Đề tài Chiết xuất và phân lập các isoflavonoid từ diếp cá

noliidae) Sơ đồ 2.1. Phân loại khoa học cây Diếp cá 2.1.1. Mô tả thực vật Diếp cá là một loại cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ mọc ngầm dưới đất. Phần thân trên mặt đất cao 15-50 cm, màu lục hoặc tím đỏ. Lá mọc so le. Cuống lá dài. Phiến lá hình tim dài 4-6 cm, rộng 3-4 cm, có 5-7 gân gốc [2], [6], [11]. Hoa nở vào tháng 5 – 8. Cụm hoa hình bông dài 2,5 cm bao bởi 4 lá bắc màu trắng, trong chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt. Trông toàn bộ bề ngoài của cụm hoa và lá bắc giống như một cái hoa đơn độc. Quả nang mở ở đỉnh; hạt hình trái xoan, nhẵn [4]. Hình 2.1. Lá và hoa Diếp cá 2.1.2. Phân bố, sinh thái Phân bố từ Nhật Bản, Trung Quốc tới Nêpan, Ấn Độ, các nước Đông Dương và Indonesia. Ở nước ta, cây mọc rất phổ biến. Thường gặp mọc hoang nơi ẩm ướt trên các bãi ven suối, bờ sông. Cũng thường được trồng làm rau ăn và làm thuốc [15]. 2.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC Thành phần hóa học của Diếp cá gồm có: flavonoid, tinh dầu, alkaloid và một số thành phần khác [1], [13]. *Flavonoid Diếp cá có chứa thành phần flavonoid hết sức phong phú. Các flavonoid đáng chú ý trong Diếp cá có thể kể đến như quercetin, quercitrin, isoquercitrin [1], [10], [12], [32]. Ngoài ra, còn có một số flavonoid khác cũng không kém phần quan trọng: - quercetin-3-O-β-D-galactosid-7-O-β-D-glucosid - quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosid - kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranosid - phloretin-2’-O-β-D-glucopyranosid (phloridzin) - quercetin-3-O-α-L-arabinofuranosid (avicularin) - quercetin-3-O- β-D-galactopyranosid (hyperin) quercetin phloretin quercitrin isoquercitrin hyperin avicularin phloridzin quercetin-3-O-β-D-galactosid-7-O-β-D-glucosid Hình 2.2. Thành phần flavonoid trong Diếp cá *Tinh dầu Thành phần chủ yếu của tinh dầu Diếp cá là các nhóm aldehyd và các dẫn xuất ceton như methyl n-nonyl ceton (đây là chất làm cho Diếp cá khi vò có mùi tanh), L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất: α-pinen, camphen, myrcen, limonen, linalol, bornyl acetat, geraniol and caryophylen. Ngoài ra, tinh dầu còn chứa acid caprinic, lauryl aldehyd, benzamid, acid hexadecanoic, acid decanoic, acid palmitic, acid linoleic, acid oleic, acid stearic, aldehyd capric, acid clorogenic, lipid và vitamin K [10]. Một số công bố gần đây cho thấy thành phần và hàm lượng tinh dầu Diếp cá khác nhau tuỳ theo nguồn gốc và quá trình phơi sấy khô: - Tinh dầu Diếp cá khô mọc tại miền Bắc Việt Nam có 31 hợp chất, trong đó có 4 hợp chất chiếm thành phần chủ yếu gồm β-pinen (3,15%), 2-undecanon (15,15%), propen 1-methoxy-2 methyl (12,12%), 1R-α-pinen (11,03%). Tinh dầu Diếp cá tươi có 34 thành phần, và hàm lượng tinh dầu trong Diếp cá tươi gấp 4,3 lần hàm lượng tinh dầu trong Diếp cá khô [7]. - Tinh dầu Diếp cá mọc tại miền Nam có 19 hợp chất trong đó thành phần chủ yếu là 2(10) – pinen, (1S, 5S)-(-) (82,84%); ocimen (6,15%); keton methyl nonyl (6,44%) [5]. - Diếp cá tươi mọc tại Trung Quốc có 38 thành phần, trong khi đó thành phần tinh dầu trong Diếp cá