Đề tài Các phương pháp xác định lượng dư thuốc kháng sinh trong thực phẩm

min vòng có đường rẽ nhánh sinh tổng hợp chloramphenicol tại vị trí acid shikimic. COOH COOH OH O C CH2 CH2 H2N-CH NH2 COOH HC-OH H2N-CH NH2 COOH COOH CHCl2 HC-OH NH2 O=C HN CH CH2OH CHCl2 HC-OH NH2 O=C HN CH CH2OH CHCl2 HC-OH NO2 O=C HN CH Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp chloramphenicol từ acid shikimic Lên men và tinh chế Chlorampenicol Công nghệ lên men sản xuất Chloramphenicol được hoàn thiện chủ yếu cho đến thời kì đầu thế kỷ XX. Từ khi công nghệ tổng hợp hóa học xuất hiện, với hiệu quả kinh tế cao hơn, đã dần thay thế hoàn toàn công nghệ lên men. Trong vài năm gần đây, việc áp dụng thành tựu và khoa học công nghệ mới đã mở ra triển vọng hoàn thiện công nghệ lên men sản xuất chloramphenicol với hiệu quả kinh tế có khả năng cạnh tranh được với phương pháp tổng hợp hóa học. Để lên men chloramphenicol người ta thường sử dụng các chủng có hoạt tính cao thuộc loài S.Venezuelae. Nguồn dinh dưỡng carbon có thể sử dụng là glucose, lactose, maltose và glycerine. Trong đó ưu thế hơn cả là glycerine. Nguồn dinh dưỡng nitơ tốt nhất là tryptone, amoniac, asparagin, glutamine. Cảm ứng sụ phát triển sinh khối, nhưng không cải thiện hiệu quả tích tụ kháng sinh. Trong khi bổ sung phanlalnine, locine hay izolocine xạ khuẩn tích tụ chậm nhưng cải thiện dược lượng kháng sinh tích tụ. Trong việc sản xuất, với nguồn nitơ người ta thường sử dụng nguyên liệu thay thế rẻ tiền hơn như: dạ dày lợn, nấm men thủy phân, dịch nấm men đồng thời cung cấp thêm chất khoáng. Giống xạ khuẩn được nuôi hoạt hóa thu bào tử, rồi cấy chuyền sang môi trường lỏng trong bình tam giác và nuôi ở 250C trong vòng 72h, tiếp theo cấy chuyền sang fermentor dung tích lơn hơn đến khi đủ giống để sản xuất. Quá trình sinh tổng hợp chloramphenicol xảy ra gần như đồng thời với sự phát triển sinh khối và phần lớn lượng kháng sinh được sinh tổng hợp và tích tụ trong pha cân bằng. Với các chủng hoạt lực cao, nồng độ chloramphenicol trong dung dịch thường đạt khoảng 130 – 150 mg/l sau khoảng 3 ngày lên men. Nồng độ chloramphenicol được định lượng bằng phương pháp sinh hoạc (sử dụng sarcina lute), phương pháp khử vitamin hóa, phương pháp đo phổ hấp phụ cục đại ở 278nm, phương pháp sắc ký khí và hiệu quả nhất là phương pháp HPLC. Kết thúc quá trình, dịch lên men được acid hóa nhẹ xuống pH = 4.0, lọc tách sinh khối, rồi điều chỉnh pH kiềm nhẹ (pH = 8.5 – 9.0) để trích ly sang ethylacetat hay amin acetate. Sau khi phân ly, dịch trích ly được cô chân khong loại dung môi rồi hòa tan lại bằng dầu lửa. Dung dịch này được rửa tiếp bằng dung dịch acid acetic, dung dịch natri bicacbonat loãng rửa nước và sau khi phaanly pha sẽ được cô chân không loại dầu lửa. Sau khi rửa phần không bay hơi còn lại (bằng ete dầu lửa để loại lipid) người ta thu được bột chloramphenicol thô. Bột kháng sinh thô này được hòa tan lại trong dung môi hữu cơ để xử lý tẩy màu qua cột than hoạt tính hay cột nhôm trong nước nóng, tẩy màu lại qua than hoạt tính, lộc, cô chân không rồi làm lạnh xuống nhiệt độ thấp để kết tinh