Đề tài Chiết xuất, phân lập alkaloid từ sen

Loại bỏ e.The ether was emovedther dưới áp suất giảm, thu được các bột rắn 1.15 g (neferine) and 0.513 g (isoliensinine).chứa 1,15g (neferine) và 0,513g (isoliensinine).According to the literature, 2.3. Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ của vi sóng kết hợp với dung dịch ion (Ionic liquid-based microwave-assisted extraction: ILMAE) Tổng quan: Gần đây, các dung dịch ion (ILs) đã mở rộng sang lĩnh vực phân tích hóa học, bao gồm cả điện hóa (electrochemistry), khoa học phân tích, khối phổ, và quang phổ. Do sự khác biệt về tính năng, quá trình tiền xử lý mẫu dưới sự hỗ trợ của Ils đã được nghiên cứu rất nhiều, chẳng hạn như chiết xuất lỏng-lỏng, vi chiết xuất pha lỏng, vi chiết xuất pha rắn và hệ thống chiết xuất hai pha lỏng- lỏng. Theo xu hướng nghiên cứu chung trong việc phát triển các phương pháp chiết xuất, đã có nhiều nghiên cứu kết hợp phương pháp MAE với ILs và áp dụng phương pháp cải tiến này để chiết xuất các alkaloid phenolic từ tâm sen rất hiệu quả. Phương pháp chiết xuất dưới sự hỗ trợ của vi sóng kết hợp với dung dịch ion (Ionic liquid-based microwave-assisted extraction: ILMAE) đã được áp dụng thành công để chiết xuất hiệu quả các alkaloid phenolic có trong tâm sen. Các dung dịch ion được biết đến bao gồm một loạt bốn anion, bốn dẫn xuất 1-alkyl-3-methylimidazolium khác nhau trong chuỗi dài hydrophobic. Các kết quả cho thấy các anion khác nhau có tác dụng rõ ràng trên hiệu quả chiết xuất. Ngoài ra, ảnh hưởng của một số tham số vi sóng, chẳng hạn như năng lượng chiếu xạ, thời gian chiết xuất và tỷ lệ rắn - lỏng, cũng được nghiên cứu. Khi các điều kiện được tối ưu hóa , phương pháp cải tiến đã được đánh giá so với phương pháp chiết xuất hồi lưu (HRE) và MAE thông thường. Kết quả ghi nhận được là giảm thời gian chiết xuất đáng kể (từ 2h đến 90s) và điều đáng chú ý là hiệu quả chiết xuất rất cao (tăng từ 20% - 50%). Ngoài ra, phương pháp cải tiến này đã được xác nhận bởi tỷ lệ phục hồi, hệ số tương quan (R2), và độ sao chép lại (reproducibility) (RSD, n = 5), tương ứng trong khoảng 98-105%, 0,9994-0,9998, và 1,2 - 5,4%. Chiết xuất Thiết bị Phân tích HPLC với độ dài sóng 2450-MHz, toàn bộ hệ thống được chạy ở áp suất không khí và có thể được làm việc ở công suất tối đa của 700W. Tổng hợp và tính chất của các loại dung dịch ion của 1,3-dialkylimidazolium: ILs của 1-alkyl-3-methylimidazolium, bao gồm: 1-butyl - 3-methylimidazolium clorua ([C4MIM] Cl), 1-butyl-3 methylimidazolium bromua ([C4MIM] Br), 1-butyl-3-methylimidazoliumtetrafluoroborate ([C4MIM] [BF4]), 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate ([C4MIM] [PF6]), 1-ethyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate ([C2MIM] [BF4]), 1-hexyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate ([C6MIM] [BF4]), 1-octyl-3 - methylimidazolium tetrafluoroborate ([C8MIM] [BF4]) Chúng được tổng hợp theo các qui trình mẫu. Tất cả ILs đã được sấy khô khoảng 12h dưới chân không ở 700C và độ tinh khiết của ILs đã được kiểm tra bởi quang phổ 1H NMR và 13C NMR. Các đặc tính của quang phổ NMR đã cho thấy