khô chỉ có 22 hợp chất: β-mycen (3,47%), L-nonanol (6,21%), α-terpineol (13,24%), methyl nonyl keton (35,2%), bornyl acetat (5,52%), n-decanoic acid (10,58%), caryophyllen (3,41%), docosanoic acid ethyl ester (5,34%) [13]. *Alkaloid Một số alkaloid có hoạt tính sinh học được tìm thấy trong cây Diếp cá là: aristolactam A, aristolactam B, piperolactam A, norcepharadion B, cepharadion A, cepharadion B, splendidin [15]. aristolactam A aristolactam B piperolactam A norcepharadion B cepharadion A cepharadion B splendidin Hình 2.3. Thành phần alkaloid trong Diếp cá *Các thành phần khác Trong cây Diếp cá còn có nhiều các thành phần như là: nước 91,5%, protid 2,9%, lipid 0,5%, cellulose 1,8%, dẫn xuất không protein 2,2%, khoáng chất toàn phần 1,1% (trong đó có calcium, kali, caroten và vitamin C) [7], [8]. Người ta còn tìm thấy trong thành phần Diếp cá có chứa Fe, Mg, Mn, đây là những khoáng chất rất cần thiết cho cơ thể [13]. 2.3. CÔNG DỤNG Rau Diếp cá là một loại rau rất quen thuộc trong bữa ăn hàng ngày của người Việt Nam. Ngoài công dụng được xem như một vị rau ngon, Diếp cá còn có rất nhiều những công dụng khác. Theo Đông y, Diếp cá có vị đắng, tính ôn, tác dụng vào các kinh mạch Đại tràng và Phế, vì vậy có tác dụng: - Giải nhiệt và giải độc, làm giảm sưng viêm, trị ung nhọt trong các trường hợp ung nơi phổi, do hỏa vượng tại Phế với đờm dày đặc màu vàng xanh, trị ho ra máu. - Giải độc ung nhọt ngoài da, chữa vết thương do rắn cắn hay côn trùng cắn. - Làm thông thoát khí ứ đọng, giúp tiêu hóa tốt và lợi tiểu. - Đặc biệt tác dụng chữa bệnh trĩ rất hiệu quả, do có khả năng bảo vệ làm bền thành mao mạch [13]. 2.4. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÁC NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG *Tác dụng kháng khuẩn Diếp cá có khả năng chống lại Herpes type I và II. Trong đó khả năng chống lại Herpes type II mạnh hơn so với type I. Ngoài ra Diếp cá còn có tác dụng ngăn cản sự sinh sản của các vi khuẩn Streptococcus pneumonia (gây sưng phổi) và Staphylococcus aureus (gây mụn nhọt có mủ). Tác dụng trên các vi khuẩn Shigella, Salmonella và E.coli (gây kiết lỵ, tiêu chảy) thì yếu hơn. Diếp cá còn có khả năng diệt được Gonococcus (gây bệnh lậu mủ) và ngăn cản sự phát triển của các siêu vi trùng cảm cúm [13]. *Tác dụng kháng viêm Hoạt chất trong Diếp cá có khả năng chống sưng viêm và làm hạ sốt. Là do các acid béo trong lá khô có khả năng ngăn chặn sự tổng hợp prostaglandin-thủ phạm gây ra phản ứng sưng viêm (do phản ứng loại ức chế cyclooxygenase) [13]. Diếp cá còn được dùng để điều trị hen suyễn, viêm mũi dị ứng do tác dụng ức chế phản ứng quá mẫn qua trung gian tế bào Mast. *Tác dụng trên hệ miễn nhiễm Chất decanoyl acetaldehyde trong Diếp cá có khả năng làm tăng tính thực bào của các tế bào bạch cầu, đồng thời cũng tăng tỷ lệ properdin nên giúp tăng khả năng của hệ miễn nhiễm chống lại các bệnh tật, tăng sức đề kháng để ngăn ngừa các bệnh do siêu vi trùng [13]. *Tác dụng lợi tiểu Tác dụng này có được có thể là do liên quan đến các chất quercitrin, isoquercitrin và muối kali trong cây Diếp cá. Khi dùng dịch chiết nước Diếp cá để ngâm tưới trên thận