Đề tài Các phương pháp tinh sạch Enzyme

làm nghiên cứu về enzyme, ngoài sự hiểu biết về enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều thao tác kỹ thuật khác nhau để tránh gây mất tính hoạt động của enzyme. Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn chứa các protein tạp và nhiều chất khác, để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau. Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp thường dùng các biện pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biện tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các hpương pháp sắc ký( sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion),điện di, phương pháp lọc gel. 1/Phương pháp biến tính chọn lọc Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính các loại protein tạp. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu axít và bền nhiệt.Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-700C và pH <=5.Ở điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu được pH thấp sẽ bị biến tính.Sau đó, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta mong muốn. 2/Phương pháp kết tủa phân đọan Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2 SO4 dựa trên cơ sở sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein enzyme ở một nồng độ muối (tính theo phần % nồng độ bão hòa) xác định được dùng phổ biến để loại bỏ bước đầu protein tạp của các dịch enzyme. Các loại muối có thể được dùng là (NH4)2 SO4, Na2 SO4, MgSO4 ... người ta đã nhận thấy muối (NH4)2 SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme. Loại muối này lại rẻ và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 250C). Phương pháp này chỉ dùng vói những enzyme ít bị biến tính bởi các dung môi được chọn dùng. Để giữ cho enzyme khỏi bị mất khả năng hoạt động, quá trình kết tủa phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (-50C). 3/Phương pháp hấp phụ chọn lọc Người ta có thể cho chất hấp phụ trực tiếp vào dung dịch enzyme, hoặc cho dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp phụ. Chất hấp thụ được sử dụng rộng rãi là hyđrocyapatite. Người ta có thể thực hiện một trong hai cách sau: hoặc là hấp phụ enzyme hoặc là hấp phụ protein tạp. Để tránh làm biến tính enzyme, người ta thường thực hiện quá trình hấp phụ ở nhiệt độ 00C.Sau khi hấp phụ, người ta lại tiến hành chiết enzyme (quá trình phản hấp phụ) bằng các dung môi thích hợp. 4/Phương pháp sắc ký * Phương pháp sắc ký trao đổi ion Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và tác nhân trao đổi ion, người ta áp dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion để làm sạch enzym. Người ta thường sử dụng các tác nhân trao đổi ion sau: Nhựa trao đổi ion Dẫn xuất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose, diethylamino-ethyl-cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl-cellulose. Người ta thường sử dụng dietylaminoetylxelluloza (DEAE-cellulose) hơn cả. Ưu điểm của DEAE-cellulose là với dịch chiết thích hợp ngoài tạp chất protein còn có khả năng loại bỏ các tạp chất axit nucleic.Điều đó cho phép không cần dùng đến các biện pháp nhằm loại bỏ axit nucleic khó và phức tạp như kết tủa protamin hoặc streptomixin sunfat thường được dùng trước đây. Sephadex là dẫn xuất của polysaccharide dextran.Trong chất này, các phân tử của chúng thường liên kết vói nhau bởi các liên kết ngang nhờ tác dụng của epiclohydrin, tao thành “sàng phân tử”. Số lượng liên kết ngang tạo thành càng nhiều, kích thước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ.Khi tiến hành lọc, các chất phân tử có khích thước nhỏ sẽ khuếch tán vào bên trong các hạt sephadex đã được ngâm trong dung dịch đệm, còn các phân tử có kích thước lớn hơn không có khả năng đi vào các hạt sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột. Vậy cơ sở của phương pháp lọc gel sephadex dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dáng và phân tử lượng của các chất có trong hỗn hợp.Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong kỹ thuật enzyme. * Phương pháp sắc ký cột Dịch chiết enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết. Do đó dịch chiết enzyme được tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột.  Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration). Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học. Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước (hydrophyl). 5/Phương pháp tách hệ hai pha nước.  Cơ sở kỹ thuật này dựa vào sự phân bố khác nhau của hỗn hợp trong dung dịch hai pha không hòa tan vào nhau. Các hệ hai pha đặc trưng bằng cách trộn các hệ dung môi vào nhau để tạo thành hai pha riêng biệt. Hệ dung môi được sử dụng trong phương pháp này có thể là polymer/polymer như: polyethylene glycol (PEG) và dextran hoặc polymer/muối như PEG và potassium phosphate, sodium sulphate, sodium phosphate,... Các protein và mảnh vỡ tế bào có khả năng hòa tan khác nhau giữa hai pha, vì vậy phương pháp này có thể được dùng cho cả hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào và phân chia các enzyme trong suốt quá trình tinh sạch protein. Hệ hai pha nước được xem là phương pháp tốt cho việc phân tách và tinh sạch các hỗn hợp, vì phân tách chất lỏng có mật độ khác nhau dễ dàng hơn phân tách các chất rắn ra khỏi các chất lỏng. So với các phương pháp tinh sạch khác thì hệ hai pha nước có một số ưu điểm hơn như: có độ hòa tan trong nước của hai pha lớn (70-80%), đạt độ tinh sạch cao, hiệu suất cao, dễ dàng sử dụng ở quy mô lớn và đặc biệt polymer được tái sử dụng. Sự phân tách đạt hiệu quả cao tùy thuộc vào các thông số như khối lượng phân tử và điện tích của đối tượng nghiên cứu, nồng độ và khối lượng phân tử của các polymer, nhiệt độ, pH, thời gian, lực ion của hỗn hợp và sự hiện diện của các loại muối đa hóa trị như phosphaste hoặc sulphate... 6/ Ngoài ra còn có các phương pháp :- Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học - Phương pháp sắc ký ái lực (affinity chromatography) Hiện nay, chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự có hiệu quả trong việc làm sạch enzyme.Do đó, việc làm sạch chỉ thật sự có hiệu quả khi ta biết lựa chọn các phương pháp riêng,kết hợp với nhau, tạo ra hệ thống phương pháp nối tiếp với nhau một cách hài hòa nhất. V/Quy trình sản xuất 1/Từ nguồn thực vật a.Enzyme bromel Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa (thân và trái). Enzyme bromelin có thể thu được từ trong thân, trong phần thịt quả và trong chồi quả. Tùy theo nguồn thu nhận mà người ta phân biệt bromelin thân hay bromelin quả và bromelin thân là nhóm có giá trị kinh tế. Ở mỗi bộ phận khác nhau trên cây dứa, bromelin có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạo khác nhau. Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6-8. Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc họ Sung. Enzyme bromelin có trọng lượng phân tử khoảng 33.000 DA, lớn gấp 1,5 lần so với papain. Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzyme bromelin khoảng từ 3 tháng trước khi chín, trong đó hoạt tính bromelin cao nhất là khoảng 20 ngày tước khi chín. Khi trái chín, hoạt tính bromelin giảm xuống nhưng không mất hẳn. Bromelin còn có thể thu được từ trong thân dứa(trung bình có thể thu được 3,6 kg bromelin từ 378l nước rút ra từ thân cây dứa. Việc thu nhận và tinh sạch bromelin có thể thực hiện theo sơ đồ sau: Dịch ly tâm Quả/thân/chồi dứa Xay nhuyễn, lọc Dịch lọc Ly tâm Bã Kết tủa Sản phẩm enzym tinh khiết Chế phẩm brommelin Sấy khô Tinh sạch Thu dịch enzyme thô Quả dứa hoặc thân được xoay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để lọai bỏ chát xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa bromelin. Các phương pháp tách bromelin * Phương pháp kết tủa enzyme Đối với enzyme protein cũng như các protein enzyme khác, để có thể thu được enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặc các hoá chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein kết tủa xuống. Các dung môi thường được sử dụng để kết tủa bromelin là acetone và ethanol, còn các hóa chất khác như các muối trung tính ở nồng độ cao cũng có thể kết tủa được enzyme. Heinicker và Gortner đã dùng acetone để kết tủa bromelin từ thân và trái. Bromelin trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ do đó để sự kết tủa đạt hiệu quả cao thường tiến hành quá trình kết tủa trong điều kiện lạnh. Như vậy, nước ép từ thân và trái dứa phải được làm lạnh ở 0-40C và aceton tinh khiết ở 200C.Ethanol cũng được sử dụng để kết tủa protein và hỗn hợp bromelin-ethanol cũng phải giữ ở điều kiện nhiệt độ lạnh. Sau khi thu được kết tủa, tủa bromelin phải đươc rửa bằng aceton và làm khô thật nhanh để bromelin không bị biến tính. Để có thể thu nhận enzyme, việc đầu tiên là phải phá vỡ tổ chức mô có chứa enzyme bằng các nghiền mô để thu dịch chiết có chứa bromelin rồi sau đó dùng các tác nhân khác nhau để kết tủa bromelin. Những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng của chế phẩm enzyme đó là: Nồng độ của ammonium sulfate. pH của dịch chiết. Nhiệt độ kết tủa. Thời gian tiếp xúc của tác nhân đệm và dịch chiết. * Phương pháp hấp phụ Có thể sử dụng kaolin hay betonite để hấp phụ bromelin. Cách làm: cho kaolin khô ( hoặc đã ngâm trương nở ) vào dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25 mg kaolin/ml dung dịch nước dứa. Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa. Tủa được gọi là bromelin-kaolin. * Phương pháp siêu lọc Sử dụng màng FS 50PP có giá trị lọai trừ 30.000, diện tích màng 336 cm2. Dịch dứa sau ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá tr2inh này thêm nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc. Thu nhận tủa bằng cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc. Thu nhận bromelin bằng phương pháp sử dụng cacboxyl methyl cellulose (CMC). Phương pháp tách bromelin bằng CMC cho phép thu được bromelin ở dạng bột trắng có họat tính cao, thời gain nhanh và đơn giản hơn so với các phương pháp khác. Phương pháp tinh sạch enzyme bromelin Enzyme bromelin được tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích, lọc qua sephadex, phương pháp sắc ký. * Tinh sạch bằng phươg pháp thẩm tích. Cân 1g enzyme thô, pha trong 10ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M có pH7,2. Sau khi tất cả enzyme đã hoà tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có chứa 1L dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M, pH 7,2. Túi cellophane được chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự như trên. Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ sau 2giờ thay dung dịch đệm bên ngoài 1 lần. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng 1 máy khuấy từ. Trong quá trình thẩm tích, để làm giảm sự biến tính của enzyme do nhiệt, người ta thường tiến hành tinh sạch enzyme ở nhiệt độ thấp. * Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex. - Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50. - Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-10. * Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký. Bromelin thân được cho chảy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 cho 2 phân đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagon. Bromelin thân và bromelin quả thô được cho chạy sắc ký gel trên sephadex G-75, tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên sulfo ethyl sephadex chỉ cho một phân đoạn protein đơn có hoạt tính phân giải protein. b/ Enzyme papain : Được tách từ nhựa trái đu đủ xanh, papain thuộc nhóm enzyme thuỷ phân có nguồn gốc thực vật được nghiên cứu nhiều nhất về tính chất và cơ chế hoạt động. papain là một sulfhydryl protease, đầu tiên đựoc tách ra bởi Bals và cộng sự của ông, sau đó bởi Kimmel và Smith từ nhựa khô. Thu nhận nhựa đu đủ. Điều kiện lấy nhựa. Cây: đang sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhựa nhiều. Quả: lấy ở những quả đang còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lượng từ 0,3-1kg là tốt nhất. Thời gian lấy nhựa: sáng sớm, kết thcs vào giữa buổi sáng. Khi độ ẩm không khí thấp, dòng nhựa chảy chậm và đặc, khó thu nhận. -Mùa khô: nhựa ít, đặc, nồng độ protein cao. -Mùa mưa: nhựa nhiêu, loãng, nồng độ protein thấp. Tiến hành : Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn ở trên cây. Dùng dao inox có đầu nhọn rạch vài đường theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất. Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thuỷ tinh màu miệng rộng trong 4-6 phút, sau khi lấy nhựa xong đậy nắp kín giữ trong tối. Bảo quản lạnh: Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc công trùng lẫn vào. Không nên trôn nhựa khô với nhựa tươi vì nó làm giảm chất lượng. Khi tiến hành các thao tác với nhựa tươi, tránh không cho nhựa tiếp xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng. Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kimloại nặng như sắt, đồng… vì nó làm biến màu và giảm hoạt tính enzyme. Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% độ ẩm. Phương pháp thu nhận papain tinh khiết. Hoà tan nhựa đu đủ, mục đích là loại bỏ các chất nhựa, cặn, tạp lớn… Loại bỏ các chất không tan ở pH 9. Quá trình phân đoạn bằng ammodium sulfute. Quá trình phân đoạn bằng NaCl. Kết tinh. Tái kết tinh. Sấy chân không. Phương pháp tinh sạch enzym tinh khiết. * Phương pháp hấp phụ có chọn lọc. Để thực hiện phương pháp này người ta cho dịch enzyme chảy từ từ qua cột chất hấp phụ. Khi đó, tùy theo khả năng tương tác của chất hấp phụ với từng loại enzyme, các enzyme khác nhau sẽ được hấp phụ trên chất hấp phụ với khả năng khác nhau. Sau đó dùnf các dung dịch đệm thích hợp để chiết rúr enzyme ra khỏi cột. Phương pháp hấp phụ thường dùng để làm đặc dung dịch enzyme. Có thể hấp phụ chọn lọc các enzyme theo 2 cách: - Hấp phụ âm tính: nếu enzyme không được hấp thụ, phương pháp xử lý này có thể xem như là dùng chất hấp thụ để tách những hợp chất tạp ra khỏi dung dịch enzyme. -Hấp phụ dương tính: nếu enzyme được hấp phụ, nó sẽ được tách ra khỏi những cấu tử khác trong dung dịch và sau đó được rửa giải khỏi chất hấp phụ bởi dung dịch đệm pH kiềm và các dung