không có tạp chất cơ học trong ILs. Các chất đã được xác định bằng cách sử dụng thuốc thử Karl Fischer Titration. Độ nhớt được đo bằng máy đo độ nhớt. Tỷ trọng của ILs đã được đo bằng cách lấy chính xác thể tích 1ml bằng bình định mức, đánh dấu với mỗi IL và sau đó xác định trọng lượng. Ngoài ra, phương pháp nitrat bạc cho thấy không có nhũ tương trong [BF4] ILs. Những hằng số vật lý của ILs được liệt kê trong bảng 1. Bảng 1. Some physicochemical properties of studied ILs Ionic liquid Solubility in water Water content (ppm) Density ( 250C, g/ml, dried) Viscosity(Cp, 250C) Measured Literature Measured Literature Measured Literature [C2MIM] BF4 Miscible 990 - 1.24 1.25 78 46/66 [C4MIM] Cl Miscible 2320 220 1.10 1.08/1.10 Solid Solid [C4MIM] Br Miscible 2080 - 1.32 - Solid - [C4MIM] BF4 Miscible 4200 4530 1.16 1.12/1.17 248 219/233 [C4MIM] PF6 18 g/l 610 590 1.36 1.36 493 450 [C6MIM] BF4 Partly soluble 1900 - 1.23 1.21 380 310 [C8MIM] BF4 Partly soluble 1250 - 1.10 1.11 492 440 Chiết xuất hỗ trợ vi sóng kết hợp vói Ils: Lấp hệ thống sinh hàn trong suốt quá trình chiết xuất MAE. Cân 1g mẫu đã được sấy khô trộn với 10ml các dung dịch IL khác nhau, và sau đó chiếu xạ vi sóng. Các điều kiện chiết xuất đã được tối ưu hóa. Sau mỗi lần chiếu xạ, các hợp chất thu được làm lạnh đến 250C, sau đó pha loãng với 50ml nước cất hai lần, và lọc qua một màng lọc có kích thước 0,45mm và tiến hành phân tích HPLC. Phân tích HPLC và định lượng: Pha loãng dịch chiết, tiêm trực tiếp vào thiết bị của hệ thống sắc ký lỏng. Dung môi pha động là dùng đồng thời hỗn hợp 2 dung dịch: dd triethylamine 0,1% (A) và CH3CN (B). Tỉ lệ dung môi được thiết lập như sau: 5 phút đầu dd B chiếm 60% hh dung môi, 5 phút sau dd B chiếm 30%; tốc độ dòng là 0.8ml/phút. Độ dài bước sóng 280nm và thể tích tiêm là 20ml. Theo những điều kiện này, 3 alkaloid phenolic được tách biệt nhau. Việc xác định đỉnh hấp thu được thực hiện bằng cách so sánh với thời gian lưu của mẫu chuẩn. Việc so sánh các sắc ký đồ của ba alkaloid phenolic với sự có mặt của Ils so với dd chuẩn đã được liệt kê trong hình 1. Nhận thấy rằng không có bất kỳ sự ảnh hưởng nào của các IL đối với quá trình phân tích, điều đó được thể hiện trên sắc ký đồ, thứ tự rửa giải và thời gian rửa giải. Hình 1: Sắc ký đồ HPLC và cấu trúc hóa học của Linensinie, Isolinensine, Neferine trong dịch chiết ion[C6MIM][BF4] và của Linensinie, Isolinensine, Neferine chuẩn (hình nhỏ) Kết quả và thảo luận Các thử nghiệm về ILs: Cấu trúc của ILs ảnh hưởng đáng kể tính chất hóa lý của nó, điều đó có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất các chất phân tích. Để đánh giá hiệu quả chiết xuất của các dẫn chất 1-alkyl-3-methylimidazolium (xem Bảng 1) trong quy trình MAE, tác dụng của các anion và độ dài chuỗi alkyl của cation trên hiệu quả chiết xuất đã được nghiên cứu. Từ Bảng 1 có thể rõ ràng nhận thấy rằng trong các ILs được giới thiệu ở đây, sự hiện diện của các anion có ảnh hưởng rất lớn. Như vậy, 1-butyl-3-methylimidazolium ILs với bốn anion khác nhau (Cl-, Br-, BF4-, PF6-) đã được thử nghiệm. Hiệu quả chiết xuất ba hợp chất chính