Đề tài Các phương pháp định lượng protein

) Sau khi vô cơ hóa ta đuổi NH3 ra khỏi dunh dịch bằng NaOH. (NH4)2SO4 + NaOH  Na2SO4 + NH3 + H2O Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 8 Lượng NH3 sinh ra được lôi cuốn bằng máy Parmas và được dẫn đến một erlen có chứa một lượng thừa H2SO4 đã biết chính xác nồng độ. Lúc này NH3 sẽ tác dụng với H2SO4 chuyển thành (NH4)2SO4 . NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4 + H2SO4 dư Sau đó đi chuẩn độ lượng H2SO4 còn lại bằng dung dịch NaOH qua đó tính được lượng nitơ có trong mẫu. NaOH + H2SO4  Na2SO4 + H2O Cáùch tiếán hàønh: Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị:  Nguyên liệu: các mẫu cần xác định hàm lượng Protein, nếu nguyên liệu khô cần được sấy khô tuyệt đối (105 o C, trong 30 phút).  Hóa chất: hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 (9:1), H2SO4 đặc, H2SO4 0,01N, H3PO3 2%, NaOH 0,01N, nước cất vô đạm , cồn 96 o , acid tricloacetic (TCA), thuốc thử đỏ metyl.  Thiết bị: bếp đun, máy cất đạm Parmas Warger. (chen hình vào) Quá trình được thực hiện qua các bước.  Bước 1: vô cơ hóa mẫu (được tiến hành trong tử hotte để tránh khí độc SO2, CO2). Nếu mẫu khô thì cân 0,1 -0,3g mẫu rồi dùng một ống giấy (không tro) cuộn tròn cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào đó vài giọt nước cất vô đạm để thấm ước bột. Nếu mẫu là chất lỏng thì dùng pipet lấy 2 – 5 ml,nếu nước quả hộp thì nên lấy 10 – 20ml. tiếp tục cho 0,5g hỗn hợp xúc tácK2SO4/CuSO4 (hoặc selen, hay H2O2 30%, hay HCLO4 70%) và 10ml H2SO4 đặc. Để bình Kjeldahl trên bếp điện đặt trong tủ hotte và đun cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt và có màu xanh da trời nhạt là được. Lấy ra để nguội. Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 9 Chuyển sang bình định mức 100ml, tráng bình Kjeldahl nhiều lần bằng nước cất vô đạm và định mức đến vạch định mức.  Bước 2: Cất đạm Sơ đồ máy cất đạm Rửa máy: cho vào bình A khoảng 3/2 thể tích bình, đun sôi bình và mở nước vào ống làm lạnh D, cả 3 khóa điều đóng, sau đó cho lên phiểu C một ít nước cất (khoảng 10 ml) và cho chảy xuống bình B rồi khóa van 2 lại. Hơi nước của bình A sẽ từ từ qua erlen E, cứ để như vậy cho đến khi ở E có khoảng 5ml nước. Ngắt điện ở bình A, hơi nước trong máy sẽ nguội lại,làm giảm áp xuất ở A và B do đó nước trong bình B sẽ rút qua G. khi nước rút hết, thêm nước vào phiễu C và mở van 2 cho nước chảy vào B, kế đó nước sẽ rút qua G. ta có thể làm như vậy vài lần. Nếu nước ở bình G đầy thì mở van 3 cho nước rút đi. Khóa van 3 và 2 lại. Cất đạm: lấy vào erlen E (erlen 250ml) 10 - 20ml dung dịch H2SO4 0,01N và 3 giọt thuốc thử mêtyl đỏ, dung dịch có màu tím đỏ. Đặt bình hứng sao cho đầu mút của ốngsinh hàn D ngập trong dung dịch H2SO4 0,01N của erlen E Hút 10ml dung dịch đã vô cơ hóa và đã pha loãng cho lên phiễu C. đun sôi bình A, mở van 2 để dung dịch này chảy từ từ xuống B, đóng van 2 lại. Đổ nước cất vào và tráng C, cũng mở van 2 thật nhẹ nhàng để nước chảy từ từ xuống B từng Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 10 giọt cho đến khi mực nước trong C xuống