Đề tài Bước đầu phân tích proteomics tế bào bệnh leukemia

chỉ thị sinh học cho các tế bào ung thư biểu mô ở thận và phát triển thành bộ kit thử để kiểm tra bệnh. Ở các bệnh liên quan đến thận, nước tiểu là một nguồn chỉ thị sinh học đầy tiềm năng. Gần đây, người ta đã nghiên cứu được các polypeptides trong nước tiểu có thể là những chỉ thị sinh học của các bệnh liên quan đến thận, cho phép người ta có thể phân tích, chẩn đoán bệnh một vài tháng trước khi xuất hiện các triệu chứng của bệnh [22]. Việc nắm được thông tin của hệ proteome, cấu trúc và chức năng của từng protein và phức hệ tương tác protein-protein sẽ quyết định đến việc phát triển các kỹ thuật chẩn đoán hữu hiệu cũng như những phương pháp chữa trị bệnh trong tương lai. 1.2.3. Một số kỹ thuật quan trọng sử dụng trong Proteomics Proteomics phát triển dựa trên sự tiến bộ của rất nhiều công nghệ. - Kỹ thuật điện di một chiều và hai chiều : Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường. Điện di hay điện di trên gel áp dụng trong sinh học phân tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện (isoelectric point). Kĩ thuật này hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel). Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào sự khác nhau của lực điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau), kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử. Điện di protein thường sử dụng là điện di trên gel acrylamide có SDS (SDS-PAGE), hoặc điện di 2 chiều (2-DE). Phương pháp nền tảng trong nghiên cứu proteomics là điện di hai chiều (2-DE), cho đến nay vẫn được coi là phương pháp không thể thay thế trong việc mô tả thành phần protein (hệ proteome) của một cơ thể. 2-DE được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1975 bởi Klose và O'Farrell [19]. Kỹ thuật này cho phép phân tích và nhận rõ ràng đến hàng nghìn protein trong một bản gel điện di, trong đó các protein được phân tách dựa trên hai đặc tính là điểm đẳng điện và khối lượng phân tử. Ứng dụng của điện di hai chiều là phân tách phức hệ protein hỗn hợp và phân tích sự cải biến protein sau khi phiên mã. Điện di hai chiều còn cho ta biết những thông tin có giá trị về đặc tính phân tử protein, mối quan hệ giữa điểm đẳng điện (pI) của protein và khối lượng phân tử. - Các phần mềm phân tích ảnh Các phần mềm phân tích ảnh điện di có khả năng định lượng và tự động nhận ra các điểm của protein trong gel mẫu. Mặc dù các phần mềm này chưa thật hoàn hảo nhưng kết hợp với năng lực xử lý và kinh nghiệm người sử dụng, các phần mềm này đều cho những kết quả rất tốt. - Sắc ký lỏng đa chiều (Multidimentional Liquid Chromatography-MDLC) Mặc dù điện di hai chiều có nhiều ưu điểm như đã trình bày ở trên nhưng phương pháp này còn có hạn chế là: khó phát hiện các protein có hàm lượng thấp, có điểm đẳng điện quá thấp hoặc quá cao cũng như các protein không hòa tan là thành phần cấu trúc của màng. Một phương pháp khác cho phép khắc phục những nhược điểm ấy là kỹ thuật sắc ký đa chiều (MDLC). MDLC cho phép phân tích hiệu quả các thành phần protein phức tạp, trong đó mỗi hỗn hợp protein có thể giảm độ phức tạp qua một loạt