Bảng 1: Một số dạng đột biến G6PD gặp ở Châu Á STT Dạng đột biến Vị trí biến đổi Acid amin tương ứng Exon Nucleocid 1 Gaoha 2 95A - G 32 His -> Arg 2 Viangchan 9 871G -> A 291 Val -> Met 3 Chatham 9 1003G -> A 335 Sla -> Thr 4 Chinese - 5 9 1024 C -> T 342 leu - > Phe 5 Union 11 1360 -> T 454 Arg -> Cys 6 Canton 12 1376 G -> C 459 Arg -> Leu 7 Kaiping 12 1388 G -> A 463 Arg -> His 8 Silent 11 1311 C -> T TAC -> ATA -> Tyrosil 2.2. Dịch tế học. Năm 1996 Blood Ernest Beutler đã phát hiện có 400 triệu người thiếu máu G6PG gặp ở tất cả các dân tộc. Việt Nam nằm trong vùng có tỉ lệ thiếu hụt G6PD khác nhau tùy từng vùng và tùy từng dân tộc. Theo nghiên cứu của tác giả Đoàn Hạnh Nhân thiếu G6PD hồng cầu, có tỉ lệ cao tại một số vùng Sốt Rét Kim Bôi (34,1%), Mai Châu (20,4%), Như Xuân (19,7%), tỷ lệ thiếu lại thường thấp ở nơi không có lưu hành bệnh sốt rét. ở dân tộc Mường (tỉ lệ cao nhất 31%) tiếp đến là dân tộc Thổ (19,3% dân tộc Thổ, dân tộc Thái 19,3%) rất thấp ở dân tộc kinh 0,5%. Hình 5: phân bố thiếu hụt G6PD trên thế giới 2.3. Biểu hiện lâm sàng Thường biểu hiện khi tiếp xúc với chất oxi hóa đó là những cơn tan máu. Primaquine là một loại thuốc có tính o xi hoá cao nhưng rất hay được sử dụng trong điều trị sốt rét vì đây là thuốc duy nhất được sử dụng để diệt thể ẩn trong gan với bệnh nhân nhiễm P.vivax và thể giao bào với bệnh nhân nhiễm P.falciparum [6]. Tùy thuộc vào dạng thiếu hụt G6PD tùy vào tính chất hay nồng độ của tính chất hay nồng độ của các chất oxi hóa sẽ dần dần tan máu nhiều hay ít từ đó dần đến bệnh thiếu hụt nặng hay nhẹ. 2.3.1. Vàng da sơ sinh. Vàng da sơ sinh là một triệu chứng của nhiều nguyên nhân khác nhau, là do trong máu có sự gia tăng chất bilirubin, một sán phẩm dị hoá của hemoglobin.Vàng da xuất hiện khi định lượng bilirubin trong máu ở người lớn là >2mg%, trẻ em là >7mg%[8]. Dị hoá Hb ở hệ liên võng nội mô (75%) và từ nguồn khác(25%) Hemoxygen Hệ liên võng nội mô Biliverdin Bilirubin+albumin (máu) Bilirubin+ligandin (gan) Glucuronyl transferase Bilirubin glucuronid (trực tiếp) Bài tiết xuống ruột Stercobiline, urobilinogen Hình 6: Sơ đồ chuyển hoá của bilirubin. Vàng da sơ sinh có hai loại là sinh lý và bệnh lý. Vàng da sinh lý thường diễn ra trong ba ngày đầu và kết thúc tối đa là 10 ngày, mức độ vàng da nhẹ, hiện tưọng này là do sự suy giảm nhất thời chức năng chuyển hoá bilirubin của gan do tăng quá trình táI hấp thu bilirubin tại ruột, tăng thấm vào tổ chức. Trong khi đó chất này được sản sinh hàng ngày ở giai đoạn sơ sinh nếu tính trên cân nặng lớn gấp đôi người lớn.Vàng da bệnh lý thấy xuất hiện khi nồng độ bilirubin trong máu cao hơn 20mg/dl. Hậu quả nghiêm trọng của bệnh lý này là vàng nhân não. Trẻ sơ sinh sẽ có biểu hiện là những cơn tăng trương lực cơ, xoắn văn, mất các phản xạ sơ sinh, ngừng