Đề cương công nghệ sinh học

c, nơi có phản ứng lai sẽ phát xạ vào phim, tráng phim thu được các vết đen tại nơi phát xạ chính là địa điểm lai. Câu 5. Trình bày kỹ thuật RFLP và ứng dụng? Trả lời Kỹ thuật RFLP Khi cắt ADN nhân bằng các RE sẽ sản sinh ra hàng triệu đoạn cắt xếp liên tục cạnh nhau theo kích thước khi điện di. Nếu như đưa các đoạn này lên điện di rồi nhuộm màu và xem xét dưới ánh sáng tử ngoại, con người không thể quan sát thấy sự phân cách giữa các đoạn cắt. Để giải quyết vấn đề này, người ta không thể so sánh sự sai khác của toàn bộ đoạn cắt mà chỉ so sánh sự sai khác về một trình tự nu bất kỳ nào đó trên các băng điện di. Một đoạn ADN nào đó lấy từ thư viện mẫu đã nhân dòng sẽ được sử dụng làm mẫu dò để phát hiện ra trình tự nu tương ứng trên các băng điện di Tiến hành phản ứng Southern Blot (trình bày phản ứng này đã nói ở câu 4) So sánh sự hiện diện của các vị trí lai sẽ phát hiện được tính đa hình của các đoạn cắt. Ứng dụng Phát hiện được sự có mặt của gen cần tìm trong hệ gen sinh vật nghiên cứu Phát hiện được sự đa dạng ADN của các cá thể khác nhau Phát hiện các đột biến Phát hiện các thể lai soma qua dung hợp TB trần Lập bản đồ giới hạn của một gen Câu 6. Phương pháp xác định trình tự nu của ADN? Cho ví dụ minh họa? Trả lời Phương pháp Maxam Gilbert Dựa trên phân giải hóa học: Sử dụng hóa chất để phân hủy ADN tại vị trí các bazơ nitơ khác nhau → các đoạn có chiều dài khác nhau 1 nu. Các bước tiến hành: Bước 1: Chuyển đoạn ADN về dạng sợi đơn Bước 2: Đánh dấu phóng xạ P32 tại đầu 5’ Bước 3: Chia các sợi đơn thành 4 mẫu riêng rẽ và xử lý với hóa chất đặc hiệu để phá hủy 1 hoặc 2 trong 4 loại bazơ (tức là thay đổi trật tự gốc phosphat) Bước 4: Xử lý tiếp các mẫu này với piperillin để bẻ gãy ADN tại các bazơ đã bị phá hủy Bước 5: Điện di riêng rẽ 4 mẫu này. Khi đó sự phân bố các đoạn này trên điện di đồ tương ứng với kích thước của chúng có chiều dài hơn kém nhau 1 nu. Bước 6: Đưa gel hiện hình rồi đọc các băng hình trên phim để xác định trình tự sợi đơn ADN Đọc tiếp mạch bổ sung còn lại Phương pháp Sanger (phương pháp enzym) Dựa vào hoạt động của enzym ADN polymerase (xúc tác để gắn các đoạn ADN chỉ chênh lệch nhau 1 nu) Trong phương pháp này, người ta sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quá trình kéo dài ADN khi tổng hợp. Nhân tố này là các 2,3 didesoxynucleotit triphosphat (ddNTP) Các phân tử này có thể kết hợp vào chuỗi ADN đang tổng hợp bình thường nhưng không kết hợp được với phân tử desoxynucleotit triphosphat (dNTP) tiếp theo Khi trộn lẫn lượng nhỏ ddNTP với 4 loại dNTP rồi tiến hành tổng hợp nhờ enzym ADN polymerase → cho một loạt các đoạn ADN được kết thúc 1 cách đặc hiệu bởi gốc ddNTP Tiến hành thí nghiệm tương tự cho 4 phản ứng tổng hợp ADN tách rời, mỗi phản ứng bổ sung 1 loại ddNTP khác nhau → các đoạn ADN kết thúc bằng gốc ddNTP và hơn kém nhau 1 nu Chạy điện di các đoạn này rồi hiện hình chúng → Ta có thể xác định trình tự chuỗi ADN. Giải trình tự gen bằng phương pháp tự động Nguyên tắc chung của máy là giải trình gen tự động là dựa theo cơ sở của phương pháp Sanger Quá trình tổng hợp được thực hiện nhờ máy PRC có các hóa chất tiêu chuẩn và phần mềm xử lý số liệu Máy đọc trình tự trên cả 2 mạch đơn nên kết quả rất chính xác. Câu 7. Trình bày kỹ thuật PCR và ứng dụng? Trả lời Nêu được các ý sau : Kỹ thuật PCR : Khái niệm, nguyên tắc, chu trình (sơ đồ), yêu cầu cần thiết, yếu tố ảnh hưởng Ứng dụng Kỹ thuật PCR Khái niệm Bản chất của kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn ADN với tốc độ nhanh chưa từng thấy và có độ chính xác cao được thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR). Nguyên tắc của PCR Dựa trên sự xúc tác của enzym ADN polymerase để có thể nhân bản ADN nhờ đoạn mồi (primer) tương hợp với đầu 3’ và 5’ Chu trình PCR Một chu kỳ của PRC gồm 3 giai đoạn: Giãn xoắn Gắn mồi Kéo dài mạch bổ sung Các giai đoạn của PCR được thể hiện rõ qua sơ đồ sau: Biến tính mẫu ADN thành các sợi đơn (940C trong 5ph) Gắn mồi vào các sợi đơn (30 - 650C, 30s) Biến tính để tách chuỗi mới tổng hợp thành các sợi đơn Tổng hợp các sợi ADN mới (65 – 750C, 2 - 5ph Sơ đồ chu trình PCR Một chu trình gồm khoảng 30 – 35 chu kỳ là đủ, nếu kéo dài thêm chu kỳ không những số sản phẩm tăng không đáng kể mà tăng thêm cả sự sai sót. Các yêu cầu cần thiết của PCR 2 mồi phải có trình tự bổ sung với 2 đầu của đoạn ADN cần nhân dòng (mối xuôi và mồi ngược) Khoảng cách giữa 2 mồi này không quá 1kb để tránh hiện tượng bắt cặp giữa các mồi. Các mồi có kích thước ít khác nhau Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR Độ tính sạch của ADN khuôn Sự hoạt động của RE Nồng độ các loại nu Nồng độ của các dung dịch đệm Ứng dụng của kỹ thuật PCR Giúp tách nhanh và chính xác từng gen hoặc từng đoạn ADN riêng biệt Là kỹ thuật nền cho nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử quan trọng Chẩn đoán nhanh, nhạy, chính xác các bệnh di truyền Giúp xác định giới tính của động vật và người ở giai đoạn phôi thai sớm Khôi phục các gen của các loài sinh vật cổ xưa Giúp xác định nguồn gốc hài cốt liệt sĩ vô danh, thủ phạm hình sự Câu 8. Kỹ thuật RAPD: nguyên lý và ứng dụng? Trả lời Nguyên lý Phương pháp RAPD thực chất là quá trình nhân bản các đoạn ADN bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên. Các mồi này sẽ bắt cặp một cách ngẫu nhiên vào ADN ở bất kỳ vị trí nào mà tại đó có trình tự bổ sung với nó. Theo lý thuyết 1 mồi ngẫu nhiên gồm 10 nu thì xác suất bắt gặp 1 trình tự bổ sung với nó trong mạch ADN (được cấu tạo từ 4 nu) là 1/410 = 1/ 1.048.576 Giả sử một bộ gen đơn bội của lúa có kích thước 550.000 Kb = 550.000.000 bp, vậy khả năng mồi ngẫu nhiên (gồm 10 nu) có thể có 550.000.000/ 1.048.576 = 524 vị trí bắt cặp. Do mồi gắn với ADN ở 2 điểm khác nhau trên các sợi đơn đối diện của ADN khuôn nên sẽ có 262 đoạn ADN khác nhau được nhân. Như thế số băng điện di sản phẩm PCR rất phong phú. Ứng dụng Phát hiện tính đa dạng đáng tin (sự mất đoạn NST, sự thay đổi, thêm bớt nu, xen đoạn,..đều làm thay đổi kích thước đoạn nhân bản) Câu 9. Kỹ thuật tạo thư viện mẫu cADN ? Trả lời Khái niệm cADN: là các phân tử ADN được tổng hợp từ khuôn ARN thông qua quá trình sao chép ngược. cADN được thu thập và lưu giữ trong các ngân hàng cADN Kỹ thuật tạo thư viện mẫu cADN Bước 1 – Tách mARN: có thể tách riêng mARN nhờ các tổ hợp Oligonucleotit chỉ chứa desoxythimidin (Oligo dT). Gồm các công đoạn sau : Chiết xuất toàn bộ ARN của TB gồm : mARN, tARN, rARN Cho hỗn hợp này đi qua phễu chiết gắn xenlulo – oligo dT Các mARN sẽ bị giữ lại trong phễu do