của cóc và chân của ếch thì nhận thấy các vi mạch máu giãn nở, làm gia tăng sự lưu thông của máu và tạo ra sự tăng bài tiết nước tiểu. Chất isoquercitrin còn có tác dụng làm tăng sự bền chắc của các vi mạch máu. Vì vậy các bệnh nhân cao huyết áp nên ăn thêm Diếp cá để giúp lợi tiểu, hạ huyết áp, đồng thời giúp mạch máu vững chắc hơn [13]. *Tác dụng trên hệ hô hấp Khi chích dung dịch nước Diếp cá qua màng phúc mô thỏ tác dụng hạ ho được nhận thấy rõ rệt. Khả năng trị bệnh nhiễm trùng đường hô hấp của Diếp cá cũng đã được chứng minh rõ ràng: -Khi dùng liều cao (60 g) để trị bệnh sưng phổi có ung nhọt, kết quả rất tốt, ung nhọt biến mất và không để lại di chứng sau 2 tuần điều trị. -Dịch chiết nước Diếp cá cũng rất hữu hiệu khi trị các bệnh ho do phổi bị tắc nghẽn kinh niên [13]. *Tác dụng chống oxy hoá Diếp cá có tác dụng kháng bleomycin (chất gây ra sự xơ hoá phổi ở chuột). Mặc dù dịch chiết nước Diếp cá có tác dụng dọn sạch gốc tự do và tác dụng ức chế oxy hoá xanthin yếu hơn vitamin E nhưng hoạt tính ức chế sự peroxid hoá lipid tế bào gan ở chuột tương đương với vitamin E. Diếp cá có chứa các hợp chất flavonoid như phloretin-2’-0-β-D-glucopyranosid, quercetin-3-0-β-D-galactopyranosid có tác dụng đối với sự peroxy hóa lipid màng tế bào gan bằng cách hạn chế quá trình peroxy góp phần bảo vệ tế bào và duy trì sự hoạt động bình thường của tế bào [9]. *Tác dụng kháng tế bào ung thư Dịch chiết nước Diếp cá có tác dụng chống lại quá trình oxy hóa và đột biến gen. Nồng độ polyphenol trong dịch chiết nước cao hơn dịch chiết methanol, và khả năng kháng đột biến gen của dịch chiết nước cao hơn dịch chiết methanol. Dịch chiết aceton 70% trong nước của cây Diếp cá có chứa các hợp chất flavonoid như phloretin-2’-0-β-D-glucopyranosid, quercetin-3-0-β-D-galactopyranosid có khả năng kháng ung thư ở các dòng tế bào ung thư Sarcoma-180 trong thử nghiệm in vitro và in vivo gây ung thư trên chuột. Các alkaloid được tìm thấy trong dịch chiết methanol của cây Diếp cá có tác dụng chống lại 5 dòng tế bào u ở người (A-549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF-498 và HCT-15). 2.6. CÁC CHẾ PHẨM CÓ CHỨA DIẾP CÁ TRÊN THỊ TRƯỜNG - HELAF (viên nang mềm), sản phẩm của Công ty cổ phần Dược Hậu Giang. Thành phần gồm cao khô Diếp cá, cao khô Rau má. Tác dụng hỗ trợ điều trị trĩ, táo bón và kiết lỵ. - CENDITAN (viên nang mềm), sản phẩm của Công ty cổ phần dược phẩm 3/2. Thành phần gồm cao Diếp cá, bột Rau má. Tác dụng trị trĩ, táo bón. - RUTON (trà túi lọc), sản phẩm của Công ty cổ phần dược phẩm OPC. Thành phần gồm rau Diếp cá, nụ Hòe. Tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu. - TROXITON (viên bao phim), sản phẩm của Công ty cổ phần Dược Danapha. Thành phần gồm Bạch truật, Đương quy, Trần bì, Cam thảo, Diếp cá, Đảng sâm, Hoàng kỳ. Tác dụng chữa bệnh trĩ, bồi bổ cơ thể, giúp lưu thông máu huyết, trợ tiêu hóa, kháng khuẩn kháng viêm. - TRISELAN (viên nang), sản phẩm của Công ty cổ phần dược phẩm Đông Dược 5. Thành phần gồm Diếp cá, Hòe hoa, Kim ngân hoa, Sinh địa, Hoàng liên, Đương quy, Thăng ma, Chỉ xác, Trắc bách diệp, Cam thảo. Tác dụng bồi bổ cơ thể, thanh nhiệt, an thần, hạ huyết áp. - TRĨ LINH ĐƠN (hoàn cứng), sản phẩm của Công ty cổ phần Dược Danapha. Thành phần gồm Bạch truật, Đương quy, Trần bì, Cam thảo, Diếp cá, Đảng sâm, Hoàng kỳ. Tác dụng chữa bệnh trĩ, bồi bổ cơ thể, giúp lưu thông máu huyết, trợ tiêu hóa, kháng khuẩn kháng viêm. 2.