thu chloramphenicol dạng tinh thể. Để đạt độ tinh sạch cao hơn, có thể hòa tan và kết tinh lại trong ethylene dicloride hoặc trong dung môi hỗn hợp ethel – ethel dầu lửa. Penicillin [13] a. Lịch sử  Penicilin được tìm ra nǎm 1928 và được sử dụng trong lâm sàng lần đầu tiên vào nǎm 1941. Nǎm 1941, penicilin G là kháng sinh có hiệu quả cao, thậm chí chống được hầu hết các chủng Staphylococcus aureus. Tuy nhiên, đến nǎm 1947, phần lớn các các vi khuẩn phân lập được trong bệnh viện đều biểu hiện tính kháng penicilin. Trong một nỗ lực nhằm vào vấn đề này, các penicilin "bán tổng hợp" đã được triển khai. Methicilin, một penicilin ổn định beta-lactamase, được đưa ra thị trường nǎm 1959. ít lâu sau, nafcilin và oxacilin cũng được đưa ra thị trường. Nǎm 1961, ampicilin có hiệu quả cao chống lại  E.coli,  H.influenzae  và  N.gonorrhea. Ngày nay, một số đáng kể E.coli và H.influenzae đả kháng ampicilin, và ampicilin không còn là liệu pháp hàng đầu chống lại N.gonorrhea nữa. Hình 1.10 Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum Carbenicilin được cho phép sử dụng nǎm 1970 và là một penicillin bán tổng phổ rộng đầu tiên. Thuốc có hoạt tính cao chống lại các vi khuẩn gam âm ở ruột và Pseudomonas aeruginosa. Nhóm penicilin này còn được gọi là các penicilinkháng pseudomonas và được chia theo cấu trúc thành 2 nhóm: Nhóm carboxypennicillin (ticarcillinvà carbenicillin) và nhóm acylureidopenicillin(piperacillin và mezlocillin).Nhóm carboxypenicillin có tỷ lệ gây bất thường tiểu cầu và xuất huyết trên lâm sàng cao hơn nhóm acylureidopenicillin. b. Cơ chế hoạt động  Để đạt được hiệu quả, penicillin phải thấm qua màng tế bào và gắn với các protein gắn penicillin. Các protein gắn penicillin chịu trách nhiệm nhiều bước trong quá trình sinh tổng hợp của màng tế bào và có mặt trong hàng trǎm đến hàng nghìn phân tử trên một tế bào vi khuẩn. Các protein gắn penicillin rất khác nhau giữa các chủng vi khuẩn. Các kháng sinh beta – lactam cản trở việc tổng hợp màng tế bào qua trung gian PBP, cuối cùng dẫn đến ly giải tế bào. Sự ly giải diễn ra qua trung gian là các enzym tự ly giải thành tế bào vi khuẩn (ví dụ: các autolysin). Còn chưa rõ mối liên quan giữa các PBP và các autolysin, nhưng có lẽ kháng sinh beta – lactam gây cản trở bằng một chất ức chế autolysin. Cơ chế kháng Tính kháng với các penicillin có được phần lớn là nhờ sản sinh beta – lactam. Để khắc phục điều này, người ta đã tạo ra một số chất ức chế beta – lactam: acid clavulanic và sulbactam. Các hợp chất này cũng là các phân tử beta – lactam nhưng bản thân chúng ít hoặc không có hoạt tính kháng khuẩn. Chúng làm bất hoạt enzyme beta – lactam bằng cách gắn vào vị trí hoạt động của enzym. Trong quá trình đó, chúng bị phá huỷ; vì vậy, chúng còn được gọi là các ức chế "tự sát". Việc bổ sung chất ức chế, như: acid clavulanic hoặc sulbactam, sẽ tái lập hoạt tính của penicillin chống lại vi sinh vật sản sinh beta – lactamase. Tuy nhiên, các cơ chế khác với sản sinh beta – lactam có vẻ là trung gian tạo ra tính kháng của Staph.aureus kháng methicillin. Các đặc điểm phân biệt Sự khác biệt