gần sát tới van 2 thì khóa van 2 lại. Rửa C một lần nữa với thao tác tương tự như trên. Thêm vào phiễu C 10ml NaOH đậm đặc. Mở van 2 từ từ để cho NaOH chảy xuống C từng giọt một. Nếu nước trong B trào mạnh quá thì khóa van 2 lại, rồi tiếp tục cho chảy từ từ đến khi NaOH chảy gần hết xuống B. Tráng phiễu C hai lần với một ít nước cất, chỉ cho nước chảy xuống gần sát tới kẹp 2 mà thôi. Quá trình kết thúc sau khoảng 25 phút sau đó hạ erlen E xuống sao cho đầu mút của ống sinh hàn nằm rong không khí, đun tiếp 3 phút nữa. Rửa đầu nhọn của ống làm lạnh D bằng một tia nước của bình xịt. Lấy erlen E ra rồi rửa lại máy vài lần như trên rồi chuẩn độ lượng H2SO4 thừa bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,01N.  Bước 3: chuẩn độ Lượng H2SO4 còn dư trong bình E được chuẩn độ bằng NaOH 0,01N. quá trình chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ đỏ sang màu nhạt. Xác định hệ số hiệu chỉnh x: lấy 3 erlen cho vào mỗi erlen 20ml H2SO4 0,01N và vài giọt đỏ metyl. Sau đó chuẩn độ bởi NaOH 0,01N lấy giá trị trung bình của 3 lần chuẩn độ Tính kếát quảû: Hệ số hiện chỉnh x sẽ được tính theo công thức sau: x là tỉ số giữa thể tích H2SO4 0,01N và thể tích NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ. Hay là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ tinh toán cuả NaOH. Hàm lượng nitơ trong mẫu đượctinh1 theo công thức: X=  0 1 * *0,0014*100*100 10* v v x m  Trong đó: X: % khối lượng nitơ trong mẫu Vo: số ml H2SO4 đem hấp thụ NH3 V1: số ml NaOH 0,01N tiêu tốn khi khi chuẩn độ H2SO4 thừa Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 11 m: khối lượng mẫu đem vô cơ hóa 0,0014: lượng gam nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N Nếu là mẫu lỏng: N/l=   41 1000 14* * *10 *o m v v x v  Trong đó: Vm là thể tích mẫu *Ghi chú: Nếu chuẩn độ trực tiếp với hệ chuẩn H2SO4 – H3BO3 Sử dụng hệ chuẩn H2SO4 – H3BO3 để xác định hàm lượng nitơ tiện lợi và tránh được những sai số về sự thay đổi nồng độ đương lượng của kiềm hoặc không khí. Cách tiến hành:  Nguyên liệu và hóa chất: H3BO3 2%, thuốc thử Tarshiro, H2SO4 0,01N, các hóa chất dùng cho việc vô cơ hóa mẫu và cất đạm. Cho vào bình hứng 2ml H3BO3 2%, thêm một ít nước cất sao cho dd H3BO3 ngập đầu mút của ống sinh hàn. Trong bình hứng, dd H3BO3 tự phân li: H3BO3  HBO2 + H2O Khi cất đạm NH3 bị kiềm đẩy khỏi (NH4)2SO4 theo hệ thống sinh hàn vào bình hứng, phản ứng với HBO2 : NH4OH + HBO2  NH4 + + BO2 - + H2O BO2 - là một bazơ mạnh làm dd của bình hứng chuyển từ màu tím đỏ sang màu xanh lá mạ. Lượng BO2 - được tạo thành tương đương lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2 - bằng cách độ ngược với H2SO4 0,01N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ. BO2 - + H +  HBO2 Tính kết quả: Hàm lượng N%(mg N trong 100g mẫu) sẽ được tính theo công thức sau: Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 12 *0,14 *100 (%) * t m V V N V m  Trong đó: Vt – lượng H2SO4 0,01N để chuẩn độ BO2 - (ml) V – số mol dd mẫu pha loãng (100ml). Vm – số ml dd mẫu cất đạm. m – trọng lượng mẫu đem vô cơ hóa (mg). 