thở tím tái và rất dễ tử vong. Nếu trẻ qua khỏi thì sẽ để lại những di chứng nặng nề như rối loạn ngoại tháp (múa vờn, múa giật, rối loạn ngôn ngữ…) hoặc bất thường thính lực, thị giác và thiểu sản phát triển răng. Vàng da nhân não ảnh hưởng đến khả năng phát triển tinh thần và vận động của trẻ. Việc phát hiện ra bệnh lý này không khó và việc đIệu trị có kết quả rất nhanh chóng và dễ dàng bằng phương pháp chiếu đèn, thuốc làm giảm nồng độ bilirubin trong máu và hiệu quả nhất là phương pháp chiếu đèn. Nhưng nếu để lâu, Bilirubin đã ngấm và các nhân xám của não thì sẽ để lại hậu quả nặng nề không thể hồi phục lại được do tổn thương các tế bào thần kinh như đã nêu trên. Thiếu G6PD như một yếu tố nguy cơ dẫn đến vàng da bệnh lý. Do đó việc phát hiện thiếu hụt G6PD sẽ giúp cho quá trình phát hiện những triệu chứng nặng giúp cho quá trình theo dõi tốt hơn tránh bỏ sót đáng tiếc. Tỷ lệ vàng da dẫn đến vàng nhân não ở nước ta còn rất cao. Năm 1996 - 2000: tại Viện Nhi Trung ương tỷ lệ này khoảng 25%, tại bệnh viện Nhi Đồng I thành phố Hồ Chí Minh phát triển từ 147 trường hợp (1995) đến 238 trường hợp (1997). Ở những trẻ em bị thiếu hụt G6PD thì Bilirubin huyết thanh cao hơn đáng kể so với nhóm chứng, cao hơn vào ngày thứ 3 sau sinh. Loại thiếu hụt G6PD lớp 3 thường biểu hiện vàng da sau sinh. Ví dụ: G6PD Aures thường gây vàng da với đột biến cao. Thiếu G6PD được di truyền đồng thời với đột biến gen VGI1A1 (Gilbert) thì nguy cơ cao dẫn đến vàng da nhân. 2.3.2. Tan máu do dùng thuốc và do sử dụng một số thực phẩm. Ernet Beutler phát hiện ra hiện tượng tan máu sau khi nghiên cứu một số bệnh nhân sử dụng thuốc chống sốt rét là Primaquin. Sau đó qua nghiên cứu người ta đã khám phá ra rằng không chỉ pnimaquin mà sau sử dụng một số thuốc khác cũng gây nên hiện tượng tan máu: Aspirin (thuốc giảm đau), Procainamide (thuốc điều trị bệnh tim mạch), DDS (diệt khuẩn)... Triệu chứng tan máu dẫn đến vàng da thường xảy ra vào ngày thứ 2,3 sau khi dùng thuốc. Ngoài ra hiện tượng tan máu còn được biết đến sau khi bệnh nhân sử dụng một số loại thức ăn có tính oxi hóa cao như long não, rượu vang đỏ, các sản phẩm từ đậu tương, đậu nành và đặc biệt là các loại đậu Fava dẫn đến hội chương Favism. Hội chứng favism: là bệnh lý thiếu máu tan máu đã được biết đến từ thời Pythagoras. Người ta nhận thấy rằng sau khi ăn đậu Fava, thì một số người 24giờ sau có thể xuất hiện hiện tượng tan máu có khi rất dữ dội. Sau đó nhiều nghiên cứu cho thấy rằng tình trạng này liên quan đến thiếu hụt G6PD. Đa số các trường hợp xảy ra ở những cá thể thiếu G6PD nặng nhưng đôi khi cũng thấy ở thiếu hụt nhẹ. Ngược lại cũng có trường hợp thiếu mà không có bệnh sinh lý sau khi ăn đậu Fava. Trong đậu Fava thành phần liên quan trực tiếp gây ra hiện tượng tan máu là glucosidevicine và