cột sắc ký lỏng khác nhau. Dựa vào số lần mẫu được tiến hành phân tích qua sắc ký mà người ta chia thành sắc ký lỏng một chiều, hai chiều (2DLC) (kết hợp sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký ái lực và sắc ký pha đảo), hoặc ba chiều - Khối phổ Phương pháp khối phổ xuất hiện từ những năm đầu của thế kỉ XX do Thomson và các nhà khoa học khác tìm ra từ năm 1912 [17]. Nó đóng vai trò quan trọng trong việc xác định cấu trúc của những phân tử nhỏ. Sau đó, phương pháp này cũng được cải tiến để ứng dụng trong nghiên cứu sinh học đặc biệt là xác định cấu trúc của các đại phân tử như protein. Proteomics dựa trên nguyên lý khối phổ đã trở thành một môn khoa học thật sự nhờ các dữ liệu về trình tự gen và genome cùng với nhiều thành tựu kỹ thuật vượt bậc trong nhiều lĩnh vực khác, trong đó đặc biệt phải kể đến sự phát triển của những phương pháp ion hóa protein. Các kỹ thuật này là những kỹ thuật không thể thiếu được để diễn giải những thông tin được mã hóa trong hệ genome. Cho đến nay những phân tích về protein (trình tự bậc 1, những biến đổi sau phiên mã, dịch mã hoặc tương tác giữa protein-protein v.v.) bằng khối phổ không chỉ thành công với những nhóm protein có chức năng riêng biệt, mà cả với phức hệ protein được biểu hiện trong tế bào. Trong những năm gần đây, khối phổ (MS) đã trở thành công cụ được lựa chọn để hoàn thiện phân tích những mẫu protein. Khối phổ là một phương pháp kỹ thuật ở đó đo được 2 đặc tính: tỷ lệ khối lượng/điện tích của phân tử ở dạng ion hóa (m/z); và số lượng những ion biểu hiện cho mỗi giá trị m/z. Một cách đơn giản, kỹ thuật phân tích này làm cho từng phân tử protein tách khỏi nhau thành các peptid nhỏ và phát tán rộng như một đám mây gồm các ion mang điện tích và di chuyển tự do. Phương pháp phổ biến để xác định khối lượng của các ion này - là gia tốc chúng trong buồng chân không, để đo được thời gian bay (Time of Flight - TOF) của chúng. Chúng "đạt tới mục tiêu" trong một trật tự được xác lập, một phần bởi điện tích và một phần bởi khối lượng của chúng. Những ion nhanh nhất là những ion nhẹ nhất và có điện tích lớn nhất. Sản phẩm cuối cùng là một phổ khối lượng hay đồ thị với một loạt những đỉnh nhọn, mỗi một đỉnh tiêu biểu cho ion hoặc chất mang những mảnh protein có mặt trong mẫu thử đã cho. Chiều cao của đỉnh và khoảng cách giữa chúng là dấu hiệu của mẫu và cung cấp đầu mối để nhận dạng chúng 1.3. Proteomics trong nghiên cứu bệnh leukemia Với những tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị bệnh leumkemia, tỷ lệ bệnh nhân tử vong đã giảm và tỷ lệ bệnh nhân sống sót cũng tăng ở cả người trưởng thành và trẻ em trong tất cả các thể bệnh. Tuy nhiên vẫn có tới 21790 người chết ở Mỹ vào năm 2007 vì loại bệnh máu ác tính này. Với các thể bệnh leukemia, tỷ lệ sống sót chỉ chỉ hơn 50%. Mặc dù tỷ lệ tử vong ở trẻ em từ 0-14 tuổi mắc leukemia đã giảm đến 70% qua ba thập kỷ nhưng bệnh này vẫn gây ra nhiều cái chết hơn bất cứ bệnh ung thư nào khác đối với trẻ em Mỹ. Ước tính đã có 515 trẻ em chết vì leukemia tại Mỹ năm 2007[18]. Do đó, việc điều trị bệnh leukemia vẫn luôn là một trong những thách thức to lớn