0,14 – số mg N tương đương 1ml H2SO4 0,01N. 1.2. Định lượïng nitơ phi Protein: Nguyêân tắéc: Dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng nitơ phi Protein. Tuy nhiên trong dịch chiết vẫn còn lẫn một vài loại Protein. Vì vậy cần dùng các chất kết tủa để tách riêng phần Protein hòa tan trong quá trình chiết rút. Kết tủa Protein có thể tiến hành theo nhiều cách như: Aceton, muối kim loại nặng, acid, thẩm tích đối nước … Nhưng thông dụng nhất là dùng các chất kết tủa sau: TCA 10 – 20% (acidtricloacetic), Pb(CH3COO)2 10 – 15%, CuSO4 10% trong hổn hộp với NaOH 10% với tỉ lệ 1:1. Lọc kết tủa Protein, rửa kết tủa nhiều lần ta được dung dịch phi Protein. Vô cơ hóa dung dịch, cất đạm… tương tự định lượng nitơ tổng số. Cáùch tiếán hàønh: Nguyên liệu: các mẫu cần được xác định hàm lượng phi Protein Hóa chất: cồn 70 o và các chất cần cho việc định lượng Protein theo phương pháp Kjeldahl. Cân chính xác 5 – 10g mẫu nguyên liệu đã nghiền nhuyễn, cho vào cối sứ hay thủy tinh, nghiền lẫn với etanol 70 o (tỉ lệ thể tích : nguyên liệu là 1:4 nếu mẫu tươi và 1:8 nếu mẫu khô). Nghiền trong 20 phút, sau đó để ngâm khoảng 40 – 80 Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 13 phút và khuấy liên tục. Lọc tách bã hay ly tâm 5000 vòng/phút, sau đó đổ phần bã vào một becher 250ml còn phần bã lấy ra cối chiết lại bằng cồn 70 o một lần nữa theo tỉ lệ 1:4 và nhiều lần bằng nước cất vô đạm cho đến khi nước chiết không còn phản ứng với thuốc thử ninhydrin. Dồn tất cả các dịch chiết lại và đem kết tủa Protein, sau đó đem lọc trong đó cặn chứa nitơ Protein, còn dịch lọc chứa nitơ phi Protein. Đem vô cơ hóa dịch lọc và tiến hành xác định hàm lượng ni tơ theo phương pháp Kjeldahl. 1.3. Định lượïng Protein trong nguyêân liệäu: Có thể tiến hành theo 2 cách sau: cách 1: xác định trực tiếp Xác định hàm lượng ni tơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl sau đó lấy kết quả nhân với 6,25. Protein = Nitơ Protein * 6,25 Cách 2: xác định gián tiếp Nitơ tổng số = Nitơ Protein + Nitơ phi Protein Ta xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl và nitơ phi Protein sau đó tính nitơ Protein. Nitơ Protein = Nitơ tổng số - Nitơ phi Protein  Protein = Nitơ Protein * 6,25 2. Định lượïng Protein bằèng phương pháùp so màøu 2.1. Định lượïng Protein theo phương pháùp Biure. Nguyêân tắéc: Dựa vào phản ứng tạo màu giữa Protein và Cu 2+ trong môi trường kiềm tạo phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540nm Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 14 Hình : Phản ứng Biure Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với lượng Cu và số lượng liên kết peptid trong chuỗi Polypeptid. Cáùch tiếán hàønh: Chuẩn bị nguyên liệu và hóa chất: dung dịch Albumin tiêu chuẩn 1% Chuẩn bị thuốc thử Biure: Cân chính xác 1,5g CuSO4 6g Tartrat Kilium và Natrium 500ml nước cất Cho vào bình lắc cho tan hoàn toàn và định mức đến 1000ml Lập đồ thị chuẩn: Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau: Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 15 STT Protein1%(ml) H2O(ml) Nồng độ Protein (mg/ml) Thuốc thử Biure (ml) OD 1 0,0 1,0 0 5 2 0,2 0,8 2 5 3 0,4 0,6 4 5 4 0,6 0,4 6 5 5 0,8 0,2 8 5 6 1,0 0,0 10 5 Bảng 3: lập đồ thị chuẩn nồng độ Protein Lắc đều các ống nghiệm và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Đem đo độ hấp thu của các ống ở bước sóng 540nm và ghi nhận mật độ quang. Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu. Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch nghiên cứu và 4ml thuốc thử Biure lắc đều và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem đo mật độ quang ở bước sóng 540nm. Ghi nhận mật độ quang. Tính toáùn: Lập đồ thị chuẩn của các ống nghiệm từ 26. Trị số mật độ quang của các ống nghiệm từ 26 bằng mật độ mật độ quang của các ống nghiệm từ 26 đã được đo ở trên trừ cho mật độ quang của ống 1. Sau đó lập đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn. Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trị số mật độ quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong mẫu suy ra lường Protein có trong mẫu thí nghiệm. Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 16 Độä nhạïy vàø khảû năêng ứùng dụïng: Phương pháp này nhạy hơn phương pháp Lowry nhưng không bằng phương pháp Bradford vì nó được sử dụng đối với mẫu nghiên cứu có khối lượng Protein tương đối lớn 20 – 2,000µg/ml. 2.2. Định lượïng Protein bằèng phương pháùp Lowry (Biure cảûi tiếán): Nguyêân tắéc: Dựa vào phản ứng màu của Protein và thuốc thử Folin. Phương pháp này sử dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thử Folin tác dụng lên gốc tyrosin, tryptophan, hystidin, để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 750nm và dựa vào đường chuẩn Protein để từ đó dịnh lượng hàm lượng Protein. Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ Protein. Hình : Phản ứng Lowry Tiếán hàønh Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất, thiết bị  Dung dịch Protein chuẩn có 10 – 100 µg Protein/1ml  Dung dịch nghiên cứu có 50 - 300 µg Protein/1ml Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 17  Dung dịch chuẩn: Albumin 0,1%, thường là huyết thanh bò (BSA – bovine serum albumin). Hóa chất : pha  Dung dịch A : Na2CO3 2% hòa trong NaOH 0,1N  Dung dịch B : CuSO4.5H2O 0,5% pha trong dung dịch natri citrat 1%  Dung dịch C : hỗn hợp dung dịch A và dung dịch B với tỉ lệ 49:1  Dung dịch Folin Cách pha dung dịch Folin: Pha trong bình cầu có V= 2l Cân 100g natri tungstat (natri wonframat (Na2WO4.2H2O) và 25g natri molypdate ( Na2MoO4.2H2O). Thêm vào đó 700ml nước cất và 50ml acid orto phosphoric 85% ( H3PO4) .Khuấy cho tan và thêm vào đó 100ml HCl đậm đặc và tinh khiết rồi tiếp tục khuấy. Đun sôi hỗn hợp có ống sinh hàn làm lạnh hồi lưu trong 10h. Sau khi đun hồi lưu thêm vào đó 150g lithium sulfat ( Li2SO4.H2O) tinh khiết. Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn rồi cho vào đó 5 – 10 ml nước Brom khuấy đều và đun sôi ở tủ hotte 15 phút để đuổi lượng Brom thừa. Dung dịch phải có màu vàng, nếu dung dịch có màu xanh thì phải xử lý với Brom lần thứ 2 sau khi làm nguội dung dịch ở nhiệt độ thường. Để vào bình định mức 1l và định mức đến vạch. Có thể lọc nếu dung dịch không trong. Đựng trong chai thủy tinh nút nhám có màu nâu, cất giữ ở nơi lạnh, sau 2 – 3 tháng, dung dịch chuyển sang màu xanh thì thêm vài giọt Brom và đun sôi 15 phút dung dịch lại có màu vàng trở lại. Trước khi dùng phải pha loãng thuốc thử bằng nước cất đến nồng độ 0,5N. Thiết bị : máy so màu quang điện. Tiến hành: Chuẩn bị mẫu thí nghiệm nghiên cứu: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch mẫu ,thêm vào ống nghiệm 4ml dung dịch C, lắc đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 0,5ml thuốc thử Folin, lắc đều và để yên trong 30 – 90 phút, lúc này dung dịch sẽ chuyển từ Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 18 màu vàng sang màu xanh. Sau đó đem đo độ hấp thu ở bước sóng 750nm và ghi nhận mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu Thực hiện tương tự với 1 ống đối chứng bằng cách thay 1ml dung dịch mẫu bằng 1ml nước cất. Lập đồ thị chuẩn Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau: Oáng số Protein 0,1% (ml) Nước cất (ml) Nồng độ Protein (mg/ml) Dung dịch C (ml) Thuốc thử Folin (ml) OD 1 0,0 10 0 2 0,5 2 0,5 9,5 50 2 0,5 3 1,0 9,0 100 2 0,5 4 1,5 8,5 150 2 0,5 5 2,0 8,0 200 2 0,5 6 2,5 7,5 250 2 0,5 Bảng 1: lập đồ thị nồng độ Protein Trình tự và thao tác tương tự như phần dung dịch thí nghiệm. Sau đó đem đo độ hấp thu của các ống ở bước sóng 750nm. Từ đó xây dựng đồ thị chuẩn. Tính toáùn: Từ bảng trên khi lập đồá thị thì ta lấy trị số mật độ quang các ống từ 2 – 6 trừ đi mật độ quang của ống 1. Đó chính là độ hấp thu thực sự của dung dịch Protein chuẩn, từ đó ta lập đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn. Với trục hoành là nồng độ Protein và trục tung là mật độ quang. Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trị số mật độ quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong mẫu suy ra lường Protein có trong mẫu thí nghiệm. Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 19 Độä nhạïy vàø khảû năêng ứùng dụïng: Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác định dung dịch mẫu chứa vài chục µg Protein thường nhạy cảm trong khoảng từ 5 – 2,000mg Protein. Tuy nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các Protein không chứa acid amin vòng thơm như gelatin, đối với những hợp chất có chứa ion kali thì tạo kết tủa ảnh hưởng đến kết quả. 2.3. Định lượïng Protein theo phương pháùp Bradford (Coomassie Brilliant Blue G - 250): Nguyêân tắéc: Dựa phản ứng màu của Protein với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G - 250) và cả khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. Trong môi trường axit Coomassie Brilliant Blue G - 250 liên kết chặt chẽ với Protein, tương tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử Protein làm dung dịch có màu xanh. Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ Protein trong dung dịch. Dựa vào đường chuẩn của Protein suy ra hàm lượng Protein trong mẫu. Phản ứng cho màu Coomassie Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 20 Tiếán hàønh: Hóa chất: Chuẩn bị dung dịch mẫu Protein cần xác định. Dung dịch Albumin chuẩn 1mg/ml Cách pha dung dịch Albumin: Cân chính xác 10mg Albumin pha trong 1ml nước cất lắc đều cho tan hết và giữ ở 20 o C. Khi dùng pha loãng 100 lần để được dung dịch Albumin 0,1mg/ml. Pha thuốc thử Bradford: Cân 0,001g Coomassie Brilliant Blue và 4,7g Ethanol 99 o và 8,5g Acid Phosphoric 85%, định mức tới 100ml bằng nước cất. Đựng trong chai có nút đậy kín. Thiết bị: máy đo màu quang điện. Tiến hành: Lập đồ thị chuẩn: Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau: Oáng số Dung dịch Albumin 0.1mg/ml (ml) Nước cất (ml) Nồng độ Albumin (µg) Thuốc thử Bradford (ml) 1 0 1 0 5 2 0,1 0,9 10 5 3 0,2 0,8 20 5 4 0,3 0,7 30 5 5 0,4 0,6 40 5 6 0,5 0,5 50 5 Bảng 2: lập đồ thị chuẩn dung dịch Albumin Lắc điều và để yên một lúc sau đó đem đo độ hấp thu của các ống ở bước sóng 595nm. Từ đó xây dựng đồ thị chuẩn. Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 21 Chuẩn bị ống thí nghiệm: Ống thí nghiệm: 0,1ml dd Protein + 5ml dd Bradford Ống đối chứng: 0,1ml nước cất + 5ml dd Bradford (Có thể thay nước cất bằng NaCl 0,15M) Đem đo độ hấp thu ở bước sóng 595nm và ghi nhận mật độ quang (mật độ quang phải nằm trong khoảng của đường chuẩn). Tính toáùn. Từ bảng trên thì ống 1 là ống đối chứng ,vì vậy khi lập đồá thị thì ta lấy trị số mật độ quang các ống từ 2 – 6 trừ đi mật độ quang của ống 1. Đó chính là độ hấp thu thực sự của dung dịch Protein chuẩn,từ đó ta lập đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn. Với trục hoành là nồng độ Protein và trục tung là mật độ quang. Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trị số mật độ quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong mẫu suy ra lượng Protein có trong mẫu thí nghiệm. Độä nhạïy vàø khảû năêng ứùng dụïng Phương pháp này dùng cho Protein tan trong nước, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng. Phương pháp này nhạy hơn 2-3 lần so với phương pháp Lowry, nhanh và đơn giản hơn nhiều vì nó cho phép xác định tới vài µg protein/ml. đồng thời làm giảm ảnh hưởng của muối, đệm, các chất khử…Tuy nhiên phương pháp này không dùng với những chất có chứa surfactants vì gây ra kết tủa của các chất phản ứng. Những chất có tính kiềm mạnh làm tăng mật độ quang gây sai lệch kết quả. Màu Coomassie làm bẩn cuvet thạch anh nên chỉ dùng cuvet thủy tinh để đo mật độ quang. Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 22 3. Định lượïng Protein bằèng phương pháùp dùøng Bicinchoninic Acid (BCA): 3.1. Nguyêân tắéc: Dựa vào phản ứng giữa Protein và thuốc thử BCA trong môi trường kiềm tạo màu đỏ tía (tím), có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 562nm. Hình : Phản ứng cho axit bincinchoninic (BCA) Đầu tiên Protein sẽ khử Cu 2+ thành Cu + và tạo thành phức có màu xanh trong môi trường kiềm. Sau đó hai phân tử BCA sẽ kết hợp với Cu + được tạo ra ở trên cho màu đỏ tía (tím) và có độ hấp thu ở bước sóng 562nm. 3.2. Cáùch tiếán hàønh: Cách tiến hành cũng tương tự phương pháp Biure nhưng chỉ thay thuốc thử Biure thành thuốc thử BCA. 3.3. Tính kếát quảû: Cách tính kết quả cũng tương tự phương pháp Biure. 