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH FLAVONOID 2.7.1. Sắc ký lớp mỏng Các chất hấp phụ thường dùng phân tích flavonoid là polyamid, silica gel, cellulose. Polyamid: tách flavonoid theo 2 cơ chế vừa hấp phụ vừa phân bố tùy theo hệ dung môi dùng. MeOH-H2O (3:7) EtOH-CH3COOH (50:1) CHCl3-EtOH-aceton-BuOH (16:10:1:5) CHCl3-BuOH-MeOH (100:0,3:0,6) Cellulose: hay được dùng trong phân tích flavonoid. Cellulose có thêm 3% polyamid hoặc cellulose-SiO2 tốt hơn trong phân tích glycosid và anthocyanidin. Dung môi: TBA: n-BuOH-acid acetic băng-H2O (3:1:1) Acid acetic 15% (v/v) trong nước. Hai hệ này được sử dụng cho sắc ký 2 chiều; chiều 1: TBA, chiều 2: acid acetic 15%. Silicagel: Các glycosid nhất là glycosid của flavon, flavanol không thích hợp đối với silicagel, nhưng nếu dùng thì chọn hệ dung môi phân cực như EtOAc-BuOH-CH3COOH-H2O (5:3:1:1) hoặc n-BuOH-HCl 2N (1:1, lớp trên). Flavon, flavonol và biflavonoid nếu có nhiều nhóm methoxy hoặc acetyl dùng hệ dung môi kém phân cực. Bezen-EtOAc (3:1) CH3Cl-MeOH (15:1) Benzen-aceton (9:1) Toluen-aceton (19:1) Các flavon, flavonol phân cực hơn như apigenin (5,7,4’-OH), luteolin (5,7,3’,4’-OH), kaempferol (3,5,7,4’-OH), quercetin (3,5,7,3’,4’-OH), myricetin (3,5,7,4’,5’-OH) thì dùng các hệ dung môi phân cực hơn như: Toluen-CHCl3-aceton (8:5:7) CHCl3-EtOAc-acid formic (5:4:1) ♦ Thuốc thử phát hiện H2SO4 đặc Sắt (III) clorid trong MeOH. Sắt (III) clorid + Fericyanua K (1:1) dung dịch nước. AlCl3 2% trong MeOH soi UV 365 nm. NaOH trong MeOH 1% phát hiện hầu hết các flavonoid. 2.7.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong phân tích flavonoid Các điều kiện thường dùng trong phân tích hợp chất flavonoid Flavonoid là những hợp chất phân cực do đó khi áp dung kỹ thuật HPLC phân tích các flavonoid người ta thường dùng cột pha đảo C18 và các dung môi phân cực làm pha động, phát hiện với các detector DAD, UV-vis. Các loại cột C18 thường dùng trong phân tích flavonoid: BDS 250 x 4,6 mm id, 5 µm. XDR 150 x 5,6 mm id, 5 µm Waters. Hypersil 100 150 x 4 mm id, 5 µm. Nucleosil 100 150 x 4 mm id, 3 µm. X-terra 150 x 3,9 mm id, 5 µm Chromolith® 150 x 4,6 mm id. Các pha động thường dùng trong phân tích flavonoid: Acid citric 0,6%/H2O-acetonitril-isopropanol (100:47:5) Isopropanol-THF (65:25) (A)-acetonitril (B)-H3PO4 0,5%/H2O (C) Acetonitril-H2O tỷ lệ thay đổi. MeOH-acid acetic-H2O (30:1:70) MeOH-acetonitril-đệm phosphat pH = 3,0 (20:10:70) Với detector DAD thường phát hiện flavonoid ở các bước sóng từ 250-370 nm. CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM 3.1. QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO DIẾP CÁ Bột Diếp cá (6 kg) được làm ẩm với cồn 96% trong 2 giờ, nạp vào bình ngấm kiệt, thêm cồn vào bình chiết, ngâm trong 12 giờ. Rút dịch chiết ở tốc độ 10 – 12 giọt/phút cho đến khi dịch chiết nhạt màu, gộp toàn bộ dịch chiết cồn, cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được dịch chiết đậm đặc (ký hiệu A). 