của nền y học hiện đại. Mục tiêu của việc điều trị là làm giảm hoàn toàn các triệu chứng, bệnh lý của bệnh và bệnh nhân trở lại sức khỏe bình thường với các tế bào máu và tủy bình thường. Đối với bệnh leukemia cấp, sự lui bệnh hoàn toàn (không có các biểu hiện về bệnh trong máu và tế bào) trong 5 năm liên tục là dấu hiệu chứng tỏ bệnh đã được chữa trị. Các báo cáo gần đây cho thấy càng ngày càng có nhiều bệnh nhân leukemia đã lui bệnh hoàn toàn ít nhất sau 5 năm khi họ chẩn đoán phát hiện bệnh. Để nâng cao khả năng chẩn đoán và đẩy lui bệnh, ngày càng có nhiều phương pháp mới được áp dụng trong nghiên cứu leukemia. Phương pháp quan sát kiểu nhân đã cung cấp các thông tin quan trọng nhất trong chẩn đoán ở AML trưởng thành. Ngoài ra, bằng việc sử dụng các phân tích trên nhiễm sắc thể thấy rằng xấp xỉ 50% số bệnh nhân AML không có các bất thường nhiễm sắc thể [13]. Đối với các bệnh nhân AML này, các phương pháp di truyền phân tử trở thành yếu tố quan trọng chính. Liệu pháp miễn dịch cung cấp cơ hội loại bỏ các tế bào miễn dịch còn sót lại trong quá trình lui bệnh và có thể giảm đáng kể hay thậm chí loại trừ rủi ro của sự tái phát. Trong suốt 20 năm qua, y học đã có sự cải tiến đáng kể trong khả năng đánh giá xác định các kháng nguyên ung thư. Phân tích huyết thanh qua các ngân hàng biểu hiện cADN tái tổ hợp cho phép việc nhận dạng các kháng nguyên liên kết với leukemia dựa vào việc nhận ra chúng bằng các phản ứng dịch thể nhưng cũng đưa ra một chứng minh rằng những kháng nguyên này được nhận biết bằng các tế bào T CD4+ và CD8+ cũng tốt như tế bào B. Gần đây, kỹ thuật vi chuỗi phản ứng (microarray), phân tích đa hình nucleotide đơn (SNPs) và điện di hai chiều cho phép chúng ta phân tích sâu rộng về sự khác biệt về gen, ARN và protein giữa bệnh nhân và các mẫu đối chứng bình thường. Hiện nay, với việc áp dụng các kỹ thuật proteomics trong phân tích leukemia người ta đã đi sâu vào nghiên cứu leukemia theo nhiều con đường và mục đích khác nhau. Tất cả các nghiên cứu này hướng tới mục đích cuối cùng là làm tăng hiệu quả điều trị bệnh leukemia. Các nghiên cứu proteomics bệnh leukemia thường dựa trên một trong hai nguồn nguyên liệu chính là huyết tương và tế bào bệnh nhân 1.3.1. Phân tích proteomics trong huyết tương bệnh nhân leukemia Huyết tương (plasma) là phần dịch lỏng màu vàng nhạt còn lại sau khi máu đã loại bỏ các tế bào máu. Một người trưởng thành chứa khoảng 2,5 lít huyết tương với gần 250gram protein. Hàm lượng protein trong huyết tương thay đổi từ 60-80mg/ml. Dịch huyết tương có tính lỏng, keo nhớt, có tỷ trọng 1,051±0,005, pH=7,3-7,4, ở 370C, áp suất thẩm thấu trong khoảng 7,2-8,1. Người ta ước lượng có khoảng từ 1000 đến 2000 protein khác nhau có mặt trong huyết tương tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng là các protein có nồng độ rất thấp (<1ng/ml). Các protein trong huyết tương thay đổi khác nhau về số lượng và nồng độ, nó được coi là hệ protein phức tạp nhất ở người. Huyết tương cũng được coi là hệ protein hoàn thiện nhất, chứa một loạt các protein khác nhau, là mẫu proteome hàng đầu được dùng cho chẩn đoán y học. Những hiểu