Đề tài Các phương pháp tách chiết, định lượng và định tính Axit Nucleic

Các phương pháp tách chiết, định lượng và định tính axít nucleic Nguyªn t¾c: ChiÕt t¸ch ADN lµ cÇn thiÕt bëi c¸c thùc nghiÖm cña c«ng nghÖ gen ®Òu tiÕn hµnh víi ADN (hay ARN) ADN chiÕt t¸ch cÇn ®ảm bảo vÒ ®é tinh khiÕt vµ ®é nguyªn vÑn vÒ cÊu tróc víi ®é dµi tõ 50-100 kb ®Ó thùc hiÖn ®­îc c¸c kh©u nghiªn cøu tiÕp theo trong c«ng nghÖ gen thùc vËt. Tuú thuéc môc ®Ých nghiªn cøu mµ lùa chän ph­¬ng ph¸p chiÕt t¸ch ADN cho phï hîp 1.1. Các phương pháp tách chiết axít nucleic Mục tiêu: Thu nhận được các phân tử axít nucleic còn nguyên vẹn tối đa không bị đứt gãy bởi các tác nhân cơ học và hoá học. Tác nhân cơ học (bị đứt, gãy do nghiền, lắc mạnh). Tác nhân hoá học ( bị cắt đứt do enzyme nội bào như desoxyribonuclease – DNase và ribonuclease- RNase). 1.1.1. Phương pháp tách chiết DNA DNA có kích thước lớn do đó cần tránh các tách nhân gây đứt gãy. DNA genome (ĐV, TV) sau khi tách chiết phải có kích thước lớn (15kb-300kb). Phương pháp tách chiết cơ bản gồm 4 bước chính sau: Bước 1. Phá vở màng tế bào và màng nhân. Ở tế bào ĐV hoặc TV, bằng cách nghiền tế bào hoặc mô trong nitơ lỏng – 1960C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarcosyl) và proteinase K. Bước 2. Loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu, như các protein, polysaccharide. Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol: chloroform: isoamine tỉ lệ 25:24:1), lắc mạnh cho đến khi dung dịch có dạng trắng sữa. Protein sẽ bị biến tính và kết tủa DNA, RNA được hoà tan trong nước. Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha: + Pha trên cùng là pha nước chứa DNA, RNA. + Pha giữa là pha chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa. + Phá dưới là dung dịch phenol: chloroform: isoamine Bước 3. Tủa axít nucleic + Tủa bằng ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở - 20oC trong 30 phút hoặc ở 0oC qua đêm. Hầu như toàn bộ các phân tử axít nucleic đều kết tủa. + Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1) ở 0oC, các phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa. >>> Sau đó ly tâm ta sẽ thu được cặn (DNA, RNA), cặn được rửa bằng cồn 70% để loại bỏ muối và isopropanol còn lại. Bước 4. Hoà tan căn (DNA, RNA) và xử lý loại bỏ RNA bằng enzyme Rnase. Sau đó kết tủa lại được DNA. 1.1.2. PP tách chiết RNA tổng số và mRNA Chú ý: + Phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ bởi enzyme Rnase. + Rnase lại có mặt khắp nơi (ở đầu ngón tay, trong nước bọt, trong không khí…). + Rnase là một enzyme có hoạt tính cao, bền nhiệt. Do đó: Thao tác tách chiết RNA tốt nhất là ở điều kiện vô trùng, tránh tiếp xúc bằng tay trần. Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng tương tự DNA. Chỉ khác là ở bước cuối cùng dùng enzyme Dnase loại bỏ DNA. Tách chiết mRNA Dựa vào phân tử mRNA có đuôi poly A Do đó sau khi tách chiết được RNA toàn phần, cho qua cột sắc ký ái lực (oligod T-cellulose hoặc các viên bi từ gắn đoạn oligod T). mRNA có đuôi poly A sẽ liên kết bổ sung với đoạn oligod T. Dùng dung dịch rửa cột, các rRNA, tRNA sẽ bị rửa trôi chỉ còn mRNA được giữ lại. Sau đó dùng dd có nồng độ muối thấp rửa cột hoặc li tâm sẽ thu được các phân tử mRNA. 1.2. Các phương pháp phân tích định tính và định lượng axít nucleic 7.2.1. Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế - Nguyên tác của phương pháp dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của base purin và pyrimidine. Protein hấp thụ ở bước sóng chủ yếu ở 280nm. - Giá trị mật độ quang phổ ở bước sóng 260nm (OD260nm – Optical Density 260nm) của các mẫu đo được xác định dựa vào tương quan sau: 1 đơn vị OD260nm tương đương với nồng độ là: + 50g/ml cho dung dich DNA sợi đôi + 40g/ml cho dung dich DNA hay RNA sợi đơn - Tỉ lệ OD260nm/OD280n = 1,8 – 2,0 thì DNA hay RNA được xem là sạch protein. 1.2.2. Phân tích định tính bằng Phương pháp điện di Nguyên tắc của điện di: Dựa vào đặc tính phân tử (DNA, RNA) mang điện tích âm. Protein cũng mang điện tích âm. * Do đó khi đặt chúng trong một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào: + Điện tích, kích thước và cấu trúc không gian của phân tử. + Nồng độ của chất cấu thành gel. Có 2 loại gel: + Gel agarose dùng điện di axít nucleic + Gel polyacrylamide dùng để điện di axit nucleic và protein. - Việc chọn loại gel và nồng độ gel tuỳ thuộc vào kích thước đoạn axít nucleic cần phân tách. Gel agarose: Đây là loại gel thông dụng nhất, sử dụng đơn giản Dùng để tách các đoạn (DNA, RNA) có kích thước từ 0,2-20Kb. Gel đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di theo phương nằm ngang. - Gel sau khi điện di được nhuộm với chất ethidium bromide (cực độc), EtBr xen vào giữa các base và soi dưới tia UV (  300nm) axit nucleic sẽ có màu đỏ da cam. Gel polyacrylamide Dùng để tách các đoạn (DNA, RNA có khích thước nhỏ dưới 1000 cặp base. Thao tác phức tạp hơn gel agarose Mục đích sử dụng: + Tính sạch các đoạn oligonucleotide tổng hợp + Xác định trình tự DNA + Tách đoạn DNA nhỏ ( trong kỹ thuật SSR, AFLP, RFLP…) + Điện di protein - Gel được đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và điện di theo chiều thẳng đứng. - Thường nhuộm bạc,có độ nhạy cao.