3.2. QUY TRÌNH PHÂN LẬP FLAVONOID TRONG CAO DIẾP CÁ 3.2.1. Phương pháp sắc ký cột 3.2.1.1. Phân tách các phân đoạn bằng phân bố lỏng-lỏng Dịch A (mục 3.1.1.) được pha loãng với 1 lít nước, lắc phân bố với CHCl3 đến khi dịch CHCl3 không còn cho màu xanh nhạt với TT FeCl3 5%, dịch CHCl3 được rửa nước nhiều lần, gộp các dịch CHCl3, cô thu hồi dung môi được cao A1 (12 g). Dịch A còn lại được lắc phân bố với ethyl acetat đến khi dịch ethyl acetat không còn cho màu xanh rêu đậm với TT FeCl3 5%, rửa dịch ethyl acetat với 100 ml nước cất, gộp các dịch ethyl acetat, cô thu hồi dung môi được cao lỏng A2 (54 g). A2 được dùng làm mẫu để phân lập các flavonoid bằng sắc ký cột nhanh (VLC). Dịch A còn lại tiếp tục được lắc phân bố với n-butanol đến khi dịch n-butanol không còn cho màu xanh đen với TT FeCl3 5%. Dịch n-butanol thu được, rửa nước nhiều lần, gộp các dịch n-butanol, cô thu hồi dung môi được cao A3 (7 g). Dịch CHCl3 Cao A1 (12 g) Cô thu hồi dung môi Dược liệu (6 kg) Dịch chiết cồn Dịch A đậm đặc Ngấm kiệt bằng cồn 96% Cô thu hồi dung môi + CHCl3 Dịch A còn lại + EtOAc Dịch A còn lại + n-BuOH Dịch A còn lại Dịch n-BuOH Cao A3 (7 g) Cô thu hồi dung môi Dịch EtOAc Cao A2 (54 g) Cô thu hồi dung môi Sơ đồ 3.1. Chiết xuất và phân tách các phân đoạn Định tính flavonoid trong các cao A1, A2, A3 bằng phản ứng cyanidin và sắc ký lớp mỏng. Kết quả: phân đoạn 2 - cao A2 giàu flavonoid nhất so với phân đoạn 1 và phân đoạn 3, do đó A2 được dùng để phân lập các flavonoid bằng sắc ký cột. 3.2.1.2. Phân lập flavonoid từ cao A2 bằng SKC chân không a. Thăm dò hệ dung môi trên sắc ký lớp mỏng Khảo sát một số hệ dung môi, tiến hành thăm dò trên sắc ký lớp mỏng tráng sẵn (silica gel F254), phát hiện bằng TT FeCl3 5%, TT. vanilin-sulfuric, soi UV 254 nm, UV 365 nm và thu được kết quả như sau: STT Hệ dung môi Khả năng tách 1 Butyl acetat-acid formic (15:1) + + 2 Ethyl acetat + 3 Ethyl acetat-MeOH-nước (10:0,5:1) + + 4 n-BuOH-ethyl acetat-nước (6:2:0,5) + 5 Ethyl acetat-aceton-nước (8:1,8:0,2) + + + 6 Cloroform-ethyl acetat (2:8) + 7 Butyl acetat-aceton (30:1) + 8 Cloroform-aceton (8:2) + + 9 Butyl acetat-nước-acid formic (15:5:5) + + + + 10 Butyl acetat-nước (15:5) + + + Kết quả: Hệ butyl acetat-nước(15:5) có khả năng tách tốt, Rf thích hợp nên được dùng để tiến hành triển khai trên sắc ký cột chân không. Tuy nhiên do không có mặt của acid formic nên các vết tách kéo đuôi, do đó silica gel sẽ được tẩm 5% acid formic để các vết tách gọn hơn. b. Phân lập flavonoid bằng sắc ký cột chân không (Cột 1) Điều kiện sắc ký Cột thủy tinh xốp 5 x 30 cm, đã xử lí bằng sulfocromic, rửa sạch, sấy khô. Pha tĩnh: Silica gel 60, cỡ hạt 0,015-0,04 mm, khối lượng 150 g, được tẩm với 7 ml acid formic, lắc đều, sấy ở 120oC/2 giờ trong hộp kín. Pha động: Butyl acetat – nước (15:5) Nhồi cột: Nhồi cột khô, sau đó cho 150 ml pha động chảy qua cột, hút chân không đến khi không còn dung môi. Khối lượng mẫu: 25g cao A2. Nạp mẫu dạng dung dịch. Mẫu được nạp đều lên bề mặt silica gel, hút chân không đến khi mẫu thấm hết