dịch đệm khác có khả năng rửa giải enzyme. Sau khi li tâm để loai các hợp chất không tan, dung dịch enzyme có thể thẩm tách đẻ loại dịch đệm. Muốn sự hấp phụ enzyme tốt nhất cần phải tuân theo những nguyên tắc chung sau đây: Hàm lượng protein trong dung dịch không vượt quá 1%. Tỉ lệ của gel( trọng lượng khô) đói với protein thường là 20:1. Môi trường hơi axit pH=5-6. Nồng độ chất điện li( muối) thấp trong dung dịch. Sự tồn tại của bất kì một lượng muối nào cũng đều ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ. Quá trình được tiến hành tuần tự như sau: -Cho vào dung dịch enzyme liên tiếp những lượng thích hợp gel. -Trộn đều. -Quay lắng. -Thu hồi từng phần gel trước khi cho phần tiếp theo vào. * Phương pháp cột sắc ký: Để quá trình tinh chế enzyme đạt hiệu quả cao nhất, ngoài những phương pháp thông thường phổ biến như kết tủa enzyme bằng muối hoặc các dung dịch hữu cơ từ các dung dịch, phương pháp thấp phụ chọn lọc trên jela vô cơ. Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả để chiết tách enzyme tinh khiết. quá trình phân táchcó thể dựa trên sự hấp phụ, trao đổi ion hoặc hiệu ứng rây phân tử, nhưng trên thực tế, hầu như các quá trình phân tách đều chịu ảnh hưởng của cả 3 quá trình trên. Quá trình dựa trên phản ứng trao đổi ion giữa các protein tan trong nước hoặc những dung dịch đệm loãng với những chất trao đổi iôn khác nhau, protein được tạo bằng cách tạo các liên kết tĩnh điện giữa những phần tĩnh điện trên bề mặt chất hấp phụ. Thông thường, cho dung dịch chế phẩm enzyme vào trong dung dịch đệm với cột trao đổi iôn đã được cân bằng -> dung dịch đệm giải hấp phụ bằng dung dịch điện giải (gradient muối) với nồng độ tăng dần chảy qua các cột, các iôn của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi nhựa, các enzyme vừa liên kết với nhựa. Khi đó, enzym nào có ái lực với nhựa kém nhất sẽ dễ bị đẩy ra khỏi nhựa nhất. Do đó, lần lượt các enzyme khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau, trong đó có phần chứa enzyme cần thu với nồng độ cao nhất. Lực hấp phụ của một chất trao đổi iôn được xác định bởi : -Tính chất hóa lý của protein. -Đặc tính của những nhóm tích điện trong chất trao đổi iôn. -Những điều kiện hấp phụ protein. Do đó không thể đề ra trước những điều kiện cần thiết để tách tốt nhất những enzyme đó ra khỏi những protein khác bằng chất trao đổi ion mà phải tùy vào trường hợp, những điều kiện đó cần phải được nhà thực nghiệm lựa chọn. Khi phân tách, quá trình tiến hành tuần tự như sau: -Lấy một thể tích V dung dịch ( không quá 1/3 thể tích cột) cho chảy một phần qua cột để lọai muối ra khỏi dung dịch protein. -Protein chảy ra khỏi cột vào một thể tích dung dịch hơi lớn hơn so với thể tích của nó lúc đưa vào cột . -Ngòai ra, các cột chứa sephadex G-75, G- 100 và G-200 cũng xảy ra sự phân tách từng phần các protein tùy theo khối lượng phân tử của chúng. Do đó, việc lọai trừ những chất “kết tinh” ra khỏi dung dịch, các cột chứa sephadex từ G-75 đến G-200 có thể sử dụng để phân tách từng phần protein dựa theo kích thước phân tử. * Phương pháp điện di Là phương phá vật lý có giá trị để phân tách các hỗn hợp protein, enzyme và cũng là phương pháp để xác định sự tinh khiết củ các chế phẩm protein.Gần đây,phương pháp này được áp dụng ở những giai đọan tinh chế enzyme cuối cùng. Nguyên tắc: Có nhiều phương pháp điện ly khác nhau.Trong tinh chế enzyme có hai phương được áp dụng: Phương pháp rang giới chuyển động: được áp dụng chủ yếu để xác định điểm đẳng điện và độ tinh khiết cùng