biết hệ protein huyết tương rất quan trọng về mặt lâm sàng, cung cấp những thông tin chắc chắn thúc đẩy nhanh quá trình phát hiện bệnh. Một số protein có hàm lượng cao (>mg/ml) như albumin thông thường thay đổi từ 35-50 mg/ml (chiếm từ 50-70%), do sự tổng hợp hàng ngày của gan (12g) và có chu kỳ sống là 21 ngày nên nó được coi là chỉ thị của bệnh sơ gan hay bệnh suy dinh dưỡng . Các protein có hàm lượng thấp (<ng/ml) chỉ chiếm 1% hàm lượng protein tổng số, như interleukin 6 thông thường thay đổi trong khoảng 0-5 pg/ml được coi là chất chỉ thị có độ nhạy cao trong quá trình viêm, nhiễm vi sinh vật. Hiện nay hơn 22 triệu lít huyết tương của người đã được xử dụng trên toàn thế giới thông qua quá trình phân đoạn trong mỗi một năm nhằm tạo ra các protein điều trị bệnh cho hơn một triệu người. Những hiểu biết về hệ protein trong huyết tương mang lại những thông tin quan trọng về nhiều quá trình sinh học diễn ra trong cơ thể. Bất cứ một thay đổi nào của các protein huyết tương cũng sẽ là dấu hiệu của tình trạng bệnh lý như: ung thư, tiểu đường, tim mạch v.v. Do đó việc nhận dạng các protein, peptid trong huyết tương có thể cung cấp nhiều thông tin mà cơ thể phản ứng với những thay đổi này. Phân tích và so sánh các thành phần protein trong huyết tương của người ở trạng thái bình thường và bị bệnh có thể giúp cho các nhà nghiên cứu hiểu rõ hơn các sự cố trong tế bào dẫn đến bệnh lý, đồng thời đưa ra phương pháp chẩn đoán mới, nhanh và có hiệu quả. Một trong những động lực khi nghiên cứu hệ protein là khám phá ra những chỉ thị sinh học, những protein này có thể là đích tác động của thuốc chữa bệnh và chúng sẽ có một vai trò quan trọng đối với sự phát triển những liệu pháp chữa trị mới. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng protein huyết tương có thể là các chỉ thị sinh học đủ tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh như: ung thư buồng trứng (CA 13-5), ung thư tuyến tiền liệt (PAP), ung thư gan (a-fetoprotein), và các bệnh về tim mạch (C-ractive protein) [11]. Mặc dù qua nhiều thập kỉ nghiên cứu nhưng mới chỉ có một lượng nhỏ các loại protein được sử dụng cho mục đích chẩn đoán. Bệnh leukemia là một bệnh liên quan trực tiếp đến hệ thống máu trong cơ thể, do đó, rõ ràng việc lựa chọn hệ protein huyết tương làm đối tượng nghiên cứu bệnh leukemia là một việc tất yếu, hứa hẹn đem lại nhiều thành quả quan trọng trong việc nghiên cứu leukemia nói chung. Trên đối tượng là huyết tương của các bệnh nhân leukemia kinh dòng lympho (CLL), năm 2003, Cochran và cộng sự đã phân tích proteomics các phân nhóm CLL với các gen Ig VH đột biến và không đột biến [8]. Phân tích hệ protein của 12 bệnh nhân CLL với 6 trường hợp có đột biến và 6 trường hợp không đột biến trên chuỗi nặng Ig bằng cách sử dụng điện di hai chiều và khối phổ. Kết quả là họ đã tìm ra một số protein biểu hiện khác biệt giữa mẫu có đột biến và không có đột biến. Nồng độ của protein F-actin-capping tiểu đơn vị b, protein 14-3-3 b và tiền chất protein gắn laminin tăng lên ở CLL đột biến so với thể không đột biến. Ngoài ra, nucleophosmin chỉ xuất hiện dưới dạng một vài spot protein ở