hình thành liên kết A – T Dùng dung dịch NaCl để đẩy tARN + rARN ra khỏi phễu Tách riêng được mARN Bước 2 - Giải phóng mARN khỏi phễu : dùng dung dịch đệm Tris EDTA cho chảy qua phễu, các mARN sẽ được giải phóng do liên kết A – T bị phân giải Bước 3 - Dùng các mARN này làm khuôn với sự có mặt của Enzym sao chép ngược + các nguyên liệu → Quá trình tổng hợp ADN xảy ra => Thu được các cADN Bước 4 - Các cADN sẽ tiếp tục được nhân dòng và tập hợp thành các thư viện cADN. Để tìm ra các cADN cần thiết, người ta có thể sử dụng các phương pháp lai ADN hoặc phản ứng với protein kháng thể. PHẦN II. CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT Câu 1. Định nghĩa về công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ? Khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác nhân và chọn tạo giống cây trồng ? Trả lời Định nghĩa về công nghệ nuôi cấy mô TBTV Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) là phạm trù khái niệm để chỉ chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Bao gồm : Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành Nuôi cấy cơ quan : rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh Nuôi cấy phôi : phôi non và phôi trưởng thành Nuôi cấy mô sẹo (callus) Nuôi cấy TB đơn Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong TBTV sau khi tách vỏ (nuôi cấy TB trần) Khả năng ứng dụng Khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác nhân và chọn tạo giống cây trồng được thể hiện qua bảng dưới đây  Bộ phận nuôi cấy Mục đích Đỉnh chồi (Đỉnh sinh trưởng) - Tạo và nhân nhanh dòng đồng nhất về di truyền - Làm sạch virus - Nghiên cứu sinh lý phát triển Hoa cái (Bầu quả, noãn) - Thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa - Tạo đơn bội - Tạo đa phôi Hoa đực (Bao phấn và hạt phấn) - Tạo mô sẹo và cây đơn bội - Tạo đột biên ở mức đơn bội - tạo dòng đồng hợp tử Phôi - Nuôi cấy phôi khi lai xa - Nhân các dòng lai xa - Phá ngủ nghỉ của hạt Mô sẹo - Tạo phôi vô tính - Nuôi cấy TB đơn và tách TB trần - Tạo cây có biến dị soma Tế bào - Tạo đột biến ở mức độ TB - Tạo TB trần để lai vô tính - Biến nạp gen - Nuôi cấy TB đơn Câu 2. Cơ sở của nuôi cấy TBTV? Phân tích tác động của môi trường đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy? Trả lời Cơ sở của nuôi cấy TBTV Cơ sở khoa học là: + Tính toàn năng của tế bào + Tính phân hóa và phản phân hóa 1.1. Tính toàn năng của tế bào. Haberland (1902) lần đầu tiên quan niệm rằng: mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Vì vậy trong một điều kiện nhất định, một tế bào bất kỳ đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó chính là tính toàn năng của tế bào 1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa Sự phân hóa của tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau. VD: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ,.. Quá trình phân hóa có thể biểu thị: Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào chuyên hóa Tuy nhiên các tế bào khi đã được phân hóa thành các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào. Đó chính là sự phản phân hóa của tế bào. Sơ đồ thể hiện sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào: Phân hóa tế bào Tế bào chuyên hóa Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Phản phân hóa tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử AND của mỗi tế bào khiến quá trinh sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa gen của tế bào. Phân tích tác động của môi trường nuôi cấy đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy Môi trường nuôi cấy bao gồm nhiều thành phần có tác động rất lớn đến sự sinh trưởng phát triển của mô nuôi cấy trong đó sự tác động của các chất điều tiết sinh trưởng có ý nghĩa quan trọng quyết định đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy. Hai nhóm cơ bản trong chất điều tiết sinh trưởng là auxin và cytokinin. Khi tỷ lệ auxin/cytokinin thay đổi sẽ tác động rõ rệt lên hình thái của mô nuôi cấy. Cụ thể như: > 1 → Phát sinh rễ < 1 → Phát sinh chồi ~ 1 → Mô sẹo (callus) Do đó trong quá trình nuôi cấy cần phải chú ý điều chỉnh các chất điều tiết sinh trưởng để có thể điều chỉnh phát sinh hình thái mô nuôi cấy theo mong muốn Khi mô sẹo được hình thành cần chuyển chúng vào trong môi trường rắn chứa Auxin ở nồng độ thấp hơn và Xitokinin cao hơn. Sau cùng kích thích ra rễ cần loại Xitokinin, tăng nồng độ Auxin. Câu 3. Trình bày kỹ thuật nhân giống vô tính invitro? Trả lời Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro. Bước 2: Nuôi cấy khởi động. Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít chuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ…) Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp: thường dùng các chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 5 - 10 phút, Na0Cl, Ca(0Cl)2 5 - 7% xử lý trong 15 - 20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br… Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là: 25 -270C, 16h chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 - 4000lux. Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng độ thấp của xytokinin để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên. Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định( số lá, số rễ chiều cao cây). Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước. Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp. Câu 4. Vì sao có thể nuôi cấy mô phân sinh (meristem) để tạo cây sạch virus? Các bước và các điều kiện cần thiết của một hệ thống sản xuất giống sạch bệnh? Trả lời Vì sao? Theo Mathews 1970 , Wang et Hu 1980 thì mô PS đỉnh không có VR có thể do các lý do sau: VR di chuyển trong cây nhờ hệ thống mô dẫn mà hệ thống này không có ở MPS đỉnh. Trong sự phân chia, các tế bào MPS đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền Hệ thống vô hiệu hóa VR ở vùng MPS đỉnh mạnh hơn ở các vùng khác. Nồng độ auxin cao ở MPS đỉnh có thể ngăn cản quá trình sao chép VR Các bước và điều kiện… Kỹ thuật làm sạch virus invitro (4 phương pháp) Nuôi cấy mô PS đỉnh: tách chính xác mô PS đỉnh có kích thước < 0,3 mm → cấy trên môi trường phù hợp để tái sinh thành cây nguyên vẹn → kiểm tra độ sạch virus ở các cây tái sinh = các phương pháp khác nhau để thu được cây sạch bệnh. Nuôi cấy mô PS đỉnh kết hợp xử lý nhiệt độ cao Ở nhiệt độ 36 – 370C 1 số loài virus không có khả năng tự nhân lên Có thể tách mô PS đỉnh ở kích thước 0,5 – 1mm để giúp cho việc tách và tái sinh được thuận lợi hơn. Ngoài ra có thể xử lý cho: + cây mẹ trước khi tách 5 – 10 tuần ở 35 – 370C + mẫu sau khi đưa vào nuôi cấy ở 39 – 400C trong 1 – 