cho thấy rằng BF4- hiệu quả hơn so với các anion khác trên mẫu nghiên cứu. Ngược lại, [C4MIM] [PF6] cho thấy không có hiệu quả vào việc chiết xuất, điều này có thể quy cho tính kỵ nước của nó. Theo các kết quả nghiên cứu, với cùng một anion là BF4 -, việc tăng độ dài chuỗi alkyl từ ethyl đến octyl của cation 1-alkyl-3 - methylimidazolium có ảnh hưởng không đáng kể trên việc chiết xuất. Mặc dù đã có báo cáo cho rằng các thành phần dịch chiết được của BF4 - IL không những phụ thuộc vào độ dài của chuỗi alkyl, mà còn bị ảnh hưởng khi nồng độ ILs tương đối thấp (0.5M). Để xem xét sự phụ thuộc vào độ dài của chuỗi alkyl trong hiệu quả chiết xuất, hai IL, [C4MIM] [BF4] và [C6MIM] [BF4], được lựa chọn cho việc đánh giá này (xem Hình.2a). Hơn nữa, nồng độ của hai IL cũng đã được nghiên cứu. Kết quả được hiển thị trong Hình.2b chỉ ra rằng: nồng độ thích hợp của [C4MIM] [BF4] tối đa là 1.5M, trong khi [C6MIM] [BF4] tối đa là 1M. Hiệu quả chiết xuất sẽ giảm đáng kể khi tăng nồng độ của Ils. Hình 2: (a) Ảnh hưởng của Ils ( [C4 MIM][BF4] 0.5M và [C6 MIM][BF4] 0.5M) đối với hiệu suất chiết. (b)Ảnh hưởng của nồng độ [C4 MIM][BF4] và [C6 MIM][BF4] đối với hiệu suất chiết. Với khối lượng mẫu 1.0g, thể tích dịch chiết 10ml, cường độ chiếu xạ 280W, thời gian chiết 120s. Tối ưu hóa quy trình ILMAE: Phương pháp này được dùng khi đã tối ưu hóa ba tham số có ảnh hưởng lớn đến quy trình chiết xuất: năng lượng bức xạ, thời gian chiết và tỷ lệ rắn – lỏng (những kết quả của [C6MIM][BF4] được hiển thị trong Hình 3). Đối với [C4MIM][BF4], hiệu quả chiết xuất có thể đạt giá trị cực đại với năng lượng bức xạ là 280W. Đối với [C6MIM][BF4 ], mặc dù nó có thể cho hiệu quả cao hơn một chút khi chiết liensine ở 460W, hình như nó có thể cho hiệu quả chiết tương đối cao hơn khi chiết isoliensine và neferine, năng lượng bức xạ là 280W (40% trị số cực đại). Hình 3: Ảnh hưởng của cường độ chiếu xạ vi sóng (a), thời gian chiết (b), tỉ lệ dược liệu – dung môi (c) đối với hiệu suất chiết với nồng độ [C6 MIM][BF4] là 1.0M, khối lượng mẫu 1.0g. Thời gian chiết xuất dùng bức xạ vi sóng thay đổi trong khoảng 5-240s, hai dịch chiết có chứa dung dịch ion được xử lý tương tự. Hiển nhiên thấy rằng thời gian chiết tối ưu khoảng 90s. Đồng thời, hiệu quả chiết xuất tăng khi tỷ lệ rắn – lỏng thay đổi từ 1: 5 đến 1: 10 ở cả hai IL. Khi tăng đến 15 mL và sau đó là 20 mL [C4MIM][BF4] hiệu quả chiết tăng không có ý nghĩa. Tuy nhiên, đối với [C6MIM][BF4], hiệu quả giảm đáng kể khi tỷ lệ rắn- lỏng thay đổi từ 1: 15 đến 1: 20. Điều này là do khi tăng độ dài chuỗi alkyl, kết quả làm giảm tính tan trong nước và làm tăng độ nhớt. Từ đó cho thấy rằng tỷ lệ rắn – lỏng là 1: 15 cho [C4MIM][BF4] và 1: 10 cho [C6MIM][BF4] được chấp nhận trong sự nghiên cứu này. So sánh các phương pháp ILMAE với phương pháp thông thường: Analytes Proposed methods ILMAE ([C4MIM][BF4], n = 5) ILMAE ([C6MIM][BF4], n = 5) Observed values (mg/g) Recovery yields (%) Observed values (mg/g) Recovery yields (%) Mean SD Mean SD Mean SD Mean SD Liensinine 1.053 0.057 98.0 2.11 0.943 0.042 100.2 3.47 Isoliensinine 5.316 0.071 105.0 