dividine. Aglycone của chúng được thay thế bởi prymidune đến tổn thương oxi hóa cho xu hướng oxi hóa tự phát ở những bệnh nhân này thường thấy Hemoglobin niệu trong vài ngày. Về sau phát hiện được người do có giảm G6PD. Giảm G6PD nhẹ thường bệnh sinh lý nhẹ hơn do chỉ ở những hồng cầu già (do khối lượng enzyen G6PD ở hồng cầu non). Ở bệnh nhân nặng thì cả những hồng cầu non cũng không có đủ hàm lượng G6PD, không có khả năng tự bảo vệ trước các tác nhân oxi hóa gây nên hiện thượng tan máu nặng dẫn đến đái ra huyết sắc tố có thể gây viêm thận hay suy thập cấp mà biểu hiện lâm sàng là thoạt đầu có đái đỏ, về sau đau vùng thắt lưng hố thận dẫn đến vô niệu. Các triệu chứng cận lâm sàng của bệnh nhân: Hemoglobin giảm dần đến ngày 7 - 8 sau đó phục hồi dần đến ngày thứ 10 xuất hiện thể Heinz gắn trên bề mặt hồng cầu đó là phần Protein và Hemoglobin bị biến chất gắn vào màng hồng cầu gây nên hình thái bất thường của hồng cầu và dẫn đến tan máu. Hình7: Đậu fava 2.3.4.Các triệu chứng khác: Tan máu do nhiễm trùng – đái tháo đường Quá trình nhiễm trùng thường kích hoạt tan máu. Đái tháo đường giai đoạn toàn phát sẽ khởi phát những đợt tan máu ở bệnh nhân. Tan máu mạn tính hồng cầu hình không tròn di truyền. Năm 1958 người ta tìm thấy rằng thiếu G6PD cũng có thể dẫn đến tan máu mạn tính. Loại tan máu này thì thường không xảy ra ở những loại đột biến hay gặp như G610A - G6PD med nhưng lại hay gặp ở những đột biến có tần suất xuất hiện nhỏ. 2.4. Biểu hiện cận lâm sàng 2.4.1 Ở cơn tan máu cấp Xét nghiệm máu: hồng cầu giảm, Hematocrit giảm, Hemoglobin giảm, soi hồng cầu không cần nhuộm phát hiện được thể Heinz. Chính những tế bào này chỉ nhìn thấy sau cơn tan máu cấp sau đó nó sẽ rời tuần hoàn nhanh, không nhìn thấy sau 3 - 4 ngày, có vài tế bào đoạn và đã nhiễm sắc (hồng cầu lớn xanh nhạt), có tế bào lưới (thường không đáng kể), 5 - 15%. Định lượng bilirubin qua da, trong máu tăng. Xét nghiệm nước tiểu: Hemoglobin niệu (+), trụ hồng cầu (-) 2.4.2 Kỹ thuật tế bào: Nghiên cứu sâu hơn bằng xét nghiệm hồng cầu có thể phát hiện 2 dòng hồng cầu ở những người nữ dị hợp tử định lượng erzym ở 2 dòng hồng cầu thấy khác nhau, một dòng thiếu hoàn toàn, một dòng không thiếu hoàn toàn đó là kết quả của hiện tượng bất hoạt nhiễm sắc thể. Ví dụ: Ditk Roos nghiên cứu một bệnh nhân thiếu G6PD Vonledam đã phát hiện 94% hồng cầu hoạt độ G6PD bằng không và 6% hồng cầu còn lại thì hoạt độ chỉ còn 5% so với bình thường. 