Đề tài Các phương pháp phát hiện EColi trong thực phẩm

yptone Soya Agar (TSA) và môi trường Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh, đun chảy và làm nguội ở nhiệt độ 450C trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng. Môi trường canh Escherichia coli broth (EC Broth) được phân phối 10ml trong mỗi ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng để nguội và kiểm tra không có sự hiện diện của bọt khí trong ống Durham. Các ống EC này được bảo quản ở 2 – 80C. Môi trường canh Lactose Tryptone Lautyl Sulphate Broth (LST Broth) được chuẩn bị tương tự môi trường canh EC. Môi trường canh Tryptone Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng. Môi trường canh MR-VP Broth được phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm, hấp khử trùng, để nguội và bảo quản ở 2-80C cho đến khi sử dụng. Môi trường thạch Simmon Citrate được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng có màu xanh lục. Thuốc thử Kovac’s. Quy trình phân tích Mẫu được đồng nhất hóa bằng cách đối với mẫu rắn xay nhuyễn mẫu trong điều kiện vô trùng rồi cân chính xác 10g (hoặc 25g), đối với mẫu lỏng hút 10ml (hoặc 25ml), bổ sung vào trong bình tam giác chứa 90ml (hay 225ml) nước SPW đã được hấp khử trùng. Lắc đều trong một thời gian nhất định (ít nhất là 2 phút đối với mẫu rắn). Sau khi được làm đồng nhất bằng cách trên, dung dịch mẫu thu được có độ pha loãng là 10-1 so với ban đầu. Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng. Dung dịch này có độ pha loãng 10-2, sau đó tiếp tục chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ hai chứa 9ml dung dịch pha loăng ta sẽ thu được dịch mẫu có độ pha loãng 10-3. Tiếp tục thực hiện để được các độ pha loãng thập phân tiếp theo sao cho chứa <100 tế bào E.coli trong 1ml dung dịch pha loãng. Chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri. Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt 450C. Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần để trộn dịch mẫu với môi trường. Để nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổng thương. Bổ sung vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 450C trên môi trường TSA. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 ± 10C trong 24 – 48 giờ. Thực hiện tương tự trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp sao cho mỗi đĩa xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỗi nồng độ pha loãng. Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa muối mật, đường kính ≥ 0,5 mm), dung que cấy vòng chuyền sang môi trường canh EC, ủ ở 44 ± 0,50C trong 24 giờ. Chọn các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) và dung que cấy vòng chuyền sang các môi trường sau: canh Tryptone, canh MR-VP, thạch Simmon Citrate. Ủ các môi trường trên ở 44 ± 0,50C trong 24 giờ Thử nghiệm Indol, Methyl Read, Voges Proskauer, Citrate. Ghi nhận khuẩn lạc cho thử nghiệm khẳng định E.coli (+) ( IMViC là + + - -). Cách tính kết quả Dựa vào số khuẩn lạc đếm được và tỷ lệ khẳng định, tính mật độ của E.coli theo công thức sau: A (CFU/mg hay CFU/ml) = x R N: tổng số khuẩn lạc đếm được ni: số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng V: dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm R: tỷ lệ khẳng định Phương pháp làm giàu vi khuẩn 3.1 Nguyên lý Phương pháp này dựa vào làm giàu vi khuẩn trước trong canh thang dinh dưỡng và MacConkey, rồi làm giàu trong canh thang LST và EE sau đó ria lên thạch L-EMB. Những khuẩn lạc khả nghi được kiểm tra về đặc tính sinh hóa và huyết thanh của EEC. 3.2 Thiết bị và đồ thủy tinh Chậu nước 440C và 41,50C Tủ ấm 350C Máy pha trộn Ống nghiệm, pipet, đĩa Petri 3.3 Môi trường và thuốc thử Môi trường lên men (carbohydrate fermentation medium) (mt 46) Thạch L-EMB (Levine’s methylene blue agar) (mt 76) Canh thang EE (Enteric