0.80 5.127 0.114 105.0 1.53 Neferine 15.76 0.329 104.9 0.84 14.69 0.324 104.6 0.30 Dựa trên 2 bảng kết quả, phương pháp ILMAE có thể nâng cao đáng kể tăng hiệu quả chiết xuất (20% - 50%) 3 hoạt chất và chiết xuất trong thời gian tổng cộng từ 2h đến 90s. Nhằm tiếp tục chứng minh việc sử dụng ILS, các phương pháp đề xuất sau đó được so sánh với quá trình MAE thông thường trong các điều kiện tương tự. Kết quả thể hiện trong Bảng 2 chỉ ra rằng hiệu quả chiết xuất của MAE thông thường là hơi cao hơn phương pháp HRE thường; tuy nhiên, kết quả thu được nó vẫn thấp hơn nhiều (20-50%) so với phương pháp cải tiến ILMAE. Điều này có nghĩa là việc kếp hợp ILs trong MAE có tiềm năng rất lớn, và là một phương pháp nhanh chóng và có hiệu quả cho việc chiết xuất các alkaloid phenolic từ Tâm sen. Bảng 2.Comparative study of extraction efficiency using different extraction methods Conventional methods Regular MAE (MeOH 80%, n=3) HRE (MeOH 80% , n=3) Observed values (mg/g) Recovery yields (%) Observed values (mg/g) Recovery yields (%) Mean SD Mean SD Mean SD Mean SD 0.621 0.017 103.2 2.43 0.565 0.024 108.2 4.76 4.012 0.122 102.9 1.06 3.573 0.080 106.5 3.84 12.02 0.494 104.0 1.51 10.68 0.130 109.8 3.21 Phân tích hiệu suất của phương pháp được đề xuất: Để đánh giá hiệu suất phương pháp MAE kết hợp với ILs, một vài tham số như tính tuyến tính (linearity), độ sao lại (reproducibility), và tỷ lệ phục hồi được xác định theo các điều kiện tối ưu (xem Bảng 3). Giới hạn phát hiện (LODs) và giới hạn của định lượng (LOQs) từ 2,16-2,56 mg/l và 7,20 - 8,54 mm/l, hệ số tương quan của phương trình hồi qui là 0,9994 - 0,9998. Nghiên cứu độ sao chép lại được thực hiện bằng việc chiết xuất lặp đi lặp lại (1,0g mẫu mỗi lần) với cả phương pháp cải tiến và truyền thống. Từ bảng 3 cho thấy, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của phương pháp cải tiến là 1,2% - 5,4%. Với tỷ lệ phục hồi từ 98,0% - 105,0% và RSD thấp hơn 5,4%, điều này cho chúng ta thấy rằng, hiện nay phương pháp mới cải tiến này rất đáng tin cậy. Bảng 3: Phương trình đường thẳng, hệ số tương quan, miền giá trị, LOD, LOQ của Linensinie, Isolinensine, Neferine chiết với sự hỗ trợ vi sóng kết hợp Ils Chất Phương trình đường thẳng Hệ số tương quan Miền giá trị (mg/l) Giới hạn phát hiện (LOD) (µg/ml) Giới hạn định lượng (LOQ) (µg/ml) Linensinie y =14.038x –0.453 R2 = 0.9997 x = 5.05–2020 2.56 8.54 Isolinensine y = 16.657x + 48.740 R2 = 0.9994 x = 4.86–2430 2.16 7.20 Neferine y = 14.472x + 65.959 R2 = 0.9998 x = 8.13–1300 2.49 8.29 Kết luận Nghiên cứu này đã chứng minh rằng các quá trình chiết xuất dưới sự hỗ trợ của vi sóng kết hợp với Ils cho hiệu quả chiết xuất rất tuyệt vời. So với HRE và MAE thông thường, phương pháp cải tiến này cho hiệu quả chiết xuất cao hơn, và rõ ràng là giảm thời gian chiết xuất đáng kể.Các kết quả kiểm tra cho thấy phương pháp này thích hợp cho việc chiết xuất hiệu quả các alkaloid phenolic từ sen. 2.4. Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (Ultrasound-assisted extraction): Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm ngày càng chứng tỏ có nhiều lợi ích trong việc chiết xuất các hợp chất từ dược liệu. Tuy nhiên, nhóm chúng tôi chưa tìm được quy trình chiết xuất cụ thể. Phần trình bày dưới đây là các thí nghiệm nhằm xây dựng quy trình chiết Liensinine, Isoliensinine và Neferin từ tâm sen, cho thấy phương pháp chiết xuất có hỗ trợ của siêu âm cho hiệu quả cao khi chiết xuất các alkaloid này. Xây dựng quy trình chiết LIE, ISO, và NEF từ tâm sen Thiết bị và điều kiện tiến hành HPLC - Chất chuẩn cho LIE, ISO và NEF được chuẩn bị sẵn. Độ tinh khiết của các hợp chất này > 98% (xác định độ tinh khiết bằng HPLC, NMR và MS). - Dung môi chạy HPLC là Acetonitrile (được mua từ Công ty TNHH Hóa chất và Hoá chất Thượng Hải, Thượng Hải, Trung Quốc) - Nước được sử dụng trong các thí nghiệm là Milli-Q Grade (Millipore, Bedford, MA, USA). - Các hóa chất sử dụng đạt độ tinh khiết. - Tất cả các mẫu thử và các dung môi được sử dụng cho các phép đo HPLC được lọc qua màng lọc (0,45 μm) và loại khí trước khi sử dụng. - Hệ thống HPLC Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Palo Alto,CA, Hoa Kỳ) được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm. Hệ thống này được trang bị bộ phận tiêm mẫu tự động với một khay chứa mẫu được làm mát, một hệ thống phân phối dung môi và một hệ thống kiểm soát nhiệt độ cột. - Bước sóng phát hiện là 282 nm. Tại bước sóng này, dectector phát hiện được cả 3 hợp chất. - Thể tích tiêm mẫu là 10 μl. - Nhiệt độ cột là 30oC. - Tốc độ dòng là 1ml/phút cho tất cả thí nghiệm. - Cột phân tích có kích thước 4.6mm x 150mm, được nạp 5μm silica C18. - Dung môi rửa giải (pha động) là hỗn hợp acetonitrile và triethylamine 0.1% . Xây dựng quy trình Để xây dựng được quy trình chiết ba alkaloid từ tâm sen, cần tiến hành các thí nghiệm để khảo sát ảnh hưởng của các dung môi, ảnh hưởng của các phương pháp chiết, thời gian chiết cũng như tỉ lệ dung môi- dược liệu. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết - Phương pháp chiết: phương pháp cất hồi lưu (refluxing). - Cố định tỷ lệ dung môi - dược liệu và thời gian chiết - Cách tiến hành + Cân 1,0 g tâm sen, cho vào một becher 100ml. + Tiến hành chiết với 7 dung môi: ethanol 95% (1); ethanol 70% (2); ethanol 50% (3); methanol 90% (4); dung dịch acid hydroclorid 0,25% (5); dung dịch acid sulfuric 0,25% (6) và cloroform (7). + Mỗi dịch chiết thu được cho vào một bình định mức 100ml và bổ sung vừa đủ 100 ml bằng dung môi tương ứng. + Lần lượt lọc các dịch chiết qua lọc 0,45μm + Tiến hành phân tích bằng HPLC, mỗi dịch chiết được lặp lại 4 lần. - Kết quả Hàm lượng LIE, ISO, NEF và TA (total alkaloid = alkaloid toàn phần= tổng hàm lượng LIE, ISO, NEF) khi chiết với 7 dung môi được liệt kê ở Bảng 4. Bảng 4: Hàm lượng (g/100g) của LIE, ISO, NEF và TA khi chiết với các dung môi Dung môi Hàm lượng (g/100g) LIE ISO NEF TA Ethanol 95% 0.311 0.263 0.839 1.413 Ethanol 70% 0.318 0.279 0.882 1.479 Ethanol 50% 0.282 0.213 0.667 1.162 Dung dịch acid hydroclorid 0,25% - 0.282 0.881 1.163 Dung dịch acid sulfuric 0,25% - 0.288 0.883 1.171 Methanol 90% 0.369 0.231 0.780 1.380 Cloroform 0.251 0.232 0.798 1.281 Ghi chú: - : sản phẩm bị phân hủy