2.5. Chẩn đoán. - Dịch tễ và tiền sử: trẻ bịcác bbệnh nhiễm trùng,đẻ non ,thiếu thánggia đình đã có trẻ bị vàng da,hay trong vùng sốt rét,vùng có tỷ lệ thiếu hụt G6PD,hay sau khi sử dụng một số thuốc và thực phẩm có tính oxy hoá. - Lâm sàng - Cận lâm sàng - Chẩn đoán nguyên nhân: Cụ thể như do thiếu hụt G6PD, định lượng G6PD bằng phưong pháp quang phổ hấp thụ, bán định lượng như phương pháp Formazan hay test nhanh. Việc định lượng G6PD ngay khi tan máu, lượng hồng cầu non và lưới chiếm khá cao những tế bào này có hoạt động enzym cao hơn tế bào già. Vì vậy xét nghiệm cần phải được trì hoãn sau đợt tan máu đến khi mức enzym thấp xuống rồi mới xét nghiệm đến chẩn đoán. Tuy vậy có nghiên cứu cho rằng dù vậy thì G6PD cũng không đạt được tới mức bình thường. Ngoài ra có thể sử dụng kỹ thuật phân tích gen (phương pháp PCR) để phát hiện được nguyên nhân và dạng đột biến gen từ đó có hướng tiên lượng và dự phòng. Tuy độ chính xác của kỹ thuật này cao nhưng lại tốn kém. 2.6. Điều trị và phòng. 2.6.1 Phòng bệnh: giữ một vai trò quan trọng vì giúp tránh xảy ra triệu chứng và biến chứng. + Với những bệnh nhân đã biết trước là thiếu hụt G6PD thì cần tránh những thực phẩm và thuốc có tính chất oxi hóa. + Với những bệnh nhân khi có chỉ định dùng những thuốc có tính chất oxi hóa (primaquiu) aspirin...) cần xét nghiệm en zym G6PD trước khi dùng. + Với bệnh nhân đã xét nghiệm triệu chứng cần phòng biểu hiện biến chứng: xét nghiệm máu, xét nghiệm nước tiểu, theo dõi triệu chứng tan máu (đái máu, vàng da, suy thận và vàng da đa nhân). 2.6.2 Điều trị: + Ngừng thuốc + Truyền dịch, truyền máu, lợi tiểu. Chú ý không được truyền cho bệnh nhân loại máu thiếu G6PD. 3. Kỹ thuật phát hiện thiếu hụt G6PD 3.1.Các mức độ phát hiện thiếu hụt G6PD: Phương pháp định tính: Phương pháp phát quang (Beutler và Mitchelt-1968), phương pháp được tiến hành bằng cách lấy máu từ đầu ngón tay sau đó dùng thuốc chống đông. Trộn đều máu đã chống đông bằng dung dịch đã chuẩn bị sẵn gồm NADP và G6P, sau đó nhỏ vào giấy Whatman số 1 vào thời điểm 0 phút, 5 và 10 phút. Để khô, đọc kết quả dưới ánh sáng đèn cực tím. Nếu hàm lượng G6PD đủ thì các giọt dung dịch và máu sẽ phát quang và không phát quang khi không đủ lượng G6PD. Đây là một phương pháp đã được uỷ ban quốc tế về các tiêu chuẩn trong huyết học đề nghị sử dụng trong phát hiện sàng lọc các đối tượng thiếu men G6PD. Tuy vậy phương pháp này có giá thành cao do cần phải có các thiết bị chuyên dụng như đèn chiếu tia tử ngoại [12], ngoài ra phương pháp này khó phát hiện trường họp thiếu men G6PD ở nữ dị hợp tử [6]. Phương pháp nhanh của AkiraHirono-1998: là phương pháp tiến hành dựa trên nguyên lý G6P được chuyển thành 6GP thông qua sự xúc tác của enzym G6PD, từ đó tạo ra NADPH là một chất khử tham gia phản ứng chuyển MTT thành Formazan, chuyển từ màu vàng sang màu xanh thẫm( hình minh hoạ cho nguyên lý xin xem ở kỹ thuật Formazan). - Trường hợp không thiếu G6PD lượng NAPDH tạo ra đủ thì sản phẩm tạo ra có màu xanh thẫm của Formazan. Đọc kết quả (-) - Trường hợp thiếu G6PD thì phản ứng xảy ra không hoàn toàn, sản phẩm tạo ra có màu xanh nhạt, đọc kết quả (+) : bán thiếu. - Trường hợp không có G6PD : phản ứng không xảy ra , sản phẩm tạo ra chỉ có màu hồng ( màu của Hb ) đọc kết quả (++) ( +++) thiếu hoàn toàn. Đây là một phương pháp đọc kết quả ngay sau 30 phút, đọc kết quả bằng mắt thường dễ nhận biết vvà không đòi hỏi thiết bị tốn kém. Phương pháp này đã được các tác giả như Akira Hirono, Kuni Iwai áp dụng ở một số nứơc Đông Nam A để điều tra hàng loạt [6]. Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Minh Hùng độ nhạy của phương pháp này ở trường hợp thiếu hoàn toàn là 97,9%, ở trường hợp bán thiếu là 61,5%, độ đặc hiệu là 100%.Ta có thể thấy độ nhạy và độ đặc hiệu tương đối cao, có thể áp dụng cho test sàng lọc. Phương pháp định lượng Nguyên tắc: Tiến hành chống đông máu sau đó tách hồng cầu rồi tách enzym G6PD. Xác định hoạt độ G6PD do sự thay đổi phổ hấp thụ tại bước sóng 340 mm do coenzym NAPDH sinh ra trong quá trình phản ứng. Hoạt độ G6 PD tỷ lệ thuận với độ hấp thụ của NADPH. Sơ đồ minh họa Tính kết quả: A: độ thay đổi mật độ quang học. + Hoạt độ G6PD (UI/ml = A/phút x 30476. + Hoạt độ G6PD (UI/1012HC) = A/phút x 30476 Sản lượng hồng cầu trong 1 lít + Hoạt độ G6PD UI/gHb = A/phút x 30476 Nồng độ Hb. Đọc kết quả Bình thường 10 UI/1012 HC. Thiếu G6PD nhẹ và trung bình: 40 - 100 UI/1012HC. Thiếu G6PD nặng: 10 UI/1012 HC. Phương pháp gen học Sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích đột biến gen, thông thường phản ứng PCR được thực hiện qua các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: gây biến tính để tháo xoắn và làm đứt các liên kết Hiđro của chuỗi xoắn kép AND Giai đoạn 2: là giai đoạn ủ mồi, ứng với mỗi exon thì có một đoạn mồi khác nhau. Giai đoạn 3: là tổng hợp chuỗi đích ADN. Đoạn mồi được kéo dài nhờ enzym nối, từ đó khuyếch đại nên những đoạn khuôn. Dựa trên sản phẩm khuyếch đại tương ứng với cặp mồi bình thường hay đột biến sẽ nhận biết được vị trí đột biến Đây là một phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao cho biết vị trí đột biến , dạng đột biến, từ đó biết được độ thiếu hụt G6PD. Tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại do đó giá thành cao.  3.2. Kỹ thuật bán định lượng tạo vòng Formazan. Cơ sở khoa học G6 PD G6P (Cơ chất) NAD PH (Dạng khử) 6 - GP (sản phẩm) NADP+ (dạng OXH) Formazan (màu xanh) MTT (màu vàng) PMS Nguyên tắc nhận định kết quả: sản phẩm Formazan của phản ứng tạo ra có màu xanh tím. Diện tích và độ đậm của vòng màu sản phẩm sau một thời gian nhất định tỷ lệ với hoạt tính của enzym trong mẫu thử. Đọc kết quả: ngoài kích thước thì màu sắc quan trọng, màu đậm chứng tỏ hoạt tính enzym trong máu cao, nhạt chứng tỏ hoạt tính enzym trong máu thấp. Kỹ thuật này không chỉ là định tính mà còn là bán định lương. - Đường kính vòng xanh > 7 mm: (- ) - Đường kính vòng xanh 5mm - 7mm. Màu xanh nhạt hơn chứng (- ): (+) - Đường kính màu