enrichement broth) (mt 14) Môi trường indole và thuốc thử (mt 44, mt 98) Canh thang LST (Lauryl sulphate tryptose broth) (mt28) Thạch MacConkey (mt 80) Canh thang MacConkey (mt 17) Canh thang nitrate (Nitrate broth) (mt 19) Canh thang dinh dưỡng (Nutrient broth) (mt 6) Canh thang KCN (Potassium cyanide broth) (mt 3) Thạch TSI (Triple sugar iron agar) (mt 86) Canh thang urê (các thành phần là thạch urê nhưng không có agar) (mt 93) Môi trường V.P (Voges Proskauer medium) (mt 54) Kháng huyết thanh E.Coli 3.4 Cách làm Chuẩn bị mẫu: Cân 25g mẫu bằng thao tác vô khuẩn rồi cho vào 225ml canh thang MacConkey và 225ml canh thang dinh dưỡng trong blender vô khuẩn và làm đồng nhất trong 30 giây (1:10) Ria thẳng Ria từ canh thang dinh dưỡng đồng nhất lên thạch L-EMB, thạch MacConkey. Ủ ấm 350C trong 24h. Làm giàu vi khuẩn : ủ ấm canh thang MacConkey ở 350C trong 20h , chuyển một quai cấy sang 30ml canh thang LST. Ủ ấm 440C trong 20h. Ủ ấm canh thang dinh dưỡng 350C trong 6h, Chuyển một quai cấy sang 30ml canh thang EE. Ủ ấm 41,50C trong 18h. Xét nghiệm sơ bộ về huyết thanh : Trung hòa canh thang LST và EE với 10% NaHCO3, nhỏ một giọt canh thang của mỗi thứ lên trên phiến kính sạch và cho thêm một giọt huyết thanh đa giá OB và một giọt nước muối 0,5%. Trộn các giọt trên và xem ngưng kết. Xác nhận tính chất sinh vật hóa học : Ria từ canh thang LST dương tính lên thạch L-EMB và EE dương tính lên thạch MacConkey và thạch L-EMB. Ủ ấm ở 350C trong 24h. 5.1 Chọn những khuẩn lạc điển hình và cấy vào môi trường TSI, VP, indole, urease, KCN, citrate và adonitol. Đồng thời cấy lên mặt thạch nghiêng PCA cùng một khuẩn lạc dùng để kiểm tra huyết thanh. Đặc tính sinh vật hóa học của E.Coli TSI + acid (H2S) V.P. + Indole - Urease + KCN - Adonitol - Cytochrome oxidase - 5.2 Nhận diện huyết thanh E.Coli gây bệnh đường ruột Thạch EMB Thạch Eosin methylene thạch màu xanh, có chứa thuốc nhuộm eosin và xanh methylene. EMB agar chọn lọc bởi vì thuốc nhuộm anilin trong phương tiện truyền thông tím ức chế sự phát triển của sinh vật Gram dương. Lactose men chuyển hóa đường lactose trong các phương tiện truyền thông và sản xuất các sản phẩm phụ axit, gây ra một sự thay đổi màu sắc trên môi trường. Vì vậy, EMB cũng là một phương tiện khác biệt . Sản xuất axit mạnh mẽ bởi các sinh vật như E.coli kết quả trong một ánh xanh kim loại. Yếu hơn quá trình lên men kết quả lactose trong môi trường với một màu hơi hồng tím . Thuộc địa của men nonlactose vẫn không màu, hoặc ít nhất không đậm hơn so với màu sắc của các phương tiện truyền thông Hình 2.1: Khuẩn lạc E.coli trên môi trường thạch EMB (1) (2) Hình 2.3: Thử nghiệm Indole Ống 1: E.coli cho kết quả dương tính Ống 2: E.coli cho kết quả âm tính Hình 2.2: E.coli cấy trên môi trường TSI Ống a: E.coli (+) Ống b: E.coli (-) (a) (b) ư (B) (A) Hình 2.5: Thử nghiệm Cytochrome oxidase với vi khuẩn E.coli Cho kết quả (-) Cho kết quả (+) (2) (1) Hình 2.4: Thử nghiệm Urease (1): E.coli (-) ; (2): E.coli (+) (b) (a) Hình 2.6: Thử nghiệm VP (a): E.coli (+); (b): E.coli (-) Hình 2.7: Thử nghiệm MR (a): E.coli (+); (b): E.coli (-) Hình2.8. : Thử nghiệm Citrate với vi khuẩn E.coli (a): E.coli (+) (b): E.coli (-) Phương pháp hiện đại 1. Phương pháp PCR (polymerase Chain Reaction) 1.1 Nguyên tắc Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. 