tính thuần nhất của chế phẩm enzyme. Phương pháp điện di khu vực trên giấy và trong khối hoặc trong cột có chứa các chất làm đầy: được áp dụng để chiết xuất sơ bộ và tinh khiết enzyme. Điều kiện cần thiết để tiến hành điện di: pH, nồng độ dung dịch đệm, điện thế của dòng điện và thời gian thí nghiệm được lựa chọn qua thực nghiệm và tính chất của enzyme nghiên cứu. * Phương pháp kết tinh Khi enzyme đã đạt đến độ ting khiết phù hợp nó có thể kết tinh.Tuy nhiên kết tinh không có nghĩa là chế phẩn enzyme tinh khiết.Người ta xác định rằng những tinh thể đầu tinh của protein hay enzyme thường có độ tinh khiết không quá 50% và có thể chứa nhiều loại enzyme khác nhau. Họat độ riêng của tinh thể tăng khi các enzyme tái kết tinh và quá trình tái kết tinh cần được lập lại nhiều lần cho đến khi họat độ riêng tăng đến một giá tri cao nhất. Phương pháp kết tinh và tái kết tinh được ứng dụng khi tinh chế enzyme như là một phương pháp phân đọan protein có giá trị. Vì thế tốt nhất nên xem quá trình kết tinh như là một phương pháp cụ thể của quá trình phân đọan, và được sử dụng ở những giai đọan tinh chế cuối cùng. Sự kết tinh enzyme thường được tiến hành từ các ammonium sulfate. Enzyme thường được kết tinh theo nhiều phương pháp khác nhau.Ví dụ: như từ các dung môi hữư cơ .Khi những phương pháp này thất bại người ta có thể kết tinh muối kim lọai nặng của enzym. Chẳng hạn, phosphopyruvate hydratase được kết tinh như muối thủy ngân không họat động, từ đó các enzyme họat động có thể được thu nhận thông qua sự lọai bỏ kim lọai bằng quá trình thẩm tích đối với dung dịch ammonium sulfate chứa ammonia và cyanyte. c/ Enzyme Ficin : Ficin là 1 protease được tìm thấy trong nhựa của cây thuộc họ Ficus (sung, vả), huộc họ Moraceae, bộ Urticales. Hầu hết các bộ phận của cây có chứa nhựa bao gồ cao su 2,4%, resin, albumin, cerin, đường, malic acid, rennin, proteae, diatase,… Người ta nhận thấy rằng hoạt tính của enzyme ficin cao khi nhựa được thu nhận vào buổi sáng sớm. Do đó, nhựa sung thường được thu vào sáng sớm, sấy khô để dùng trong công nghệ thực phẩm. Phương pháp thu nhận ficin thô từ cây sung: Từ lá và quả: lá và quả sau khi hái về được rửa sơ, cắt nhỏ và ngâm trong nước rồi xay nhuyễn.Lọc qua vải thường, loại bỏ xác và thu lấy dịch lọc. Dịch lọc được xác định đem đi xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz, từ đó xác định hoạt tính của enzyme ficin chứa trong dịch lọc. Từ nhựa thân: nhựa sung được thu vào buổi sáng từ 6-8 giờ. Nhựa sung được bảo quản lạnh ở ngăn đông có nhiệt độ thấp hơn 00C. Hoạt tính của protease trong nhựa tươi được xác định bằng phương pháp Kunitz. Một số phương pháp chiết tách enzyme: * Phương pháp chiết tách enzyme dựa vào tính hoà tan: -Tủa phân đoạn enzyme bằng dung môi hữu cơ. -Kết tủa enzyme bằng muối ammonium sulfate. Sơ chế dịch nhựa tươi từ cây sung Ficus rasemosal thành chế phẩm enzyme ficin - Dịch nhựa sung sau khi thu được pha theo tỷ lệ 1g dịch nhựa trong 2ml nước cất. -Khuấy đều dung dịch bằng máy khuấy từ trong 5 phút để enzyme hoà tan hoàn toàn trong nước. -Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3000 vòng /phút trong thời gian 10 phút để cao su đông đặc lại và lắng xuống. Loại bỏ phần lắng ở phía dưới, thu dịch nổi bên trên. -Dùng phương pháp tủa phân đoạn enzyme bằng ethanol 96% để thu lấy các phân đoạn và xác định hoạt tính enzyme trong các phân đoạn. -Những phân đoạn có hoạt tính enzyme được pha lọc gel để loại bỏ các tạp chất trong các phân đoạn enzyme. -Các phân đoạn sau khi