xanh 3mm - 5mm (+ +) rất nhạt màu. - Đường kính < 3mm không có màu xanh mà là màu vàng (+++). CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng Người Tày: 130 người Người Nùng: 71 người Tất cả các đối tượng trên là sinh viên trường trung học Y tế Cao Bằng, đã được điều tra chính xác là có 3 đời là người dân tộc Tày (hoặc Nùng), trong đó có 162 nữ và 39 nam. Sở dĩ số lượng nam ít hơn nữ là do đề tài của tôi được tiến hành trên cơ sở cộng tác với đề tài “ Lưu giữ DNA người ” do giáo sư Vũ Triệu An làm chủ nhiệm nên không có điều kiện chọn mẫu thích hợp. - Thời gian lấy mẫu: Tháng 5 năm 2004. - Địa điểm lấy mẫu: Trường trung học Y tế Cao Bằng. 2. Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang 2.1. Các bước tiến hành Thu thập mẫu: lấy máu tĩnh mạch ở đối tượng nghiên cứu thấm vào giấy Whatman số 3 là loại giấy dầy có thể lấy đủ lượng hồng cầu cần thiết. Để giấy thấm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng lưu trữ dưới 7 ngày để làm xét nghiệm (tốt nhất là giữ lạnh ở 4oC) Bảo quản máu khô: ở -30oC, đây là điều kiện kỹ thuật đảm bảo để Protêin không bị biến tính đối với trường họp không làm dược xet nghiệm ngay. Tiến hành làm Formazan Thu thập và xử lý số liệu 2.2 Kỹ thuật tạo vòng Formazan : 2.2.1 Chuẩn bị dụng cụ: Cho lấy mẫu : - Giấy Whatman số 3, có đánh dấu các vòng tròn đường kính 1cm - Xilanh lấy máu tĩnh mạch , bông cồn sát trùng. Cho xét nghiệm: - Dụng cụ: cốc thuỷ tinh, lọ thuỷ tinh, đũa khuấy, bình định mức, khay nhựa có kích thước 12,5 x 8,5 x 1cm đã xác định 40 vị trí (8 chiều ngang và 5 chiều dọc) các vị trí này cách đều nhau. - Trang thiết bị : Cân phân tích Sartorinol sai số 0,01 mg Tủ ấm 37oC Bể ổn nhiệt giữ ở nhiệt độ 55 oC Lò vi sóng (Samsung) Máy đo pH Kìm bấm mẫu Hóa chất: sử dụng hóa chất của hãng G6P - : Glucose -6- Phosphat MTT : chất có màu vàng tươi PMS : phenazin Methosulfat MgCl2 NADP Thạch Agar Mẫu (- ) (mẫu đủ): lấy máu của người bình thường, là người không sống trong vùng dịch tễ, người đã được xét nghiệm định lượng G6PD ít nhất 2 lần ( ≥ 100 UI / 10 hồng cầu) mẫu ( +) (mẫu thiếu): là mẫu máu lấy ở những người đã được xác định là thiếu hoàn toàn G6PD ( ≤ 40 UI / 10 hồng cầu ) 2.2.2 Quy trình Formazan: - Chuẩn bị Gel: Pha đệm Tris - HCl 0,1 M - pH = 6,5 có chứa MgCl2 0,01M (Mg là ion cần thiết cho sự gắn enzym và cơ chất, theo Phạm Thị Lý) Ví dụ: ứng 150ml dung dịch cần 1,425 g MgCl2 sau đó chia dung dịch đệm làm 4 phần, 1 phần để vào cốc pha với hóa chất, 3 phần còn lại cho vào lọ pha với Agar. Cho Agar vào lọ lắc đều, đun cho tan trong lò vi sóng, để nguội đến 55 oC trong bể ổn nhiệt - Lần lượt cân các hóa chất sau vào cốc: + Theo nồng độ ứng với kỹ thuật ở bộ môn Miễn dịch sinh lý bệnh trường Đại học Y : G6P: 0,625 mg/ml NADP : 0,125 mg/ml MTT: 0.125 mg/ml PMS : 0,125 mg/ml + Theo nồng độ ứng với kỹ thuật của Viện Sốt Rét : gấp 2 lần so với kỹ thuật trên G6P: 1.25 mg/ml NADP : 0,25 mg/ml MTT: 0.25 mg/ml PMS : 0,25 mg/ml Ví dụ : pha trong 150ml dung dịch, kĩ thuật bộ môn Miễn dịch sinh lý bệnh trường Đại học Y cần: 93,75 mg G6P; 18,75 mg NADP; 18,75 mg MTT; 18,75 mg PMS. - Lắc đều hồng cầu dùng đũa thủy tinh khuấy cho tan rồi đun nóng tới 55 oC - Trộn đều 2 dung dịch trong lọ và cốc tạo thành 1 hỗn hợp gel để trong bể ổn nhiệt 55oC lắc đều - Đổ hỗn hợp gel trên vào khay nhựa với luợng gel 30ml / 1khay - Đổ nhẹ nhàng tránh tạo bọt khí - Đặt khuôn nhựa trên mặt phẳng, chú ý chọn khuôn nhựa phẳng không bị cong vênh để đọc kết quả chính xác , gel dàn đều - Sau khi đổ xong đặt lên khay nhựa 1 tấm kính phẳng bọc giấy để tránh ánh sáng ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, gel sẽ đông. Ví dụ: ứng 150ml hỗn hợp gel đổ được 5 khay. 1 khay gel đạt tiêu chuẩn bề dày gel đạt 3 mm, có màu vàng nhạt trong suốt, không có bọt khí, mặt gel phẳng. - Đặt mẫu: - Đặt khay gel chồng lên thước đo định vị, đồng thời đánh dấu vị trí sẽ đặt chứng (+) và chứng (-) - Dùng kìm bấm các mẫu máu đã thấm giấy Whatman tạo thành các vòng tròn đường kính 3mm. - Đặt mẫu lên 3 mặt gel: ứng với 40 vị trí có 1 chứng (-), 1 chứng (+), 38 mẫu máu. Chú ý đặt mặt trên của mẫu giấy thấm tiếp xúc với mặt gel , dùng Pince gắp các mẫu giấy đặt nhẹ nhàng ấn đều cho mẫu máu dính chặt vào gel, tránh vỡ mặt gel - Bọc khay gel đã tra mẫu bằng giấy nến (tránh khô mẫu máu) ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 oC trong 8 giờ, 24 giờ - Đọc kết quả : - Mẫu đủ lượng G6PD đọc là xét nghiệm (-) sẽ có phản ứng tạo vòng Formazan mầu xanh thẫm, đường kính vòng dung huyết rộng > 7mm - Mẫu thiếu nhẹ đọc là xét nghiệm (+): phản ứng xảy ra không hoàn toàn, vòng dung huyết có màu xanh đậm, đường kính 5-7mm. - Mẫu thiếu vừa đọc là xét nghiệm (++) phản ứng xảy ra không hoàn toàn, vòng dung huyết màu xanh nhạt, đường kính nhỏ hơn 5mm. - Mẫu thiếu nặng đọc là xét nghiệm(+++): phản ứng không xảy ra, vòng dung huyết mầu vàng nhạt hoặc hồng nhạt là mầu của bản gel hoặc màu của Hemoglobin. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Khi đọc kết quả phản ứng tạo vòng Formazan căn cứ vào các tiêu chuẩn sau: 3.1.1. Màu sắc của vòng dung huyết: vòng dung huyết có màu xanh đậm của Formazan chứng tỏ cơ chất tham gia phản ứng đã phản ứng hết .nghĩa là hoạt độ của enzym là bình thường.Vòng dung huyết có màu xan nhạt hơn là hoạt độ của enzym giảm nhẹ, trường hợp thiếu hoàn toàn thì vòng dung huyết sẽ có màu của môi trưòng thạch Agar hay màu của Hemoglobin, màu vàng nhạt hay màu đỏ nâu nhạt. 3.2.2. Kích thước của vòng dung huyết xanh: - Lớn hơn 7 mm được đánh giá là (-): bình thưòng - Từ 5 mm đến 7 mm được đánh giá là(+): bán thiếu - Từ 3mm đến 5mm