rõ ràng giữa các penicillin bao gồm khác biệt trong phổ hoạt động của chúng. Penicillin trong các muối và các dạng liều khác nhau, ampicillin, và amoxicillin có hoạt tính chống lại các vi khuẩn hiếu khí gram dương và một số vi khuẩn kỵ khí. Các chất này dễ bị beta-lactamase phá huỷ và do đó không có hiệu quả chống tụ cầu và các vi khuẩn kỵ khí sản sinh beta-lactamase. Ampicillin và amoxicillin có hoạt tính chống lại một số vi khuẩn hiếu khí gram âm, nhưng penicillin thì không. Amoxicillin đã thay thế penicillin V làm loại penicillin lý tưởng để phòng viêm nội tâm mạc do sinh khả dụng ưu việt của nó. Methicillin, nafcillin, mezlocillin, và dicloxacillin là các chất giống hệt nhau ngoại trừ đường dùng của chúng. Chúng có hoạt tính chống lại các vi khuẩn hiếu khí gram âm, nhưng chúng được dành để điều trị nhiễm tụ cầu. Chúng không có hiệu quả chống lại vi khuẩn gram âm. Carbenicillin, ticarcillin, mezlocillin và piperacillin có hoạt tính rộng chống lại các vi khuẩn hiếu khí gam âm nhưng không có hiệu quả chống tụ cầu. Các penicillin phổ rộng được sử dụng chủ yếu trong điều trị nhiễm khuẩn nghi ngờ hoặc biết chắc là do vi khuẩn hiếu khí gram âm. Để chống lại Pseudomonas aeruginosa, chúng thường được phối hợp với một aminoglycosid. Trong số các penicillin phổ rộng hay các penicillin kháng pseudomonas, hiệu lực tương đối chống lại Pseudomonas là: Piperacillin > Mezlocillin = Ticarcillin > Carbenicillin. Trừ carbenicillin, các thuốc này được dùng ngoài đường tiêu hóa. Các phản ứng có hại Các phản ứng có hại của penicillin bao gồm những phản ứng có hại của tất cả các thuốc kháng sinh (như: nhờn thuốc, các phản ứng quá mẫn) cũng như một số phản ứng huyết học và thần kinh. Nhiều, nhưng không phải tất cả các penicillin có liên quan với giảm bạch cầu trung tính và giảm tiểu cầu, và các carboxypenicillin có thể gây rối loạn chức nǎng tiểu cầu. Khi dùng liều cao cho bệnh nhân rối loạn chức nǎng thận, penicillin có thể gây ra cơn co giật. Methicillin có liên quan với viêm thận kẽ. Được sử dụng đúng, các penicillin là những thuốc cực kỳ an toàn và hiệu quả. II Các phương pháp xác định hàm lượng chất kháng sinh trong thực phẩm 2.1 Dư lượng Chloramphenicol trong thủy sản bằng kít elisa thông qua phân tích khẳng định bằng LC – MS/MS [5]. 2.1.1 Giới thiệu Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ như GC – MS, GC – MS/MS, LC – MS, LC – MS/MS đều đáp ứng được yêu cầu và được các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận. Tuy nhiên những phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kiểm nghiệm viên. Do vậy nó không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm qui mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương. Vài năm gân đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên – kháng thể (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method). Liên minh châu Âu (Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng các hóa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm. Từ năm 2002 đến nay, phương pháp ELISA đã được sử dụng trong phân tích sàng lọc tại phòng kiểm nghiệm của