1.2 Môi trường tăng sinh Do số lượng E.coli nhóm STEC, đặc biệt là E.coli gây bệnh hiện diện trong thực phẩm rất ít, cho nên trước khi phân lập cần sử dụng môi trường tăng sinh pepton đệm có bổ sung kháng sinh cefiximw (0,0125mg/l) và vancomycin (8mg/l) để ức chế các vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn sống hoại sinh khác. 1.3 Môi trường phân lập Môi trường phân lập là môi trường MacConkey (MAC), Sorbitol MacConkey (SMAC), Sorbitol MacConkey (CT-SMAC) có bổ sung kháng sinh cefixime (0,05mg/l) và tellurite (2,5mg/l). Khoảng 90% E.coli đều lên men đường lactose, trên môi trường MAC, E.coli điển hình có khuẩn lạc màu đỏ, trên môi trường SMAC và CT-SMAC, E.coli không lên men đường sorbitol nên cho khuẩn lạc màu trắng, những dòng E.coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng. Trên từng loại môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC chọn ngẫu nhiên 6-10 khuẩn lạc rời rạc đại diện cho mỗi nhóm hình thái, cấy từng khuẩn lạc được chọn vào từng ống thạch nghiêng NA. Làm thử nghiệm sinh hóa IMViC cho từng khuẩn lac riêng lẻ thuộc nhóm đó để xác định E.coli. 1.4 Trích ly DNA Việc trích ly DNA được thực hiện như sau: thu khoảng 6-10 khhuẩn lạc E.coli trên môi trường thạch (MAC hoặc SMAC, hoặc CT-SMAC) cho vào eppendorf đựng sẵn 0,4-0,5 ml nước cất hai lần vô trùng, đun sôi 10 phút, lấy ra và chuyển vào tủ âm -700C giữ trong 10 phút. Sau khi rã đông hoàn toàn, ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Để yên và hút phần dung dịch ở phía trên làm DNA khuôn mẫu (DNA xét nghiệm). Mẫu Pepton (vancomycin, cefixime) (370C/24 giờ) MAC (370C/24 giờ) SMAC (370C/24 giờ) CT-SMAC (370C/24 giờ) Chọn 6-10 khuẩn lạc đỏ hồng Chọn 6-10 khuẩn lạc theo từng nhóm riêng: trắng hoặc đỏ hoặc cả hai Cấy từng khuẩn lạc được chọn vào từng ống thạch nghiêng NA (370C/24 giờ) Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc đã chọn theo từng nhóm riêng và mỗi nhóm cho vào eppendorf chứa sẵn 0,4-0,5 ml H2O cất khử ion 2 lần Thử IMViC (+ + - -) Ly trích DNA (DNA nhóm khuẩn lạc) Ly trích DNA riêng theo từng ống NA (+) (-) Multiplex-PCR Loại bỏ ống NA đã giữ Multiplex-PCR Sơ đồ 1: Qui trình phân lập, định tính và phát hiện gen độc lực E. coli 1.5 Qui trình multiplex-PCR 1.5.1 Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong Multiplex-PCR Mồi (primer) Trình tự oligonucleotide (5’3’) Kích cỡ DNA được khuếch đại (bp) Eae-F Eae-R EhxA-F EhxA-R Stx1-F Stx1-R Stx2-F Stx2-R Uid-F Uid-R ATTACCATCCACACAGACGGT ACAGCGTGGTTGGATCAACCT GTTTATTCTGGGGCAGGCTC CTTCACGTCACCATACATAT CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG CACCAGACAATGTAACCGCTG ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG GCGTCATCGTATACACAGGAGC GCGAAAACTGTGGAATTGGG TGATGCTCCATCACTTCCTG 397 158 348 584 252 1.5.2. Các thành phần của phản ứng PCR: Mỗi phản ứng là 25µl, gồm các thành phần sau : PCR buffer 1,1 X; MgCl2 3mM; mỗi dNTP 200µM; mỗi loại primer 7,5 pmol; Taq 2,5 µl; DNA 2µl; và nước cất vừa đủ 25µl. 1.5.3. Chu kỳ nhiệt Tiền biến tính 950C/5 phút Biến tính 940C/1 phút Ủ bắt cặp 610C/1 phút Kéo dài 720C/1 phút kéo dài chuỗi 720C/7 phút Điện di, đọc kết quả Lấy 10µl sản phẩm PCR cùng với 2µl loading dye được điện di trên gel agarrose 1,6% trong TBE. Thang chuẩn (ladder) cũng được điện di đồng thời. thời gian điện di 30-35 phút ở 90V và 250 mA. Sau khi điện di, gel được ngâm trong dung dịch ethidium bromide khoảng 30 phút. Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV bằng máy chụp gel. Các sản phẩm PCR được xác định bằng cách so với các băng băng của đối chứng dương và thang ledder 100bp. 1.6. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp PCR — Ưu điểm: Thời gian cho kết quả nhanh Có thể phát hiện được nhưng vi sinh vật khó nuôi cấy. việc tăng sinh là đơi giản hơn và đôi khi không cần thiết Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học. không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường. Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. — Nhược điểm: Sự ức chế Taq DNA polymerase bởi thành phần của mẫu vật do mẫu thực phẩm thường có những thành phần phức tạp. Tuy nhiên, việc chiết tách và tinh chế DNA từ thực phẩm hay môi trường khi thực hiện phương pháp PCR thường cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế. Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên trong đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có được mật độ đủ để phát hiện bằng PCR. Phương pháp này không phân biệt được tế báo sống với tế bào chết, do vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc. 2. Phương pháp ELISA 2.1 Nguyên tắc Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate). Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline phosphate. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các phản ứng có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên. Kháng nguyên (Antigen) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Kháng nguyên bao gồm protein lạ, axit nucleic, một số lipit và poli saccarit. Cấu trúc kháng nguyên: E.coli có 3 cấu trúc kháng nguyên với tên gọi là O ( kháng nguyên thân), K (Kháng nguyên bề mặt) và H (kháng nguyên lông). Kháng thể ( Antibody ) là protein ﻹ - globulin được sinh ra bởi tế bào lympo tham gia phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên Hình2.9: Đĩa giếng (microplate) Đĩa giếng ( microplate) là một tấm phẳng với nhiều "giếng" được sử dụng như ống nghiệm nhỏ. Microplate đã trở thành một công cụ tiêu chuẩn trong nghiên cứu phân tích và phòng thí nghiệm thử nghiệm lâm sàng chẩn đoán. Một sử dụng rất phổ biến trong các khảo nghiệm miễn dịch liên kết enzyme ( ELISA), các cơ sở xét nghiệm chẩn đoán y tế hiện đại nhất ở người và động vật. Elisa đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hóa chất (kit). Elisa có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106CFU/ml(một số báo cáo cho rằng giới hạn này có thể đạt được 104) Các phương pháp Elisa : 2.2.1 Nguyên tắc Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate). Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme như horseradish peroxidase hay alkaline phosphate. Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các phản ứng có màu hay phát sáng. Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên. Kháng nguyên ( Antigen ) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu với chúng gây ra phản ứng miễn dịch đặc hiệu. Kháng nguyên bao gốm protein lạ, axit nucleic, một số lipit và poli saccarit. Cấu trúc kháng nguyên: E.coli có 3 cấu trúc kháng nguyên với tên gọi là O ( kháng nguyên thân), K (Kháng nguyên bề mặt) và H (kháng nguyên lông). Kháng thể ( Antibody ) là protein ﻹ - globulin được sinh ra bởi tế lympo tham gia phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên Elisa đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng các bộ hóa chất (kit). Elisa có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng 106CFU/ml(một số báo cáo cho rằng giới hạn này có thể đạt được 104). 2.2.2 Các phương pháp Elisa : 2.2.2.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm các bước chính: - Chuyển KN đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). KN sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết. - Chuyển các mẫu KN chưa biết vào các giếng khác. KN chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn. - Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa. - Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. KT sẽ kết hợp với các KN đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh. - Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một KT còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện KN đã gắn với enzyme). - Rửa đĩa, các kháng thể gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ. - Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại). Nhược điểm cơ bản: Bước cố định KN không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy KN (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của điwax. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này. 2.2.2.2 Sandwich ELISA: Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp): (1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT (2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt. (3) Phủ mẫu chứa kháng KN cần xác định (4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi (5) Thêm các KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán (6) Thêm KT thứ cấp đã được gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp ở bước 5) (7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi. (8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện. (9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng KT. Hình 2.10: Các bước tiến hành trong Sanwich ELISA Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng KT (2) Thêm mẫu cần xác định KN. KN (nếu có) sẽ gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme. KT thứ cấp sẽ gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được. 2.2.2.3. ELISA cạnh tranh: (1) "Ủ" KT không được đánh dấu với KN. (2) Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa KN. (3) Rửa đĩa, KT không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng KN càng lớn, lượng KT gắn thành công với KN trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh". (4) Thêm KT thứ cấp (KT của KT ở bước 1). KT thứ cấp gắn với enzym. (5) Thêm cơ chất. Lượng enzym còn dư sẽ giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu. Trong phương pháp này, hàm lượng KN gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu. Một số trường hợp, enzym được gắn với KN chứ không phải KT. 2.3. Phát hiện E.coli O157:H7 bằng phương pháp Elisa: 2.3.1. Phản ứng Elisa gián tiếp: a. Nguyên liệu: Microplate Kháng nguyên chuẩn, huyết thanh thỏ,conjugate (chất gắn kết) có gắn enzym peroxidase, bubtrate (chất tạo màu phản ứng, thường là TMBZ (3,3’ 5,5’ tetramethybenzodine)), PBS,PBS-Tween, Sữa tách bơ(casein). Máy đọc phản ứng. b. Trình tự phản ứng: Bước 1. Phủ kháng nguyên 100µl kháng nguyên pha loãng ở nồng độ thích hợp được gắn trưc tiếp vào đĩa microplate. Thời gian ủ kháng nguyên thường là qua đêm ở nhiệt độ 4oC hoặc 37oC trong 2h. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 3 lần, và đập khô. Bước 2. Phủ đĩa bằng 200µl dung dịch sữa tách bơ 5% mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37oC sau 1 giờ. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 3 lần, và đập khô. Bước 3. Gắn kháng thể : 100µl huyết thanh pha loãng ở nồng độ thích hợp bằng dung dịch PBS-sữa tách bơ 5%. Kháng thể ủ trong đĩa ở nhiệt độ 37oC, lắc sau 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 3 lần, và đập khô. Bước 4. Kháng thể đặc hiệu loài : 100µl conjugate pha loãng bằng PBS với độ pha loãng là 10.000 lần, nhỏ mỗi giếng và ủ ở 37oC trong 30 phút. Đổ bỏ dung dịch có trong microplate. Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa 5 lần, và đập khô. Bước 5. Cơ chất tạo màu : 100µl TMB vào mỗi giếng, để nhiệt độ phòng 15 phút, phản ứng sẽ chuyển sang màu xanh lục nếu là dương tính. Dừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 1M, lúc này phàn ứng có màu vàng. Bước 6. Đọc đĩa trên máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng 450 nm. Kháng nguyên thu hoạch như trên, đươc đo nồng độ protein và giữa ở nhiệt độ -200C. 2.4 Ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong xác định E.coli O157:H7 E.coli O157:H7 có hai loại kháng ngyên có ý nghĩa trong chuẩn đoán là kháng nguyên O157 và H7. Vì vậy, kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các epitop của hai loại kháng nguyên này thường sử dụng để xác định vi khuẩn trong các hệ thống chuẩn đoán huyết thanh. Kháng thể đơn dòng đặc hiệu MAB 46E9-9 nhận biết đặc hiệu kháng nguyên lông H7 của loài E.coli . Kháng thể MAB 13C4 nhận biết theo hướng nhận biết kháng nguyên độc tố Stx1 của E.coli O157:H7. Ưu điểm của phương pháp Elisa Ưu điểm: Nhanh chóng và thuận tiện . Kháng nguyên của nồng độ rất thấp hoặc không biết có thể được phát hiện kể từ khi bắt giữ kháng thể chỉ lấy kháng nguyên cụ thể . Nhược điểm: Thời gian xét nghiệm lâu. Chỉ có các kháng thể đơn dòng có thể được sử dụng như cặp phù hợp. Kháng thể đơn dòng có thể chi phí nhiều hơn so với các kháng thể đa dòng. Enzyme / chất nền phản ứng trong microwells phải được đọc càng sớm càng tốt 3. Phát hiện E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang Trong số các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, E.coli O157:H7 được xem là rất nguy hiểm với liều gây độc thấp (10-100 tế bào). Người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện chúng như: đếm tế bào dưới kính hiển vi, đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch, miễn dịch học bằng enzym, đầu dò enzym, ELISA, kít chuẩn PCR. Phương pháp phát hiện E.coli O157:H7 trong thực phẩm mang tính pháp lý ở Việt Nam là sử dụng kỹ thuật làm giầu, xác định khuẩn lạc nghi ngờ E.coli O157:H7 trên đĩa thạch SMAC sau khi ủ ấm ở 37oC trong 24 giờ. Từ những khuẩn lạc nghi ngờ, tiến hành kiểm tra các tính chất sinh hóa và ngưng kết đặc hiệu để khẳng định là E.coli O157:H7. Tuy nhiên, tất cả các phương pháp nêu trên đều không thể phát hiện chính xác số lượng vi khuẩn ở nồng độ thấp. Để khắc phục nhược điểm nêu trên, người ta đã và đang ứng dụng các loại vật liệu nano phát quang như hạt silica chứa tâm màu hay chấm lượng tử QD chứa các nhóm chức năng sinh học trên bề mặt như một chất đánh dấu huỳnh quang để phát hiện nhanh và chính xác số lượng vi khuẩn gây bệnh thực phẩm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Khâu cốt lõi của kỹ thuật sử dụng hạt nano silica chứa tâm màu là việc chế tạo ra được phức hợp giữa kháng thể đặc hiệu vi khuẩn đích với hạt silica phát quang bền vững. Phức hợp hạt nano silica + kháng thể đặc hiệu có thể được tạo ra bởi nhiều cơ chế khác nhau, hiện nay có 5 cách để tạo ra phức hợp này là: gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine–carboxylic; sử dụng SMCC làm xúc tác tạo cặp sulfhydryl-amine; gắn kết trực tiếp thông qua các nhóm carbon-hydrate bị oxy hóa trên phần Fc của kháng thể; gắn kết các peptide được gắn histidine hoặc các kháng thể lên các chấm lượng tử được Ni-NIA hóa; gắn kết không hóa trị của hạt nano silica được bọc streptavidin với các kháng thể được biotin hóa biotinylated. Mỗi kiểu gắn kết có những ưu điểm và hạn chế riêng. Nhưng nhìn chung, càng nhiều cầu nối trung gian giữa kháng thể và hạt nano chứa tâm màu phát quang càng làm cho phức hợp bền vững hơn và kháng thể không mất hoạt tính lâu hơn. Sau khi tạo được phức hợp kháng thể đặc hiệu + hạt nano silica, tiến hành kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn đích. Có nhiều cách phát hiện vi khuẩn đích như: quan sát và đếm trực tiếp các tế bào vi khuẩn phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang; xác định số lượng vi khuẩn (VK) đích bằng đường chuẩn giữa cường độ phát quang của VK gắn hạt nano và số lượng VK trong dung dịch chuẩn. Cường độ phát huỳnh quang là hàm số f của số lượng tế bào vi khuẩn đích trong mẫu. Ở Việt Nam, các nhà khoa học đã chế tạo thành công công thức phức hợp kháng thể đặc hiệu vi khuẩn đích + hạt nano silica băng cách găn trực tiếp các phân tử kháng thể lên bề mặt hạt silica thông qua liên kết amine-carbonxylic với sự có mặt của chất xúc tác EDAC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride) trong các điều kiện sau: EDAC/1 phản ứng là 0,9mg; tỉ lệ kháng thể với hạt silica là 40/1; thơi gian phản ứng hợp sinh 3 giờ có lắc ngang , nhiệt độ ủ ở 300C. Phức hợp kháng thể và hạt silica được tạo thành này có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với vi khuẩn đích E. coli O157:H7 trong vòng 20 phút, tỉ lệ vi khuẩn đích gắn phức hợp và phát quang đạt > 60