xuống silica gel, sau đó tiến hành hứng phân đoạn. Thể tích hứng mỗi phân đoạn là: 150 ml. Kiểm tra các phân đoạn trên bảng sắc ký lớp mỏng tráng sẵn với hệ dung môi butyl acetat – nước – acid formic (15:5:5), phát hiện dưới ánh sáng thường, UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử FeCl3 5%. Kết quả: thu được 5 phân đoạn được ghi nhận ở bảng sau: Phân đoạn V (ml) P (g) Thành phần 1 450 1,1 B C D 2 1200 3,7 E F H 3 3300 4,2 F H I J 4 750 2,3 G H I J 5 2400 11,6 H I J Bảng 3.1. Kết quả phân lập flavonoid bằng dung môi butyl acetat-nước (15:5) A B C D E F G H I J TP 1 2 3 4 5 Sơ đồ 3.2. Phân bố các phân đoạn của cột 1 Nhận xét: Phân đoạn 1 (1,1 g) được kết tinh trong methanol thu được tinh thể tinh khiết màu vàng chanh, đặt tên là DC1 (34 mg). Tinh thể được kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng qua 4 hệ dung môi khác nhau ethyl acetat-nước-acid formic-acid acetic (100:10:5:5), EtOAc-aceton-H2O (4:5,5:0,5), CHCl3-HCOOH-CH3COOH (6:2:0,5), butyl acetat-nước-acid formic (15:5:5) (Hình 10, 11, 12, 13), phát hiện bằng TT. vanilin-sulfuric, TT. FeCl3, soi UV 365 nm, UV 254 nm Phân đoạn 2 (3,7 g) có ít nhất 3 vết phát quang màu tím dưới đèn UV 365 nm và cho màu xanh đen với TT. FeCl3, trong đó có 1 vết chiếm lượng lớn, tiến hành kết tinh phân đoạn này nhiều lần trong methanol bằng cách hòa tan hoàn toàn phân đoạn này trong lượng vừa đủ methanol, lọc qua phễu thủy tinh xốp. Dịch lọc được để vào tủ lạnh, cho bay hơi dung môi từ từ, lọc và rửa tinh thể bằng methanol lạnh. Tinh thể được kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng qua 4 hệ dung môi khác nhau EtOAc-H2O-HCOOH-CH3COOH (100:10:5:5), EtOAc-aceton-H2O (4:5,5:0,5), CHCl3-HCOOH-CH3COOH (6:2:0,5), BuOAc-H2O-HCOOH (15:5:5) (Hình 10, 11, 12, 13), phát hiện bằng TT. vanilin-sulfuric, TT. FeCl3, soi UV 365 nm, UV 254 nm, tinh thể thu được màu vàng tươi đặt tên là DC2 (450 mg). Phân đoạn 4 (2,3 g) và phân đoạn 5 (11,6 g) khá giống nhau nên gộp chung, tiến hành kết tinh 2 phân đoạn này trong methanol nhưng không thu được tinh thể, cô thu hồi dung môi 2 phân đoạn, kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng nhận thấy vết G bị phân huỷ thành 2 vết là G và G’ (có thể là do sự có mặt của acid formic). Do đó để phân lập được chất G thì cần phải khảo sát lại hệ dung môi khai triển mà không có mặt của acid. Các phân đoạn còn lại do khối lượng ít và có nhiều vết nên không tiếp tục nghiên cứu. Phân đoạn Chất tinh khiết Đặc điểm Khối lượng (mg) 1 DC1 Vàng chanh 34 2 DC2 Vàng tươi 450 Bảng 3.2. Chất tinh khiết thu được từ các phân đoạn cột 1 c. Phân lập flavonoid bằng sắc ký cột chân không (Cột 2) Mục đích: để tiếp tục phân lập chất G hay các flavonoid còn lại trong cao A2, tiến hành khảo sát lại một số hệ dung môi khai triển. Kết quả hệ ethyl acetat-aceton-nước (8:1,9:0,1) được chọn làm dung môi khai triển vì có khả năng tách tốt nhất và Rf thích hợp. Điều kiện sắc ký Cột thủy tinh xốp 5 x 30 cm, đã xử lí bằng sulfocromic, rửa sạch, sấy khô. Pha tĩnh: Silica gel 60, cỡ hạt 0,015-0,04 mm, khối lượng 150 g Pha động: Ethyl acetat – aceton – H2O (8:1,9:0,1) Khối lượng mẫu: 25 g cao A2. Nạp