qua cột gel sẽ được xác định lại hoạt tính, trộn với tinh bột với tỷ lệ 1:1 rồi sấy khô ở nhiệt độ 400C. Chế phẩm enzyme thu được ở dạng bột sẽ bảo quản ở nhiệt độ 0-400C. Việc thu nhận ficin từ nhựa sung có thể được thực hiện theo sơ đồ sau Tủa phân đoạn bằng ethanol Thu lấy các phân đoạn Dịch nhựa sung Pha nước cất(tỷ lệ 1g dịch nhựa: 2 ml nước) Ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút, 10 phút Khuấy bằng máy khuấy từ trong 5 phút Loại bỏ tủa Thu dịch bên trên Xác định hoạt tính các phân đoạn Thu các phân đoạn có hoạt tính và đưa lọc gel Xác định hoạt tính các phân đoạn Thu phân đoạn Độn với tinh bột Sấy khô ở 400C Chế phẩm enzyme Bảo quản nhiệt độ lạnh 0-40C Các phương pháp tinh sạch enzyme Ficin: * Phương pháp lọc gel: Cách làm: + Nhồi cột: ngâm gel sephadex G75 trong dung dịch NaN3 0,02% trong 24 giờ để gel trương nở hòan toàn. - Cho dung dịch đệm vào cột. - Cho một lớp gòn thủy tinh vào cột, đổ gel từ từ vào cột đến chiều cao cần thiết. Trong quá trình đổ gel vào cột phải khuấy đều để gel được đồng nhất và phải chú ý là luôn luôn có một lớp dung dịch đệm trên mặt để ngăn cản hiện tượng khô gel. Đặt lên gel một lớp giấy lọc. - Để cột ổn định trong vài giờ, rửa cột bằng dung dịch đệm phosphate. + Nạp mẫu: cân mẫu và hoà tan mẫu vào 3-5 ml dung dịch đệm pH 6,1 sao cho nồng độ protein khoảng 10 mg/ml. - Nạp mẫu vào cột, sau khi hết mẫu vẫn tiếp tục cho dung dịch đệm qua cột. - Thu mẫu vào ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 2,5ml. Mỗi phân đoạn được thu trong thời gian 5-10 phút, đem các phân đoạn đi đo OD 280nm. Dồn chung những phân đoạn nào có sự hiện diện của enzyme để đo hoạt tính và xác định hàm lượng enzyme. * Phương pháp điện dimini-gel SDS polyacrylamide: Cách làm: + Chuẩn bị hoá chất: - Dung dịch acrylamide - Đệm gel phân tách Tris-HCl 1,5M ; pH 8,8. - Dung dịch SDS(10%). - Dung môi pha mẫu. - Đệm điện di. - Dung dịch nhuộm protein. - Dung dịch rửa mẫu. + Tiến hành: - Chuẩn bị mẫu: hoà tan mẫu khô dung dịch trong dung môi pha mẫu để có nồng độ protein khoảng 1mg/ml dung dịch pha mẫu. Đun cách thuỷ hỗn hợp trong 5 phút, để nguội, cho vào các giếng của enzyme. - Chuẩn bị gel phân tách(10ml) Đệm gel phân tách: 2,5ml; nước cất: 3,2ml Dung dịch acrylamide: 4,15ml; SDS 10%: 0,1ml Amonium persulfate; ít tinh thể; TEDMED: 3,3microlit Lắc nhẹ cho tan hết rồi dùng pipette đưa gel phân tách vào khoảng giữa hai tấm kính cho đến lúc gel cao khoảng 8cm ( chú ý để không có bọt khí). Cho một lớp nước cất lên gel, chờ gel đông lại. - Chuẩn bị gel gom Đệm gel gom: 0,5ml; nước cất 1,18ml Dung dịch acrylamide: 0,3ml; SDS 10%: 20 microlit Acnomium persulfate: ít tinh thể; TEDMED: 1microlit Lắc nhẹ cho tan hết. Sau khi gel phân tách đông lại, hút bỏ phần nước cất ở trên rồi dùng pipette đưa gel gom vào khuôn. Lúc này đưa lược vào khuôn để tạo giếng. Khi gel gần đông, nhẹ nhàng lấy lược ra rồi lắp khuôn gel vào độ điện di. Tiến hành điện di: cho dung dịch điện di vào 2 buồng điện di. Bơm từ từ 5-10 microlit mẫu vào các giếng. chạy điện di. Sau khoảng 1 giờ, khi thấy vạch màu chỉ thị di chuyển xuống đến gần đáy của gel thì ngắt điện và tiến hành nhuộm gel. Nhuộm gel: ngâm gel trong dung dịch thuốc nhuộm protein, lay động nhẹ cho thuốc nhuộm ngấm vào gel(1-4 giờ). Chuyển gel sang dung dịch rửa màu, thay dung dịch vài lần đến khi gel trong suốt và các vạch màu xanh xuất hiện tại các vị trí protein. Chụp hình và ghi nhận kết quả. 2.Từ nguồn động vật Các enzym thu từ động vật như: rennet, pepsin, catalas