được đánh giá là (++): bán thiếu - Nhỏ hơn 3mm được đánh giá là (+++): thiếu hoàn toàn. 3.2. Đánh giá các điều kiện của phản ứng Formazan Chúng tôi tiến hành xác định các điều kiện của phản ứng Formazan với 95 mẫu thử, là những mẫu được chọn ngẫu nhiên trong tổng số đối tượng nghiên cứu trên. Những điều kiện của phản ứng Formazan là thời gian diễn ra phản ứng, nhiệt độ tiến hành của phản ứng và nồng độ cơ chất tham gia phản ứng: - Thời gian: 8 giờ, 12 giờ, 24 giờ. - Nhiệt độ: 250C ( nhiệt độ phòng), 370C (nhiệt độ sinh lý của cơ thể). - Nồng độ cơ chất: tiến hành với hai nồng độ ở khoa sinh lý bệnh trường Đại học Y và ở Viện Ký sinh trùng sốt rét. Nồng độ ở Viện Ký sinh trùng sốt rét gấp đôi ở Đại học Y ( xin xem phần đối tượng và phương pháp nhiên cứu). Bảng 2: Kết quả thiếu hụt G6PD sau 8h đọc kết quả Kết quả 37oC 25oC Viện sốt rét Đại học Y Viện sốt rét Đại học Y Bình thường 78 82 90 90 Bán thiếu 12 8 0 0 Thiếu 5 5 5 5 Nhận xét: Sau 8h ở 25oC thì tất cả các mẫu thiếu hoàn toàn đều đọc rõ ở cả hai nồng độ. Các mẫu bán thiếu ở cả hai nồng độ đều không đọc rõ, các quầng dung huyết chỉ hơn nhạt mầu hơn so với chứng (-) mà đường kính không nhỏ hơn hoặc ngược lại đường kính có nhỏ hơn nhưng màu xanh vẫn đậm vì vậy những mẫu này vẫn được đọc là bình thường. Sau 8h ở 37oC ta thấy ở nồng độ thấp có 8 mẫu bán thiếu và 4 mẫu nghi ngờ. ở nồng độ cao có 12 mẫu bán thiếu (bao gồm cả 4 mẫu nghi ngờ trên vì sự so sánh với chứng (-) là rõ ràng hơn). Bảng 3: Kết quả thiếu hụt G6PD sau 12h và 24h đọc kết quả Kết quả 37 oC 25 oC Viện sốt rét Đại học Y Viện sốt rét Đại học Y Bình thường 78 78 78 78 Bán thiếu 12 12 12 12 Thiếu 5 5 5 5 Kết quả ở hai nồng độ và hai nhiệt độ đều tương đương nhau, tuy vậy cũng có thể rút ra nhận xét như sau: Sau 12 giờ - ở 25 oC hầu hết các mẫu bán thiếu đều có đường viền của vòng dung huyết không rõ ràng ở cả hai nồng độ. - ở 37 oC các mẫu bán thiếu ở nồng độ thấp phân biệt rõ hơn. Sau 24giờ - ở 25 oC các mẫu bán thiếu có màu nhạt hơn hẳn so với thời điểm 8h và 12h. - ở 37 oC các mẫu bán thiếu ở nồng độ thấp có màu nhạt hơn do đó dễ phân biệt hơn. 3.3. Tần suất thiếu hụt G6PD ở dân tộc Tày và dân tộc Nùng Bảng 3: Tỷ lệ thiếu enzym G6PD ở dân tộc Tày và Nùng Dân tộc N Thiếu hoàn toàn Bán thiếu Tổng Tày 130 7/130 (5,385%) 9/130 (6,923%) 12,308% Nùng 71 6/71 (8,451%) 1/71 (1,14%) 9,861% 2 dân tộc 201 13/201 (6,467%) 10/201 (4,975%) 11,442% Biểu đồ 3: Tỷ lệ thiếu enzym G6PD ở dân tộc Tày và Nùng Nhận xét: tần suất thiếu hụt enzym chung ở cả hai dân tộc trong quần thể là 11,442%, tần suất thiếu hụt enzym của người Tày là 12,308% cao hơn ở người Nùng là 9,861% nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê ( p > 0,05 ). Bảng 4: Tỷ lệ thiếu enzym G6PD theo giới ở dân tộc Tày và Nùng Giới tính n Nam Nữ p ( Q ) Tày 130 6/