3.4. Độä nhạïy vàø khảû năêng ứùng dụïng: Phương pháp này nhạy gấp 100 lần so với phương pháp Biure. Nó phát hiện Protein tương đối lớn 20 – 2,000µg. Nhưng đối với những tạp chất có hàm lượng Cu Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 23 dù ít cũng bắt màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết quả và những hợp chất hữu cơ trong phân tử có các aminoacid, Cystine, Cystein, Tyrosine, Tryptophan cũng bắt màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết quả. 4. Định lượïng Protein bằèng phương pháùp quang phổå 4.1. Nguyêân tắéc: Dựa vào sự hấp thụ tia cực tím ở bước sóng 280nm của Protein. Các Protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm do các acidamin Tryptophan, Tyrosin và một phần là Phenylalanin. Sự hấp thu ở bước sóng 280nm của chúng cũng thay đổi tùy loại Protein nhưng hệ số tắc đo được cho mỗi Protein cho phép tính nồng độ của Protein tinh sạch (hệ số tắc là độ hấp thụ của dd Protein 1% với đường truyền sóng qua 1cm). Protein Hệ số tắt Protein Hệ số tắt Protein Hệ số tắt IgG 13,6 Chuỗi γ 13,7 Oncanavalin A 120 IgM 11,8 Chuỗi µ 13,9 Lactin Lens Calinaris 12.5 IgA 13,2 Chuỗi  12,3 BSA 6.7 IgD 15,3 Chuỗi nhẹ 12,3 Bảng 3: Hệ số tắt của các loại Protein liên quan với hệ miễn dịch ở bước sóng 280nm 4.2. Cáùch tiếán hàønh: Nguyên liệu: Dung dịch Protein để đo, đệm hòa tan Protein Thiết bị: Máy đo quang phổ UV có Cuvet thạch anh đường truyền sóng là 1cm Quá trình gồm các bước sau: Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 24 Bước 1: Ly tâm mẫu để loại bỏ các phân tử hoặc phức hợp khác có trong thể huyền phù. Lấy dịch nổi để xác định mật độ quang học. Bước 2: Chỉnh máy quang phổ ở bước sóng 280nm và điều chỉnh độ hấp thụ về 0 với cuvet chứa đệm. Bước 3: Đo mẫu và đọc độ hấp thụ của mẫu. Nếu giá trị thu được > 2,0 thì pha loãng mẫu (1/5 hoặc 1/10) hoặc đường sáng truyền ngắn hơn (2mm) cho đến khi số đọc được nằm trong khoảng 0,5 đến 1,5. Bước 4: Lặp lại bước 2 và 3 ở bước sóng 260nm. Bước 5: Tính tỉ số hấp thụ 260nm/280nm. Tỉ số này nên nhỏ hơn 0,6. Nếu lớn hơn 0,6 thì Protein không sạch có lẫn các tạp chất khác đặc biệt với acid nucleic. 4.3. Tính kếát quảû: Nồng độ Protein = độ hấp thụ ở 280nm hệ số tắt ở 280nm Với một hỗn hợp các Protein hoặc với bất kỳ một loại Protein nào mà không biết hệ số tắc thì tính như sau: Nồng độ Protein = (1,55 x Độ hấp thụ ở 280nm) – (0,77 x Độ hấp thụ ở 260nm) Đơn vị: mg/ml Có thể phỏng đoán lượng acid nucleic dựa vào (độ hấp thu ở 280nm/độ hấp thu ở 260nm). 4.4. Độä nhạïy vàø khảû năêng ứùng dụïng: Đây là phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ Protein trong dung dịch. Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ Protein thấp (dưới 0,05- 0,1 mg/ml) hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng vùng cực tím (ví dụ: đệm, acid nucleic và một số chất béo) hoặc khi Protein ở trong dung dịch huyền phù. Các phương pháp định lượng protein. GVHD: TS. Trần Thị Bích Lam 25 So với phương pháp so màu thì phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn, mẫu dùng lại thường ổn định hóa phần lớn Protein. 5. Phương pháùp huỳønh quang O-Phthalaldehyde (OPA): 5.1. Nguyêân tắéc: Dựa vào phản ứng giữa