các Trung tâm Kiểm tra Chất lượng và Thú y Thuỷ sản vùng đối với các chỉ tiêu CAP, AOZ và AMOZ. Tất cả các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA được kiểm tra khẳng định trên LC – MS/MS. Để có cơ sở xem xét tính hữu dụng của các phép thử trên ELISA trong kiểm tra và chứng nhận chất lượng thực phẩm thuỷ sản, trong phạm vi báo cáo này, chúng tôi sẽ đưa ra những đánh giá về kết quả phân tích CAP trên ELISA. Nội dung của báo cáo sẽ xem xét đến hai vấn đề chính là tỉ lệ phát hiện dương giả trên ELISA; và độ tương đồng kết quả kiểm nghiệm giữa hai phương pháp phân tích trên ELISA và LC-MS/MS. Kết quả đánh giá dựa trên số liệu thống kê kết quả phân tích tại phòng kiểm nghiệm của NAFIQAVED 4 – Tp Hồ Chí Minh, từ ngày 1/1/2006 đến tháng 7/2007. 2.1.2 Đối tượng Đối tượng trong nghiên cứu này các loại thực phẩm thuỷ sản sau : Cá các loại (7255 mẫu) Tôm các loại (4253 mẫu) Cua, ghẹ (606 mẫu) Nhuyễn thể các loại (600 mẫu) Thủy sản tẩm bột (302 mẫu) Thủy sản khô các loại (242 mẫu) Chả giò, há cảo (125 mẫu) Mắm hải sản các loại (35 mẫu) 2.1.3 Phương pháp phân tích a Tóm tắt qui trình thử nghiệm Elisa sử dụng trong thực nghiệm Kít thử Elisa: Kit thử của các hãng R-Biopharm và TAPB. Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate. Dịch chiết đuợc cô đến khô ở 50oC dưới dòng nitơ. Cặn khô được hoà tan trong 1ml đệm và làm sạch bằng 1ml hexan. Hàm luợng CAP trong dịch chiết đuợc phân tích với kit thử ELISA. Qui trình thử nghiệm với ELISA: Qui trình xác định hàm lượng CAP trong dịch chiết trên Elisa tuân thủ theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm. Giới hạn phát hiện: 0,1ppb b Qui trình thử nghiệm LC – MS/MS sử dụng trong thực nghiệm Các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA được phân tích khẳng định trên LC – MS/MS theo qui trình tóm tắt như sau: Thiết bị Hệ thống LC-MS/MS: Waters Quattro-micro API (tripple quadrupole, ESI(-) Hình 2.1 Hệ thống LC-MS/MS Qui trình chuẩn bị mẫu Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate. Dịch chiết đuợc cô đến khô ở 50oC dưới dòng nitơ. Cặn khô được hoà tan trong 1ml NaCl 4%, làm sạch sơ bộ bằng 1ml hexan và sau đó được làm tinh sạch bằng cột C18. Hàm luợng CAP trong dịch giải hấp đuợc phân tích trên LC – MS/MS Phân tích trên LC – MS/MS: Các thông số chính: LC: Pha động: ACN: H20 (80:20) Tốc độ dòng: 0,3ml Thể tích tiêm:10ul MS/MS: ESI (–) MRM : 321 à 152 321 à 194 321 à 256 326 à 157 Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương để kiểm soát chất lượng kết quả thử nghiệm. Nội chuẩn CAP – d5 được sử dụng để hạn chế tối đa ảnh hưởng của nền mẫu (biological maxtrices) đối với kết quả phân tích. Ngoài ra, hàng năm phòng kiểm nghiệm đều tham gia các chương trình thử nghiệm thành thạo do FAPAS tổ chức (thuộc Phòng Thí nghiệm Trung tâm của Vương quốc Anh – Central Science Laboratory, UK) và đạt kết quả tốt (Z score < 2). 