Đề tài Chỉ thị phân tử - Kỹ thuật AFLP (amplified fragment length polymorphisms)

CHỈ THỊ PHÂN TỬ KỸ THUẬT AFLP (Amplified fragment length polymorphisms) Giảng viên: TS. Nguyễn Thị Thu Liên Học viên: Nguyễn Hữu Nhân Nguyễn Bảo Triệu Huế - 12/2011 ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUẾ KHOA SINH HỌC NỘI DUNG TRÌNH BÀY Giới thiệu. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị. Ứng dụng. Kỹ thuật cDNA-AFLP. Ưu, nhược điểm Kết luận. Tài liệu tham khảo. Giới thiệu Kỹ thuật AFLP được phát triển bởi công ty KeyGene trong đầu những năm 1990 và đã trở thành một trong những công nghệ in dấu vân tay di truyền (fingerprinting) phổ biến nhất trên toàn thế giới. Kỹ thuật AFLP dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) và PCR để khuếch đại những đoạn DNA có chiều dài giới hạn sau khi được cắt hạn chế bởi enzyme cắt hạn chế. Phương pháp có độ nhạy cao trong việc tìm dấu vết của DNA của bất kỳ nguồn gốc nào hay sự phức tạp nào Có thể thực hiện với DNA của toàn hệ gen hay với cDNA (bản sao nguyên bản). Kỹ thuật AFLP được cấp bằng sáng chế vào năm 1991 và tại thời điểm này được ban hành ở nhiều quốc gia như Canada, Châu Âu, Nhật Bản, Úc và Mỹ. Hiện nay đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới. Nguyên lý của kỹ thuật AFLP DNA được phân giải bởi hai enzyme cắt hạn chế khác nhau. Phần nối (adapter) oligonucleotide được nối với những đầu tận cùng của các phân đoạn DNA. Tập con đặc trưng của các sản phẩm phân giải DNA được khuyếch đại, sử dụng kết hợp các primer chọn lọc. - Phát hiện sự đa hình có thể được thực hiện với các đồng vị phóng xạ, nhuộm các màu huỳnh quang hay nhuộm bạc. Hình 1.Tổng quan về kỹ thuật AFLP Nguyên lý của kỹ thuật AFLP Nguyên lý của kỹ thuật AFLP Enzyme cắt hạn chế (RE): Sử dụng các RE loại II Thường sử dụng hai enzyne cắt hạn hạn chế khác nhau: EcoRI và MseI Hai RE không cắt tại cùng một vị trí nhận biết MboI và Sau3AI BamHI: - Tất cả các RE sau khi cắt phải tạo ra đầu lồi Nguyên lý của kỹ thuật AFLP Enzyme cắt hạn chế (RE): Kết quả sau khi cắt bằng RE Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 2. Phần nối (adapter) Sau khi cắt bằng 2 RE, thì 2 đầu đoạn DNA được gắn các adapter bằng enzyme ligase Đoạn adapter gồm hai phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 3. PCR Mồi của PCR được thiết kế dự trên trình tự adapter và một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide Chỉ những phân đoạn nào chứa cả trình tự adapter và trình tự chọn lọc mới được chọn lọc Chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích Quá trình PCR gồm hai phản ứng (preselective PCR) và selective PCR Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 3. PCR Preselective PCR: Sử dụng primer + 1 nucleotide Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 3. PCR Selective PCR: Sử dụng primer + 1 + 2 nucleotide Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 4. Phát hiện sự đa hình Trường hợp primer có gắn đồng vị phóng xạ hoặc hóa chất phát quang thì được phát hiện bằng hệ thống PCR có thu và xử lý tín hiệu phát quang Nguyên lý của kỹ thuật AFLP 4. Phát hiện sự đa hình Trường hợp primer bình thường thì sau khi chạy PCR, mẫu sẽ được điện di trên gel và nhộm gel Pristionchus pacificus: C: California P: Poland H: Hawaii W: Washington Kỹ thuật cDNA-AFLP     * Phân lập mRNA từ mẫu quan tâm     * Sao chép ngược của mRNA bằng cách sử dụng primer oligo-dT tổng hợp cDNA     * Các bước tiến hành cắt hạn chế, PCR, phát hiện đa hình tương tự như ở DNA. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị Nguồn Nước cất và (hoặc) nước đã khử ion (deionised water) - Hoá chất Trang thiết bị Tủ lạnh, tủ đông sâu Laminar có dòng hút khí Máy li tâm Máy PCR Máy đo pH Cân chuẩn Máy điều chỉnh nguồn điện Máy điện di phương thẳng đứng Lò hâm (hotplate) Máy giải trình tự tự động hoặc lò vi sóng (Microwave) - Máy soi bằng cực tím (UV transilluminator) Dụng cụ Các loại Micropipette và pipette tip tương ứng (đầu côn) Các loại tube eppendorf Cối chày sứ Găng tay Ứng dụng - Đánh giá đa dạng di truyền - Phân tích độ dài di truyền - Kiểm tra dấu hiệu di truyền - Phân tích bộ sưu tập nguồn gene (germplasm collections) - Xây dựng bản đồ gene - Quản lý các chỉ thị thăm dò Ưu điểm: AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen. Kỹ thuật này chỉ cần lượng ít DNA ban đầu Không cần biết trước trình tự đích Có độ lặp lại phản ứng cao Các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài Khuếch đại có chọn lọc một lượng lớn các đoạn DNA đa hình trong một phản ứng PCR, phù hợp cho việc phân tích đa dạng giữa các quần thể có quan hệ gần nhau. Ưu, nhược điểm Ưu, nhược điểm Nhược điểm: AFLPs tạo ra một lượng lớn thông tin cần phải được phân tích tự động, vì thế cần sự giúp đỡ của kỹ thuật máy tính cao AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp Trong xây dựng bản đồ di truyền, AFLPs thường tập trung lại ở vùng centromeres và telomeres Nhân viên phải có kỹ thuật phòng thí nghiệm và đặc biệt là phân tích dữ liệu Kết luận Kỹ thuật AFLP dựa vào sự khuyếch đại chọn lọc các phân đoạn hạn chế sau khi phân giải DNA Nó thăm dò sự đa hình gây ra bởi những thay đổi trong những điểm hạn chế hay những vùng lân cận - Kỹ thuật này tạo nên một lượng lớn bands trong một lần chạy, và các bước tiến hành đòi hỏi kỹ thuật cao Thank you!!!