trong dịch chiết - Nhận xét: + Dịch chiết nước acid cho hàm lượng alkaloid khá cao, nhưng, LIE bị phân hủy khi chiết với dung dịch nước acid (nguyên nhân gây ra sự phân hủy của LIE có thể là do ảnh hưởng của nhiệt độ chiết). + Khi chiết với dung môi là ethanol 50% thì kết quả không khác biệt nhiều so với chiết bằng methanol 90% và chloroform. + Ethanol 70% cho hiệu suất chiết cao nhất. + Khi tăng nồng độ cồn hơn 70%, thì hàm lượng alkaloid thu được không thay đổi nhiều. Điều này có nghĩa là có thể chiết xuất với nồng độ cồn cao hơn 70%, tuy nhiên cần tránh xây dựng một quy thình chiết xuất với nồng độ cồn quá cao. Vì vậy, chọn dung môi là ethanol 70% . Thí nghiệm 2: So sánh các phương pháp chiết - Theo thí nghiệm trên, dung môi chiết đượ chọn là ethanol 70%. - Cố định tỷ lệ dung môi - dược liệu và thời gian chiết. - Cách tiến hành + Cân 1,0 g tâm sen, cho vào một becher 100ml. + Tiến hành chiết bằng bốn phương pháp: ngấm kiệt (Maceration), chiết hồi lưu (Refluxing), chiết với sự hỗ trợ của vi sóng (Microwave-assisted extraction), chiết với sự hỗ trợ của siêu âm (Ultrasound-assisted extraction). + Mỗi dịch chiết thu được cho vào một bình định mức 100ml và bổ sung dung môi (ethanol 70%) vừa đủ 100 ml. + Lần lượt lọc các dịch chiết qua lọc 0,45μm + Tiến hành phân tích bằng HPLC, mỗi dịch chiết được lặp lại 4 lần. - Kết quả Hàm lượng LIE, ISO, NEF và TA (total alkaloid = alkaloid toàn phần= tổng hàm lượng LIE, ISO, NEF) khi chiết bằng 4 phương pháp được liệt kê ở Bảng 5. Bảng 5: Hàm lượng (g/100g) của LIE, ISO, NEF và TA khi chiết bằng các phương pháp khác nhau Phương pháp chiết Hàm lượng (g/100g) LIE ISO NEF TA Ngấm kiệt 0.214 0.195 0.676 1.085 Chiết hồi lưu 0.312 0.264 0.873 1.449 Chiết có hỗ trợ vi sóng 0.231 0.230 0.791 1.252 Chiết có hỗ trợ siêu âm 0.294 0.265 0.866 1.425 - Nhận xét + Phương pháp cho hàm lượng alkaloid toàn phần cao nhất là chiết hồi lưu. + Hiệu suất chiết của phương pháp có hỗ trợ của siêu âm so với chiết hồi lưu là 98,3 % (chỉ chênh lệch 1.7%). + Hiệu suất chiết của 2 phương pháp ngấm kiệt và chiết có hỗ trợ của vi sóng so với chiết hồi lưu lần lượt là 74,9% và 86,4%. + Qui trình chiết với sự hỗ trợ của siêu âm đơn giản hơn nhiều so với quy trình chiết hồi lưu. Vì vậy chọn phương pháp chiết có sự hỗ trợ của siêu âm. Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol, thời gian chiết và tỉ lệ dung môi – dược liệu - Phương pháp chiết: chiết có sự hỗ trợ của siêu âm - Dung môi chiết: ethanol - Gọi nồng độ cồn, thời gian chiết, tỉ lệ dung môi – dược liệu lần lượt là x1, x2, x3 - Tiến hành thí nghiệm 15 lần với các giá trị x1, x2, x3 thay đổi (xem bảng 3). Kết quả - Ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất đối với hàm lượng LIE, ISO,NEF và TA được trình bày trong Bảng 6 . Bảng 6: Ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất đối với hàm lượng LIE, ISO, NEF và TA Thí nghiệm Các biến Hàm lượng (g/100g) x1 (%) x2 (phút) x3 LIE ISO NEF TA 1 60 10 20 0.288 0.208 0.718 1.213 2 60 20 20 0.290 0.216 0.724 1.230 3 80 10 20 0.297 0.223 0.735 1.254 4 80 20 20 0.326 0.249 0.786 1.361 5 70 10 10 0.305 0.243 