CLL thể đột biến mà không phát hiện thấy trên mẫu không đột biến. Điều này có thể được giải thích rằng một số dạng cải biến sau dịch mã của nucleophosmin biến đổi giữa hai nhóm này. Kết quả này cho thấy phân tích proteomics huyết tương có thể bổ sung các phương pháp trong việc nhận dạng protein, các protein này có thể có vai trò quan trọng trong việc xác định sự khác biệt về sinh học và trong chẩn đoán giữa các phân nhóm CLL. 1.3.2. Phân tích proteomics tế bào bệnh nhân leukemia Wang và các cộng sự (2004) đã tiến hành nghiên cứu proteomics dòng tế bào leukemia (K562/CR3) bằng việc sử dụng điện di không dòng kết hợp với sắc ký lỏng và khối phổ LC/MS [28]. Các tế bào được dung giải đã được phân tách thành 96 phân đoạn bằng điện di không dòng, sau đó được chạy qua SDS- PAGE và những phân đoạn hiện băng được chạy tiếp qua LC/MS. Trong 96 phân đoạn đó có 35 phân đoạn pH từ 4,75 đến 9,6 được lựa chọn để xác định và đã nhận dạng được 736 protein khác nhau. Cũng vào năm 2004, Cui và cộng sự đã tiến hành phân tích proteomics tế bào bệnh nhân leukemia cấp nhằm tìm hiểu sâu hơn về hệ thống phân loại chúng [10]. Hệ thống phân loại của Pháp-Mỹ-Anh (FAB) về leukemia cấp với các khác biệt di truyền đóng vai trò quan trọng trong điều trị và chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, việc mô tả và xác định các phân tử protein khác nhau phân biệt giữa các phân nhóm của hệ thống phân loại leukemia cấp vẫn chưa rõ ràng. Nghiên cứu được thực hiện trên 61 bệnh nhân leukemia cấp đã được phân loại theo hệ thống FAB. Các protein của những tế bào leukemia lấy từ các bệnh nhân này được phân tách bằng điện di hai chiều và các spot protein có biểu hiện khác nhau được nhận dạng bằng khối phổ. Nhóm nghiên cứu này đã thành công trong việc mô tả các protein khác biệt giữa các nhóm và các phân nhóm theo phân loại FAB, bao gồm leukemia cấp dòng tủy, các phân nhóm của nó (M2, M3 và M5) và leukemia cấp dòng lympho. Họ đã nhận được kết quả đồng nhất giữa các mẫu thuộc cùng một phân nhóm và sự khác biệt rõ rệt với tất cả các phân nhóm khác. Một nhóm protein biểu hiện với hàm lượng cao hơn ở M2 và M3 so với các phân nhóm khác cũng được xác định. Cũng trong nghiên cứu này, các protein liên quan dòng tủy Mrp 8 và Mrp 14 lần đầu tiên được đưa ra để đánh dấu sự khác biệt của AML và phân biệt AML với ALL. Protein sốc nhiệt 1 (HSP 1) và một số protein khác biểu hiện tăng ở ALL được tìm thấy đóng vai trò quan trọng trong việc phân biệt ALL với AML. Protein NM23-H1 có biểu hiện mạnh ở tất cả các phân nhóm trừ dạng M3a có thể có ích trong chẩn đoán. Những kết quả nghiên cứu này liên quan đến việc mô tả các con đường biểu hiện gen bất thường trong phát sinh bệnh leukemia có thể làm cho việc xác định ở mức độ phân tử hệ thống phân loại FAB được dễ dàng. Năm 2005, Rezaul và nhóm nghiên cứu đã phân tích hệ protein ty thể từ các tế bào T bệnh nhân leukemia [21]. Với 40 mg protein tinh sạch từ ty thể, nhóm nghiên cứu đã xác định được 227 protein ty thể đã được biết đến và thêm 453 protein được coi là protein liên kết với ty thể. Phân tích 60 mg protein ty thể xác định được 466 protein được biết