2 tuần Nuôi cấy mô PS đỉnh kết hợp xử lý hóa chất Bổ sung vào môi trường nuôi cấy chất kháng virus: ribavirin, vidabarin,.. Có thể nuôi cấy mô PS đỉnh với kích thước lớn 0,5 – 1mm Vi ghép Ghép mô PS đỉnh lên gốc cây sạch trong điều kiện invitro Thường áp dụng với cây có múi . Nhân nhanh và duy trì tình trạng sạch bệnh Có ý nghĩa quan trọng quyết định Trồng các cây tái sinh trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh và các vector truyền bệnh (trồng trong nhà màn, nhà lưới) → nhân nhanh các cây sạch ở các vùng cách ly Để duy trì độ sạch cần tiến hành vệ sinh đồng ruộng, nhổ bỏ các cây tái nhiễm Việc chẩn đoán giúp phát hiện cây bệnh được xem là then chốt. Một số phương pháp để chẩn đoán: chẩn đoán = mắt thông qua triệu chứng, bằng cây chỉ thị, huyết thanh, bằng kính hiển vi điện tử, kỹ thuật phân tích ADN và test ELISA. Nguyên lý chung của pp test ELISA là dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể, nhưng ở đây kháng thể được liên kết với 1 enzym. Phức enzym – kháng thể - kháng nguyên sẽ dễ nhận biết do 1 phản ứng màu nhờ chính sự có mặt của enzym đó xúc tác. Phản ứng test được tiến hành khi gắn trên các mặt bản thử plastic, trên bản thử lỗ nào có màu vàng là nơi ấy có mặt phức enzym – kháng thể - kháng nguyên, tức là có virus. Cho đến nay test ELISA là công cụ chính trong chẩn đoán virus chính xác cả về mặt định tính lẫn định lượng. Câu 5. Trình bày kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro và ứng dụng của chúng trong công tác giống cây trồng? Trả lời Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn Nguyên lý: Nuôi cấy hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay là các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội. Sự phát sinh cây đơn bội từ hạt phấn gọi là sự sinh sản đơn tính đực. Có 3 phương thức sinh sản đơn tính đực sau: Sinh sản đơn tính đực trực tiếp: hạt phấn đơn nhân → phôi 1n → cây 1n: thuốc lá, cà độc dược Sinh sản đơn tính đực gián tiếp: hạt phấn đơn nhân → mô sẹo 1n → chồi 1n → cây 1n: lúa, ngô,.. Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: tương tự như gián tiếp nhưng sự hình thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết: cà chua. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn (4 bước) Bước 1: Chọn bao phấn Chọn hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào giảm nhiễm lần một, tốt nhất là chọn những hoa ra sớm. Bước 2: Xử lý nụ hoa Xử lý nhiệt độ thấp cho nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn sẽ kích thích sự phân chia tiểu bào tử để tạo cây đơn bội Bước 3: Chọn môi trường tái sinh thích hợp Tùy đối tượng nuôi cấy tuy nhiên có một số quy luật sau: Các cây họ hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt là 2,4D nồng độ cao Hàm lượng đường cao Bổ sung các hỗn hợp chất tự nhiên sẽ có tác dụng tốt Nguyên tố đa và vi lượng ít ảnh hưởng trong môi trường nuôi cấy bao phấn Bước 4: Chọn lọc cây đơn bội Xác định cây đơn bội = các phương pháp: đếm số lượng NST, đo gián tiếp hàm lượng ADN của TB,… Việc nuôi cấy hạt phấn tách rời cũng tương tự như bao phấn tuy nhiên cần tách rời hạt phấn khỏi bao. Các hạt phấn này được nuôi trong môi trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôi cấy chìm trong môi trường bán lỏng. Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh còn gọi là sự sinh sản tính cái (trinh sinh) Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng con đường này biến động ở các loại cây khác nhau Kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách TB trứng rất khó và dễ gây thương tổn Trong các cây ngũ cốc, việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh ở ngô tương đối đơn giản và thu được nhiều thành công hơn cả. Bằng phương pháp này đã tạo được trực tiếp các hạt ngô đơn bội in vitro với tỷ lệ 4 – 5% ở Việt Nam và Trung Quốc. Khả năng ứng dụng cây đơn bội in vitro Ở thể đơn bội, kiểu hình của cây phản ánh trung thực kiểu gen → là nguyên liệu lý tưởng cho công tác giống cây trồng Cây đơn bội có thể sử dụng vào các mục đích khác nhau: Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của gen Tạo đột biến ở mức đơn bội Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng Hiện nay việc ứng dụng cây đơn bội vào công tác giống cây trồng đã thu được nhiều thành tựu đáng kể: Pháp, Trung Quốc, Nhật Bản là những nước đi đầu trong lĩnh vực này Trung Quốc đã tạo ra hàng trăm giống lúa từ nuôi cấy bao phấn Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu tạo cây đơn bội và tạo các dòng thuần đồng hợp tử đang được phát triển khá mạnh trong việc chọn tạo các giống lúa đặc sản, lúa ưu thế lai, ngô,… Câu 6. Kỹ thuật tách, nuôi cấy và dung hợp TB trần? Trả lời Kỹ thuật tách TB trần (protoplast) Sức trương của TB sống là luôn cân bằng với áp lực cơ học của thành TB Khi tách vỏ, TB bị vỡ khi không còn lực nén của vỏ → để khắc phục người ta sử dụng 1 dung dịch để co nguyên sinh khi tách vỏ TB Dung dịch thường dùng là đường manitol, sorbitol nồng độ 0,3 – 0,7M tùy đối tượng Để phá vỡ thành TB, người ta dùng các enzym chiết xuất từ sinh vật chứa nhiều enzym phân giải thành TB như: nấm, ốc và mối. Thường dùng enzym celluloza + macezorim được chiết xuất từ nấm Trichdearina virde và Aspergillus niger nồng độ tùy đối tượng, pH 5,5 – 5,8 trong 3 – 8h. Thông thường cơ quan thực vật dùng để tách protoplast là lá. Cách tiến hành như sau: Lá cắt nhỏ trong dung dịch co nguyên sinh Ủ trong hỗn hợp enzym Tách protoplast qua hệ thống phễu lọc (1 gam lá khoai tây thu được 6 – 12 triệu TB trần) Rửa sạch enzym = cách ly tâm trong các dung dịch khác nhau Thu được TB trần → đem nuôi cấy, dung hợp hay chuyển nạp gen. Kỹ thuật nuôi cấy TB trần Các bước Sau 1 – 2 tuần, các TB trần tái tạo vỏ và phân chia tạo nên các microcallus Chuyển các microcallus lên môi trường cứng, chúng sẽ tạo thành các macrocallus (mô sẹo) Chuyển sang môi trường tái sinh chồi và cây hoàn chỉnh như quy trình nuôi cấy mô thông thường. Lưu ý: Ở mỗi giai đoạn người ta sử dụng môi trường nuôi cấy đặc hiệu khác nhau. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của TB trần Nuôi cấy TB trần thường yêu cầu một số thay đổi so với quy trình nuôi cấy mô bình thường do bản chất của TB trần Các thay đổi thường liên quan đến sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia TB. Kỹ thuật dung hợp TB trần TB trần là những TB không có thành TB, chính vì thế mà chúng có thể hòa lẫn vào nhau (dung hợp) để tạo thành 1 TB lai mang trong mình VCDT của cả 2 TB. Các phương pháp dung hợp TB trần Dung hợp bằng hóa chất Thường sử dụng polyethylenglycol (PEG 5 – 25%) là chất có