0.753 1.301 6 70 10 30 0.312 0.238 0.781 1.331 7 70 20 10 0.300 0.238 0.760 1.297 8 70 20 30 0.317 0.257 0.810 1.384 9 60 15 10 0.262 0.214 0.690 1.166 10 80 15 10 0.269 0.219 0.712 1.201 11 60 15 30 0.267 0.225 0.709 1.201 12 80 15 30 0.319 0.243 0.783 1.345 13 70 15 20 0.309 0.250 0.793 1.352 14 70 15 20 0.306 0.248 0.787 1.341 15 70 15 20 0.300 0.246 0.810 1.356 - Nhận xét + Nồng độ cồn, thời gian chiết và tỷ lệ dung môi – dược liệu đều ảnh hưởng đến hàm lượng alkaloid toàn phần, đặc biệt là nồng độ cồn. + Sử dụng phương pháp phản ứng bề mặt (RSM = Response surface methodology), với sự hỗ trợ của chương trình tối ưu hóa ARSA (Accelerated random search algorithm), các điều kiện tối ưu là: nồng độ cồn 75%, thời gian chiết 20 phút và tỷ lệ dung môi – dược liệu là 30:1. 2.5. Phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng điều chế (Preparative counter-current chromatography: Preparative CCC): IntroductionGiới thiệuNelumbo nucifera GAERTN. Liensinine [4] a nd its analogues, isoliensinine [5] a nd ne-components of embryo of the seed of N . nucifera GAERTN.[12] . Since the first isolation of liensinine in 1962 [4] , theKể từ khi Liensinine được phân lập vào năm 1962, three alkaloids have received considerable attention becauseba alkaloid đã nhận được sự chú ý đáng kể vì đặc điểm nổi bật of their reputation of chemical and biological properties.về tính chất hóa học và sinh học. However, their pharmacological studies often suffer fromTuy nhiên, các nghiên cứu dược lý của chúng thường bị the limits of sample purity and sources.giới hạn do nguồn và độ tinh khiết của mẫu. To obtain pure com-Để có được những hợp chất tinh khiết pounds by conventional separation methods, such as columnbằng phương pháp tách thông thường, chẳng hạn như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng thì rất khó bởi vì cấu trúc của chúng tương tự nhau và tính chất hoá học không bền vững. Sắc ký phân bố ngược dòng là một kỹ thuật sắc ký phân bố lỏng - lỏng không sử dụng chất nền là chất rắn vì thế sẽ hạn chế được nhược điểm của chất rắn nền như sự mất mẫu do tính hấp phụ không thuận nghịch, làm mẫu mất tác dụng, không tinh khiết và gây hiện tượng kéo vệt. 0021-9673/$ – see front matter © 2004 Elsevier BV All rights reserved.doi:10.1016/j.chroma.2004.05.003Fig.Themethod has been successfully applied to the analysis andPhương pháp đã được áp dụng thành công để phân tích và separation of various natural and synthetic products [14–16] .tách nhiều loại sản phẩm tự nhiên và tổng hợp. Recently, we have developed a versatile type-J CCC withGần đây, các nghiên cứu đã phát triển CCC loại J đa năng với four upright multilayer coil columns arranged symmetricallybốn cột cuộn đa tầng thẳng đứng được bố trí đối xứng around the centrifuge axis [17] . Our primary experimentsquanh trục máy ly tâm, các thí nghiệm đã chứng minh rằng thiết bị CCC thẳng đứng rất hữu ích S. Wu et al.for large-scale isolation and purification of crude extracts oftrong việc phân lập và tinh khiết các dịch chiết thô của hợp chất natural products or synthetic compounds.hợptự nhiên hay tổng