đến là có chức năng tham gia vào các quá trình khác nhau như hô hấp, chu trình tricarboxylic acid (chu trình TCA), chuyển hóa amino acid và nucleotide, đường phân, stress bảo vệ chống oxy hóa, tập trung ty thể, vận chuyển các phân tử, sinh tổng hợp protein, điều khiển chu trình tế bào và rất nhiều các quá trình khác trong tế bào. Với một nghiên cứu tương tự, năm 2006, López-Pedrera và nhóm nghiên cứu của mình đã tiến hành phân tích những thay đổi trong biểu hiện protein ở các tế bào leukemia cấp dòng tủy bằng các kỹ thuật proteomics nhằm đi sâu vào chẩn đoán sớm chính xác hơn bệnh ung thư này. Bẩy protein được xác định có thay đổi đáng kể trong hầu hết các tế bào nguồn AML phân tích trong mối tương quan với các tế bào máu đơn nhân bình thường: alpha-enolase, RhoGD12, annexin A10, catalase, peroxiredoxin 2, tromomyosin 3 và lipocortin (annexin 1). Các protein khác biệt này đóng vai trò quan trọng trong việc thực hiện các chức năng tế bào như thủy phân glycogen, ngăn chặn khối u, apoptosis, hình thành mạch, di căn và chúng có thể tạo ra tiến triển bất lợi cho bệnh. Trong nghiên cứu này, áp dụng phân tích proteomics lần đầu tiên xác định các protein mới không những giúp ích cho chẩn đoán mà còn được sử dụng như là các dấu chuẩn sinh học của bệnh, vì thế cung cấp các đích mới quan trọng cho các liệu pháp dựa trên cơ chế sinh bệnh của AML. 1.3.3. Nghiên cứu proteomics bệnh leukemia ở Việt Nam Trong những năm gần đây, phương pháp proteomics đã bắt đầu được áp dụng trong việc nghiên cứu bệnh leukemia ở Việt Nam. Năm 2005, Trịnh Hồng Thái và cộng sự đã áp dụng kỹ thuật điện di hai chiều kết hợp với khối phổ để phân tích proteomics huyết tương người bị bệnh leukemia cấp dòng tủy [25]. Bằng việc so sánh các bản gel điện di hai chiều, nhóm nghiên cứu đã nhận ra 12 protein biểu hiện khác nhau trong đó có các protein là chất phản ứng pha cấp và một số là chất chỉ thị ung thư. Trong số các protein này có enzyme ADN topoisomerase được biểu hiện tăng lên ở người bị leukemia cấp dòng tủy, enzyme này đã được chứng minh có liên quan tới sự chuyển vị nhiễm sắc thể 8;21 trong bệnh này. Tiếp theo nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã phân tách được trung bình 600 spot protein trên các bản gel điện di huyết tương các thể bệnh leukemia cấp dòng tủy. Phân tích so sánh đã chỉ ra được 2 protein chỉ xuất hiện ở người bình thường mà không có ở các bản gel bệnh, 4 spot protein chỉ có mặt trên các bản gel bệnh mà không tìm thấy trên mẫu đối chứng. Để mở rộng đối tượng nghiên cứu trên các thể bệnh leukemia, năm 2007 Trịnh Thị Thanh Hương và Trịnh Hồng Thái đã công bố kết quả phân tích proteomics huyết tương người bệnh leukemia cấp dòng lympho [3]. Trong kết quả này, sự khác biệt trong biểu hiện protein giữa mẫu đối chứng và các thể bệnh cũng được phát hiện. Tất cả các kết quả trên của nhóm nghiên cứu này nhằm chỉ ra sự khác biệt trong biểu hiện protein ở huyết tương bệnh nhân, tìm ra các marker sử dụng trong chẩn đoán bệnh. Các công trình nghiên cứu trên đang tiếp tục và mở rộng đối tượng, hứa hẹn nhiều kết quả khả quan, ứng dụng thiết thực trong sinh, y, dược