tác dụng gắn kết TB → trần để dung hợp. Quá trình dung hợp sẽ được cải thiện hơn nếu xảy ra trong môi trường kiềm (pH 8 -10) và có bổ sung CaCl2 (50 – 250 mM). Dung hợp bằng điện Đưa dung dịch hỗn hợp TB trần vào một điện trường Các TB trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi giữa 2 bản cực Khi có 1 xung điện cao (750 – 1000V) trong 1 thời gian rất ngắn (1 – 200 mili giây) → vùng tiếp xúc giữa 2 màng TB bị vỡ → 2 TB trần hòa nhập vào nhau → Quá trình dung hợp xảy ra. Các loại dung hợp Dung hợp đối xứng: 2 TB trần có cùng nhân ở mức bội thể như nhau Dung hợp không đối xứng Tạo ra thể lai TB chất Chủ yếu là trộn TB chất để chuyển nạp các VCDT TB chất Một trong 2 TB sẽ bị diệt nhân trước khi dung hợp Câu 7. Trình bày kỹ thuật bảo quản nguồn gen in vitro? Trả lời Phương thức bảo quản nguồn gen in vitro là một trong các phương thức bảo quản nguồn gen thực vật, có vai trò quan trọng, điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động và là biện pháp hiệu quả đối với cây trồng nhân giống vô tính và hạt cây dễ mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và độ ẩm thấp. Có 2 phương pháp bảo quản in vitro là: bảo quản sinh trưởng tối thiểu và bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời. Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểu Áp dụng; bảo quản ngắn hạn đối với cây in vitro Mẫu: phôi, mầm, chồi, cây con Mục đích: kéo dài giữa 2 lần cấy chuyển nhờ ức chế sinh trưởng mẫu cấy (giảm tốc độ sinh trưởng 15 – 20 lần so với bình thường) → giảm đến mức tối thiểu chi phí trong quá trình bảo quản. Các tác nhân dùng ức chế sinh trưởng: Nhiệt độ phòng nuôi giảm Với các loài chịu lạnh: bảo quản 0 – 50C Với các loài nhiệt đới: bảo quản ở nhiệt độ cao hơn Bổ sung vào môi trường: chất ức chế sinh trưởng (ABA, CCC) hay chất là tăng áp suất thẩm thấu của môi trường Giảm O2 Sau bảo quản: cần chuyển mẫu vào môi trường mới pha chế → đặt trong điều kiện tối thích trong 1 thời gian ngắn nhằm kích thích sinh trưởng của mẫu → chu kỳ bảo quản mới. Phương pháp bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời Môi trường bảo quản: Nitơ lỏng Mẫu: phôi, mô sẹo, mô nuôi cấy Thời gian: 20 – 30 năm hoặc lâu hơn Trước bảo quản: cần xử lý để tránh sự tạo các tinh thể nước trong TB gây chết mẫu Quy trình bảo quản: Tách mẫu ở giai đoạn sinh trưởng mạnh để đưa vào bảo quản Xử lý chống đông cho TB, mô nuôi cây: bằng dung dịch prolin 5 – 10% , manitol 3 – 6% có bổ sung chất chống đông là dung dịch DMSO 1M + glycerol 1M + saccarose 2M… Xử lý lạnh: đến nhiệt độ đóng băng ổn định của TB chất (-30 ÷ - 400C) Bảo quản mẫu: trong nitơ lỏng (-1960C) Sau bảo quản: phải phá băng (37 – 400C) để phục hồi mẫu → nuôi cấy để tạo cây hoàn chỉnh. Câu 8. Vì sao có thể chuyển gen vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien? Trả lời Đáp án: Thực chất đã có 1 hệ thống chuyển nạp gen của vi khuẩn A. tumefacien tồn tại trong tự nhiên. Plasmid của vi khuẩn đất (Ti-plasmid) chính là tác nhân truyền VCDT gây bệnh u ở thân cây khi cây bị nhiễm VK này (1) Cơ chế chuyển nạp gen tự nhiên của VK A. tumefacien (2) Để c/m cho ý trên, 2 luận điểm là Chứng minh (1) Hiện tượng bình thường: u ở thân cây khi bị nhiễm VK A. tumefacien Hiện tượng bất thường: u vẫn phát triển ngay cả khi tiêu diệt VK này → K