hợp ở quy mô lớn.So far, no report Cho đến nay, không có báo cáo nào công bố has been published on the use of CCC for the isolation andvề sử dụng CCC cho phân lập vàpurification of liensinine and its analogues. tinh khiết liensinine và hợp chất tương tự của nó. Do đó, this study, therefore, is to develop a CCC method for thenghiên cứu này là phát triển phương pháp CCC cho việc phân preparative isolation and purification of liensinine and itslập và tinh khiết liensinine và hợp chất tương tự tanalogues from embryo of the seed of N . nucifera GAERTN.ừ tâm Sen. 2.ExperimentalThử nghiệm 2.1.ApparatusThiết bị: The CCC isolation and purification of liensinine and itsCCC phân lập và tinh khiết Liensinine và các hợp chất tương tự analogues from embryo of the seed of N . nucifera GAERTN.từ tâm Sen was performed by upright coil planet centrifuge with fourđã được thực hiện bởi máy ly tâm cuộn hành tinh thẳng đứng với 4 cuộn đa tầng kết thành một chuỗi (upright coil planet centrifuge with four multilayer coils connected in series)Its design principle and. Nguyên tắc và dimensions were described in the literature [17] . The upright kích thước thiết kế của nó được mô tả trong tài liệu (S. Wu, C. Sun, K. Wang, Y. Pan, J. Chromatogr. A 1028 (2004) 171).Zhejiang University. 2.3.Preparation of crude alkaloidsĐiều chế các alkaloid thô:Dried and powdered embryo of the seed of N . nucifera GAERTN.(12 kg) was extracted three times with 95% aq.12kg bột tâm sen khô được chiết xuất ba lần với ethanol (10 L × 3).ethanol 95% (10 lít × 3).Then, the extract solutions were com- Sau đó, gộp các dịch chiết, bined and evaporated under reduced pressure and 40bốc hơi dưới áp suất giảm 40◦◦C toC để được about 500 mL.khoảng 500ml. The concentrated solution was dissolved inDịch chiết đậm đặc được hòa tan trong4 L 1.5% hydrochloric and filtrated by use of 102-type filter 4 lít HCl 1.5% và lọc bằng giấy lọc loại 102 paper (Xinhua Paper, Hangzhou, China).(giấy Xinhua, Hàng Châu, Trung Quốc). Next, 10% aquaTiếp theo, thêm ammoniac 10% vào dịch lọc ammonia was added into the filtrated solution until the pHcho đến khi pH của dung dịch đạt of the solution reached 8.5.8.5.As a result, 85 g of crude alka- Kết quả thu được 85g alkaloid thô có loids were collected as yellow precipitates.kết tủa màu vàng.2.4. Preparation of two-phase solvent system and sampleChuẩn bị hệ dung môi hai pha và dung dịch mẫu:solutions The two-phase solvent system used was composed of Hệ dung môi hai pha được sử gồm light petroleum (bp 60–90dầu hỏa (b.p 60-900 C) ◦C)–ethyl acetate–tetrachloro-- ethylacetate - tetrachloromethane–chloroform–methanol–water at various volume ra-methane - chloroform - methanol - nước với tỷ lệ thể tích khác nhau.S. Wu et al.tios. The solvent mixture was thoroughly equilibrated in aHỗn hợp dung môi được cân bằng trong phễu tách separatory funnel at room temperature and the two phasesở nhiệt độ phòng và sử dụng ngay sau khi hai pha were separated shortly before use.đã được tách ra.For the present prepara- Đối với việc tách bằng tive CCC separation, the total volume of the prepared tw