mẫu: Nạp mẫu khô Thể tích hứng mỗi phân đoạn là: 150 ml. Kiểm tra các phân đoạn trên bảng sắc ký lớp mỏng tráng sẵn với hệ dung môi butyl acetat – nước – acid formic (15:5:5), phát hiện dưới ánh sáng thường, UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử FeCl3 5%. Kết quả: thu được 6 phân đoạn được ghi nhận ở bảng sau Phân đoạn Dung môi V (ml) P (g) Thành phần 1 (1-5) Ethyl acetat 100% 750 1,3 Tạp kém phân cực 2 (6-7) Ethyl acetat-aceton-nước (8:1,9:0,1) 300 2,2 E F 3 (8-11) 600 4,7 E F G 4 (12-19) 1200 5,2 G 5 (20-43) 3600 4,3 G H 6 MeOH 100% 500 6,2 Tạp phân cực Bảng 3.3. Kết quả phân lập flavonoid A B C D E F G H I J TP 1 2 3 4 5 6 Sơ đồ 3.3. Phân bố các phân đoạn của cột 2 Nhận xét: Phân đoạn 2 (2,2 g) được kết tinh nhiều lần trong methanol thu được tinh thể tinh khiết màu vàng tươi là DC2 (220 mg). Tinh thể được kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng qua 4 hệ dung môi khác nhau EtOAc-H2O-HCOOH-CH3COOH (100:10:5:5), EtOAc-aceton-H2O (4:5,5:0,5), CHCl3-HCOOH-CH3COOH (6:2:0,5), butyl acetat-H2O-acid formic (15:5:5) (Hình 10, 11, 12, 13), phát hiện bằng TT. vanilin-sulfuric, TT FeCl3, soi UV 365 nm, UV 254 nm. Phân đoạn 4 (5,2 g) có ít nhất 1 vết phát quang màu tím dưới đèn UV 365 nm và cho màu xanh với TT FeCl3, tiến hành kết tinh phân đoạn này nhiều lần trong methanol bằng cách hòa tan hoàn toàn phân đoạn này trong lượng vừa đủ methanol, lọc qua phễu thủy tinh xốp. Dịch lọc để vào tủ lạnh, cho bay hơi dung môi từ từ, lọc và rửa tinh thể bằng methanol lạnh. Tinh thể được kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng qua 4 hệ dung môi khác nhau EtOAc-H2O-HCOOH-CH3COOH (100:10:5:5), EtOAc-aceton-H2O (4:5,5:0,5), CHCl3-HCOOH-CH3COOH (6:2:0,5), butyl acetat-H2O-acid formic (15:5:5) (Hình 10, 11, 12, 13), phát hiện bằng TT. vanilin-sulfuric, TT FeCl3, soi UV 365 nm, UV 254 nm, tinh thể thu được vô định hình màu vàng tươi đặt tên là DC3 (800 mg). Các phân đoạn còn lại có nhiều vết nên không tiếp tục nghiên cứu. Phân đoạn Chất tinh khiết Đặc điểm Khối lượng (mg) 1 DC2 Vàng tươi 220 2 DC3 Vàng tươi 800 Bảng 3.4. Chất tinh khiết thu được từ các phân đoạn cột 2 Tóm tắt quá trình phân lập chất Từ 50 g cao A2 tiến hành phân lập các flavonoid bằng sắc ký cột chân không (cột 1 và cột 2) đã thu được 3 hợp chất tinh khiết là DC1, DC2, DC3 với khối lượng tương ứng 34 mg, 670 mg, 800 mg. Tiến hành xác định cấu trúc cho kết quả DC1 là quercetin, DC2 là quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid với tên thường gọi là quercitrin, DC3 là quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid. 3.2.2. Phương pháp HPLC điều chế 3.2.2.1. Lựa chọn pha tĩnh Thông thường, kỹ thuật sắc ký pha đảo với cột C8 hay C18 là sự lựa chọn đầu tiên cho sự phân tách các chất có nguồn gốc tự nhiên và cũng dùng để cô đặc hoạt chất. Việc lựa chọn loại cột phù hợp với hợp chất quan tâm phụ thuộc nhiều vào điều kiện thí nghiệm. Do đó, sẽ thật khó khăn nếu thiếu sự hiểu biết về nhóm hợp chất cần quan tâm. Và không phải phòng thí nghiệm nào cũng đủ cơ sở vật chất để thay đổi điều kiện cột. Tuy nhiên, việc chạy thử với 2 hay 3 điều kiện cột pha đảo khác