2.1.4 Phân tích – nhận xét Tỷ lệ dương tính giả trên ELISA Kết quả thực nghiệm được trình bày trong bảng dưới. TT Loại thuỷ sản Số mẫu phân tích Dương tính giả (Không phát hiện với LC_MS/MS Dương tính thật (phát hiện > 0,5ppb với LC-MS/MS) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Cá các loại 7255 42 0.6 76 1,0 Tôm các loại 4253 19 0.5 63 1,5 Cua, ghẹ 606 8 1.5 62 10,2 Nhuyễn thể các loại 600 3 0.5 3 0,5 Thủy sản tẩm bột 302 36 12.2 8 2,6 Thủy sản khô các loại 242 33 18.2 61 25,2 Chả giò, há cảo 125 13 13.8 31 24,8 Mắm hải sản các loại 35 13 43.3 5 14,3 Tổng số: 13.418 167 1.3 309 2,3 Bảng 2.1 Tổng hợp kết quả phân tích sàng lọc CAP trên ELISA và khẳng định trên LC-MS/MS Trong tổng số 13.418 mẫu thuỷ sản các loại đã qua phân tích sàng lọc bằng ELISA thì có 167 mẫu là dương tính giả, chiếm 1.3% tổng số mẫu đã phân tích. Điều này cho thấy, ELISA là một công cụ hữu hiệu cho việc sàng lọc các mẫu thủy sản đối với chỉ tiêu CAP. Như thống kê trong bảng 2, tỷ lệ dương tính giả khác nhau giữa các đối tượng mẫu thủy sản và theo thư tự sau: Tôm = Nhuyễn thể < Cá < Cua, Ghẹ < Chả giò, há cảo < Thuỷ sản tẩm bột < Thuỷ sản khô < Mắm thuỷ sàn Tỉ lệ dương giả đối với nhóm sản phẩm thủy sản tẩm bột (tôm, cá, mực tẩm bột), chả giò - há cảo là khá cao (12,2% và 13,8%) so với các đối tượng mẫu thủy sản cùng loại ở dạng chưa phối chế (tôm, cá, mực, ghẹ) (< 1,5%). Điều này cho thấy lượng tinh bột có trong mẫu phân tích có ảnh hưởng đáng kể đến độ chính xác của xét nghiệm ELISA. Hiện tượng dương tính giả là do phản ứng không đặc hiệu (non-specific reaction) của kháng thể (Anti-CAP antibody) với các chất nền (matrices) trong dịch chiết. Trong trường hợp này có thể rút ra nhận xét rằng tinh bột có trong mẫu là tác nhân chính dẫn đến phản ứng không đặc hiệu và gây ra dương tính giả. Tỉ lệ dương giả đối với thuỷ sản khô cũng khá cao (18,2%), đặc biệt thuờng có hiện tượng tạo nhũ trong giai đoạn làm sạch dịch chiết bằng hexan. Hiện tượng này có lẽ do ảnh hưởng của các chất phụ gia thêm vào để bảo quản hàng thuỷ sản khô. Các sản phẩm dạng mắm gây ra một tỷ lệ dương tính giả rất cao (43,3%), cho thấy cần phải có qui trình xử lý mẫu chuyên biệt cho các đối tượng này. Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỷ lệ dương giả Kết quả thực nghiệm về tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng Elisa và tỉ lệ dương tính giả được tổng hợp tại bảng 2.2. Lọai thủy sản Số mẫu phân tích Giá trị hàm lượng CAP xác định bằng ELISA ≥0.3 ppb ≥0.5 ≥1 ppb Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Số lượng Tỷ lệ (%) Cá các loại 7255 15 0.21 7 0.10 2 0.03 Tôm các loại 4253 7 0.17 1 0.02 1 0.02 Cua, ghẹ 606 3 0.55 2 0.37 1 0.18 Nhuyễn thể 600 - 0.00 - 0.00 - 0.00 Thủy sản tẩm bột 302 4 1.36 1 0.34 0 0.00 Thủy sản khô các loại 242 13 7.18 11 6.08 8 4.42 Chả giò, há cảo 125 4 4.26 3 3.19 1 1.06 Mắm hải sản các loại 35 4 13.33 1 3.33 0 0.00 Bảng 2.2. Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỷ lệ dương giả Với hàm lượng CAP có giá trị từ 0.3ppb trở lên (tương đương mức qui định của EU), thì tỉ lệ dương giả giảm mạnh, đặc biệt thuỷ sản tẩm bột (từ 18,2% còn 1,36%) và không có dương giả đối với nhuyễn thể. Với những kết quả nêu trên có thể đưa ra nhận định rằng hiện tượng phát hiện dương tính giả trên xét nghiệm ELISA là phổ biến đối với tất cả các loại mẫu thủy sản. Tuy nhiên mức độ ảnh hưởng của nền mẫu tới kết quả của phép thử ELISA là khác nhau giữa các loại thủy sản khác nhau. Ảnh hưởng của nền mẫu đối với đối tượng thủy sản khô, các loại thực phẩm dạng tẩm bột, phối chế (chả giò, há cảo …) là rất đáng kể. Tuy nhiên ở hàm lượng phát hiện là >0,3ppb tỉ lệ này là chấp nhận được cho tất cả các loại nền mẫu khác nhau (ngoài trừ mắm). Phương pháp xác định dư lượng kháng sinh streptomycin [7] 2.2.1 Đặc tính chung Streptomycin là 1 bazơ hữu cơ chiết ra từ nấm streptomyces globisporus streptomyxini hay từ các loài sinh vật khác hoặc có được bằng các phương pháp tổng hợp. Các streptomycin đều tạo muối với acid vô cơ. Các loại muối của kháng sinh thường là sunfat, clohydrat, photphat và có cả phức chất canxiclorua của streptomycin clohydrat. Các muối này tan trong nước, hầu như không tan trong clorofooc, cồn và Ethel. 2.2.2 Nguyên tắc Thuỷ phân streptomycin bằng kiềm cho maltol là Methyl – 3 – hydroxyl – 7 pyron. Sự tạo thành maltol xảy ra hoàn toàn định lượng cho phép xác định được streptomycin Maltol sinh ra được tách khỏi hỗn hợp thủy phân bằng cách dùng clorofooc để chiết khỏi dung dịch mẫu trong môi trường axit, sau đó giải chiết maltol bằng dung dịch kiềm trong nước. Cho maltol tác dụng với phèn sắt (III) amonium, dung dịch 2% sẽ sinh ra phức màu đỏ tía đặc trưng và đo mật độ quang của phức màu này ở sóng 525 nm để xác định streptomycin. Nồng độ của streptomycin được xác định theo phương pháp đường chuẩn. 2.2.3 Lấy mẫu Theo TCVN 4833 – 89 (ST SEV 2433 – 80) 2.2.4 Dụng cụ, thiết bị và hoá chất a. Dụng cụ, thiết bị Hình 2.2 Máy trắc quang UV-VIS Hình 2.3: Cuvét thủy tinh có chiều dày 2 cm Hình 2.4: Máy xay sinh tố Hình 2.5: Máy ly tâm Hình 2.6: Bình định mức các loại Hình 2.7: Pipet các loại Hình 2.8: Phễu chiết cỡ 250 ml Và một số dụng cụ khác b. Hoá chất Dùng hoá chất có độ tinh khiết phân tích - Axit clohydric, dung dịch 1M - Natrihydroxyt, dung dịch 1N - Thuốc thử: phèn sắt (III) amonium, dung dịch 2% trong axit sunfuric 1N - Clorofooc - Dung dịch gốc tiêu chuẩn streptomycin sunphat nồng độ 1mg/ml - Nước cất 2 lần 2.2.5 Tiến hành thử Chuẩn bị mẫu phân tích Mẫu thịt cần phân tích được thái nhỏ, nghiền mịn, trộn đều và cân 1 lượng a = 20g cho vào máy xay sinh tố. Thêm 10 ml nước cất vào và cho máy chạy trong 5 phút. Cho 5 ml axit clohydric 1M vào và định mức đến 50 ml bằng nước cất. Đun trong bếp cách thuỷ sôi trong 10 phút. Để nguội, ly tâm lắng cặn, lấy dung dịch nước trong cho vào phễu chiết, thêm 10 ml clorofooc, lắc trong 10 phút sau đó để yên trong 15 phút cho phân lớp hoàn toàn trong phễu chiết rồi tách lấy tướng hữu cơ vào phễu chiết khác, thêm 2 ml natrihydroxyt 1N và 4 ml thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2% trong axit và nước cất đến 20 ml. Lắc mạnh trong 30 phút, sau đó để yên trong 20 phút rồi tách lấy phần dung dịch nước. Dung dịch này dùng để đo mật độ quang, xác định streptomycin ở bước sóng 525 nm. Pha dãy chuẩn Dùng dung dịch gốc tiêu chuẩn của streptomycin sunphat nồng độ 1 mg/ml, tính toán lượng phù hợp để pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1 – 0,5 – 1,0 – 1,5 – 2,0 – 2,5 μg/ml trong các bình định mức có thể tích 20 ml sau đó thuỷ phân bằng kiềm, đun cách thuỷ cho sôi 10 phút, để nguội rồi cho 2 ml dung dịch thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2%, định mức bằng nước cất đến 20 ml rồi để sau 20 phút mới tiến hành đo. Mẫu trắng Mẫu trắng phải được chuẩn bị cùng một điều kiện như mẫu phân tích nhưng thay mẫu phân tích trên bằng nước cất sao cho có cùng thể tích Tiến hành thử + Đặt sóng đo và bật máy chạy cho ổn định (5 phút); + Đo mật độ quang của mẫu chuẩn và mẫu phân tích ở bước sóng 525 nm bằng Cuvét có chiều dày 2 cm. Dùng mẫu trắng ở kênh so sánh làm mẫu so sánh và đo mỗi mẫu 3 lần; + Lập đồ thị đường chuẩn theo hệ toạ độ D – C. Trong đó D là mật độ quang của dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ C tương ứng ; + Xác định nồng độ Cx của chất phân tích theo đường chuẩn đã dựng được. Tính kết quả Hàm lượng của streptomycin trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau: Co = (Cx .V) / a Tính bằng g/g Trong đó: a là lượng mẫu cân (ở đây a = 20 g) V là thể tích pha mẫu (V = 20 ml) Cx là nồng độ streptomycin xác định được theo đường chuẩn Phụ lục: Cách pha dãy chuẩn Sử dụng dung dịch gốc tiêu chuẩn của streptomycin có nồng độ 1mg/ml (gọi là dung dịch A) Pha dung dịch streptomycin nồng độ 10 μg/ml: lấy 1ml dung dịch A, pha loãng và định m bằng nước cất đến 100 ml (dung dịch này gọi là B) Pha dãy dung dịch chuẩn: Lấy 6 bình định mức có thể tích 20 ml cho lần lượt vào các bìnhsố 1 đến số 6 một lượng như sau: 0,2 – 1,0 – 2,0 – 3,0 – 4,0 – 5,0 ml dung dịch B. Thêm vào mbình 2 ml natrihydroxyt 1N và lượng nước đến 10 ml. Đun cách thuỷ cho sôi để thủy phtrong 10 phút. Để nguội ở nhiệt độ phòng, thêm 4 ml thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2 trong axit, lắc kỹ và định mức bằng nước cất đến 20 ml. Như vậy, ta được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ là : 0,1 – 0,5 – 1,0 – 1,5 – 2,0 – 2,5 μg/ml. 2.3 Phân tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm bằng phương pháp ELISA [15] Quinolone là một trong những nhóm kháng sinh tổng hợp hoá học có khả năng khuyếch tán tốt trong mô bào, nhanh chóng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn thông qua sự ức chế tổng hợp ADN (Brown, 1996) do đó được sử dụng phổ biến và hiệu quả trong cả nhân y và thú y (Appelbaum và Hunter, 2000; Crumplin và Smith, 1976; Emmerson và Jones, 2003). Tuy nhiên việc sử dụng nhóm kháng sinh này trong chăn nuôi thú y và thuỷ sản có tác dụng xấu đến môi trường và sức khoẻ cộng đồng (WHO, 1998). Những năm gần đây, ngành thuỷ sản Việt Nam đã vượt qua những rào cản an toàn thực phẩm góp phần đưa sản phẩm thuỷ sản thâm nhập vào 106 nước, trong đó có những thị trường khó tính như châu Âu, Mỹ, Nhật Bản. Giá trị kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản trung bình hàng năm giai đoạn 2001-2007 tăng trên 10%. Năm 2007 đạt trên 3,76 tỷ USD (tăng 12% so với năm 2006) trong đó tôm đông lạnh vẫn là mặt hàng xuất khẩu chiến lược quan trọng với khối lượng đạt 145 nghìn tấn (năm 2006 là 143,6 nghìn tấn) với giá trị đạt 1,37 tỷ USD, tăng 2,65% so với năm 2006 (Thông tin khoa học công nghệ và kinh tế Thuỷ sản,số 1 năm 2008). Nhưng thực tế số lô hàng thuỷ sản bị các nước nhập khẩu phát hiện có dư lượng kháng sinh vẫn còn cao (NAFIQAVED, 2007). Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế của các doanh nghiệp mà quan trọng là còn ảnh hưởng đến đến uy tín chất lượng hàng thuỷ sản Việt Nam (Bộ Thuỷ sản, 2006). Trước tình hình đó, Bộ Thuỷ sản (nay là Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) đã ban hành một số qui định và nhiều chỉ thị để hướng dẫn kiểm soát dư lượng, trong đó Quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/02/2005 và số 26/2005/QĐ-BTS ngày 18/8/2005 liên quan đến danh mục hoá chất và kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thuỷ sản. Thế nhưng, kết quả điều tra thực tế cho thấy việc sử dụng kháng sinh trong nuôi tôm vẫn tiếp diễn và phổ biến nhất là nhóm quinolone (Nguyễn Thanh Phương và cộng sự, 2006; Phạm Kim Đăng và cộng sự, 2007). Hơn nữa, để phát triển và tăng trưởng bền vững, bên cạnh các thị trường xuất khẩu, ngành thuỷ sản đã chú ý đến tiềm năng thị trường nội địa. Nhưng việc kiểm soát dư lượng các mặt hàng nội địa chưađược quan tâm đúng mức gây ảnh hưởng đến tâm lý và sức khoẻ người tiêu dùng. Để góp phần bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng, bảo vệ môi trường và tăng cường kiểm soát dư lượng kháng sinh, việc đánh giá khả năng thích ứng các phương pháp phân tích, đặc biệt các phương pháp đặc hiệu như ELISA là rất cần thiết. Mục đích của nghiên cứu nhằm đánh giá khả năng ứng dụng phương pháp ELISA trong phân tích tồn dư quinolone trong tôm tại một số tỉnh miền Bắc. 2.3.1 Nguyên liệu Mẫu trắng: là mẫu tôm không chứa nhóm kháng sinh quinolone đã được khẳng định bằng phương pháp sắc ký lỏng phổ khối (LC-MS/MS) tại phòng thí nghiệm phân tích thực phẩm - Bộ môn Khoa học thực phẩm- Khoa Thú y - Đại học Liège, Vương quốc Bỉ. Dung dịch kháng sinh chuẩn: Kháng sinh chuẩn: tất cả 5 kháng sinh thuộc nhóm quinolones được sử dụng trong nghiên cứu này gồm enrofloxacin, flumequin, norfloxacin, Ciprofloxacin và sarafloxacin ở dạng bột và đều là sản phẩm của Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Dung dịch gốc 1 mg/ml: hoà tan trong methanol với sự có mặt của NH4OH 2M. Dung dịch dùng củng cố mẫu được pha loãng từ dung dịch gốc (1 mg/ml) bằng nước cất. Hỗn hợp methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch PBS pH 7,4 là hỗn hợp 9 gam NaCl, 7,78 gam Na2HPO4.2H2O và 0,75 gam KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất). Kít ELISA phân tích quinolone: 10 bộ kít thuộc 5 lô khác nhau do phòng thí nghiệm Hormonologie - CER, Marloie, Vương quốc Bỉ cung cấp. Mẫu kiểm tra thử nghiệm: Chín mươi mẫu tôm được lấy ngẫu nhiên 6 đợt độc lập vào 6 tháng khác nhau trong năm (tháng 5, 6, 7, 10, 11 và 12 năm 2006) tại các chợ 4 địa phương đại diện gồm Hà Nội, Quảng Ninh, Nam Định và Nghệ An. Mỗi địa phương, mỗi đợt lấy 3 mẫu tại các quầy ở các chợ khác nhau. Riêng Hà Nội, ngoài chợ mẫu còn được l