học. CHƯƠNG 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là 46 bệnh nhân được chẩn đoán mắc leukemia từ tháng 11/2007 đến tháng 2/2008 tại Viện huyết học và Truyền máu Trung ương. Dựa trên các kết quả xét nghiệm, những bệnh nhân này được xác định thuộc các thể bệnh: - ALL thể L2: 20 người, thể L3: 1 người - AML thể M1: 1 người, M2: 5 người, M3: 2 người, M4: 3 người , M5: 3 người, M6: 4 người. - CLL: 1 người - CML: 6 người Để nghiên cứu proteomics tế bào, mẫu tủy của 31 bệnh nhân được chọn ra một cách ngẫu nhiên để tiến hành các bước phân tích. Ngoài ra nghiên cứu cũng được tiến hành trên mẫu huyết tương của các bệnh nhân này. Huyết tương thu được từ máu đã chống đông và đã được xác định là không bị nhiễm các loại bệnh truyền nhiễm. 2.1.2. Hoá chất - Chất tạo tỉ trọng tách bạch cầu Ficoll™ 400 F4375 (Sigma-Mỹ) - ReadyPrep™ 2D Cleanup Kit (BioRAD-Mỹ) - IPG strip pH 4-7 chiều dài 7cm (Biorad- Mỹ). - Bio-Lyte 3/10 ampholyte (Biorad- Mỹ) - Enzyme trypsin đạt độ sạch phân tích (Promega- Mỹ). - Tất cả các hoá chất khác: 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid (CHAPS), Urea, Thiourea (Invitrogen), dithiothreitol (DTT), Iodoacetamide (Biorad), SDS, Acylamide (USB- Pharmacia), … đạt độ tinh sạch dùng cho phân tích proteomics 2.1.3. Thiết bị - Ly tâm lạnh sử dụng roto văng Sigma - Thiết bị điện di biến tính SDS-PAGE: Mini-Protean 3 (BioRad-Mỹ). - Nguồn chạy điện di Bio-Rad Power/PAC 1000 (BioRad-Mỹ) - Thiết bị điện di Criterion™ Cell (BioRad-Mỹ) - Thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (BioRad - Mỹ). - Hệ thống cắt và xử lý gel tự động XCISE (Shimadzu Biotech - Nhật Bản). - Ngoài ra còn các dụng cụ và máy khác của Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm về Công nghệ Enzyme- Protein. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Đánh giá một số đặc điểm tế bào học của bệnh leukemia Các bệnh nhân nhập viện có chẩn đoán xác định mắc bệnh được chọn làm mẫu nghiên cứu. Các số liệu xét nghiệm huyết tủy đồ của bệnh nhân khi vào viện được thu thập nhằm tìm hiểu các đặc điểm tế bào của máu ngoại vi và tủy xương. Các số liệu thống kê về các đặc điểm tế bào được xử lý bằng phần mềm SPSS version 13.0 giúp đánh giá một số đặc điểm tế bào học đặc trưng cho bệnh trong phạm vi các mẫu nghiên cứu. 2.2.2. Tách tế bào bạch cầu từ tủy xương - Mẫu tế bào bệnh nhân leukemia: Dịch tủy sau khi lấy ra từ người bệnh được chống đông bởi EDTA và được sử dụng trong vòng 4 tiếng. Dịch tủy được ly tâm 1500 vòng/phút ở nhiệt độ 20oC trong 10 phút để lắng hồng cầu. Sau đó, mẫu được hòa với đệm PBS theo tỷ lệ 1:1 và rải đều lên bề mặt Ficoll® 400 F4375 có tỉ trọng 1,077 g/ml, tiếp tục ly tâm trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 4oC, tốc độ 4000 vòng/phút. Sau khi ly tâm, lớp tế bào được tách khỏi mẫu dung dịch đệm-Ficoll và rửa bằng đệm PBS. - Mẫu huyết tương bệnh nhân leukemia Mẫu huyết tương của người bệnh được trộn lại thành một ống để phân tích. Huyết tương được ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ hết các tế bào máu và sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút trước khi bảo quản ở -20oC để chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo. 2.2.3. Tách chiết protein từ tế bào bạch cầu - Các tế bào bạch cầu được phá vỡ bằng sóng siêu âm trong đệm chạy điện di hai chiều (đệm A) có chứa 7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 65 mM DTT. Dịch phá tế bào được xử lý theo 2 phương pháp: + Tủa dịch phá tế bào bằng acetone lạnh trong -20oC theo tỷ lệ 1:2, 1:3 thể tích. Sau đó hòa tủa bằng đệm A có 0,2% ampholyte 3/10 để chuẩn bị cho bước điện di tiếp theo. + Dịch phá tế bào được làm sạch một phần bằng cách sử dụng ReadyPrep™ 2D Cleanup Kit. Protein tủa được hòa lại bằng đệm A có 0,2% ampholyte 3/10 để chuẩn bị cho bước điện di tiếp theo. - Mẫu huyêt tương bệnh được xử lý bằng ReadyPrep™ 2D Cleanup Kit. Protein lắng tủa được hòa tan bằng, 0,2% ampholyte 3/10 để chuẩn bị cho bước điện di hai chiều tiếp theo. 2.2.4. Điện di hai chiều Hàm lượng protein trong các mẫu huyết tương được xác định bằng phương pháp Bradford trước khi chạy điện di hai chiều để đảm bảo tính đồng nhất về lượng protein lên mẫu điện di hai chiều giữa các mẫu nghiên cứu. Điện di hai chiều bắt đầu bằng việc làm trương strip: dịch protein được ngâm cùng với thanh gel gradient pH cố định (IPG strip) 4-7, chiều dài 11 cm trong thời gian 14h. Trong quá trình này, protein sẽ thấm vào IPG strip. Điện di đẳng điện được thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell (Biorad - Mỹ) để tập trung các phân tử protein vào vị trí trên IPG strip nơi có pH trùng với pI của phân tử đó. Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 3 bước nối tiếp nhau dưới điều kiện về nguồn điện như sau: Bảng 3. Chương trình chạy điện di đẳng điện 11 cm Hiệu điện thế (V) Thời gian (t) V.t (V-giờ) Chế độ tăng U Bước 1 250 20 phút Tuyến tính Bước 2 8.000 2,5 giờ Tuyến tính Bước 3 8.000 20.000 V-giờ Nhanh Tổng 5,5 giờ ~30.000V-giờ Kết thúc điện di đẳng điện, các IPG strip được cân bằng trong 10 ml dung dịch đệm cân bằng I với thành phần 50 mM Tris HCl, pH 8,8; 6 M urea, 30% glycerol 2% SDS có chứa 100 mg DTT. Sau đó tiếp tục cân bằng trong 10ml đệm cân bằng II với thành phần tương tự như đệm cân bằng I chỉ thay DTT bằng 250 mg iodoacetamide. Chiều thứ hai của điện di hai chiều được tiến hành trên gel polyacrylamide có SDS (SDS-PAGE) với gel gradient 7-15% polyacrylamide. Sau khi điện di chiều thứ hai, các gel được cố định trong 1 giờ bởi dung dịch chứa 1,3% axit phosphoric, 20% methanol và nhuộm màu qua đêm bằng Coomassie G-250 theo phương pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988) [26]. Phương pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein. 2.2.5. Phân tích hình ảnh các bản gel điện di hai chiều Các bản gel điện di hai chiều được quét vào máy tính trên hệ thống cắt và xử lý gel tự động Xcise (Shimazdu, Nhật Bản). Hình ảnh thu được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng cho phân tích gel điện dai hai chiều Phoretix (Shimazdu, Nhật Bản). Trước tiên phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel. Mỗi bản gel được chỉ ra số lượng spot, mỗi spot đều được xác định số thứ tự, vị trí, thể tích (tính theo độ lớn và độ đậm nhạt c