nhau sẽ mang lại nhiều lợi ích, cho ta những dữ kiện cơ bản về nhóm hợp chất quan tâm và có thể sẽ thăm dò được một điều kiện phân tách thành công. 3.2.2.2. Lựa chọn phương pháp Việc tìm một hệ dung môi đáp ứng tốt cho việc phân tách được ví như tìm được chiếc chìa khóa cho việc tinh khiết hóa các hợp chất tự nhiên từ hỗn hợp trong dịch chiết. Công việc quan trọng này được xây dựng theo những phương pháp và đòi hỏi phải thực nghiệm theo những nguyên tắc nhất định để tìm ra điều kiện phân tách tối ưu và có thể áp dụng thành công ở quy mô lớn hơn. Cần lưu ý không phải tất cả sự phân tách nào cũng có thể đạt được sau một lần sắc ký. Hỗn hợp các chất (ví dụ dịch chiết dược liệu) cần phải được loại tạp sơ bộ bằng cách thực hiện với kỹ thuật sắc ký thích hợp như sắc ký cột nhanh, sắc ký lọc gel… để thu những phân đoạn có chứa hợp chất mà ta quan tâm với ít tạp hay thành phần đơn giản hơn. Lượng mẫu tiêm vào cột và lượng chất tinh khiết phụ thuộc nhiều vào từng yêu cầu nhất định. Khi không áp dụng kỹ thuật cột quá tải và tiến hành thăm dò điều kiện sắc ký cho cột điều chế bằng cột phân tích thì lượng mẫu tiêm vào cột được giới hạn bởi độ hòa tan của mẫu trong dung môi và khả năng chịu tải của cột. Với yêu cầu cần một lượng khá lớn chất tinh khiết, cần thực hiện tiêm mẫu nhiều lần với một lượng mẫu ban đầu phù hợp để thu đủ lượng chất tinh khiết cần.Với điều kiện lý tưởng là cột điều chế và cột phân tích có cùng chiều dài, được sản xuất với cùng một kỹ thuật nhồi cột của cùng một hãng sản xuất, ta có thể phát triển sang phương pháp điều chế dễ dàng hơn và có thể dự đoán trước được. 3.2.2.3. Sự lựa chọn dung môi Đối với sắc ký pha đảo, nước được sử dụng như một dung môi yếu trong khi các dung môi hữu cơ như MeOH, MeCN hay THF là các dung môi mạnh. Các dung môi này có độ truyền qua rất tốt cho đầu dò UV và làm thay đổi độ chọn lọc của các chất trong phân tách. Nếu một dung môi không thích hợp để đạt được sự tách chiết theo mong muốn, ta có thể thay thế bằng một dung môi khác. Trong hầu hết các trường hợp, hỗn hợp 2 dung môi là thích hợp cho sự phân tách các hỗn hợp, khi đó hỗn hợp 3 hay 4 dung môi là không cần thiết. 3.2.2.4. Điều kiện HPLC điều chế quercetin Cột sắc ký: Chromegabond C8. Pha động: CH3CN-H2O (30:70) Thêm 3 giọt H3PO4 1% trong 250 ml dung môi pha động. Bước sóng phát hiện: 370 nm. Tốc độ dòng: 2ml/phút. Thể tích bơm: 20ml. Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng. Thu gom các phân đoạn theo hình dạng peak. CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ NHẬN ĐỊNH 4.1. KẾT LUẬN Chiết xuất: từ 6 kg dược liệu đã chiết ngấm kiệt với cồn 96% thu được 54 g cao A2, cao A2 chứa hàm lượng lớn các flavonoid. Phân lập: Từ 50 g cao A2 tiến hành phân lập các flavonoid bằng sắc ký cột chân không (Cột 1 và cột 2) đã thu được 3 hợp chất tinh khiết là DC1, DC2, DC3 với khối lượng tương ứng 34 mg, 670 mg, 800 mg. Cấu trúc của các chất đã được xác định lần lượt là: quercetin (DC1), quercitrin (DC2), quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid (DC3) 4.2. NHẬN ĐỊNH Có thể chiết xuất nhóm Flavonoid toàn phần từ Diếp cá bằng phương pháp ngấm kiệt với