Đề tài Công nghệ gen trong sản xuất thuốc trừ sâu

tử khoảng 130 kDa hoặc 70 kDa thành d - endotoxin, độc tố này bám dính lên tế bào thượng bì của ruột tạo nên các lỗ rò để cho ion nước chảy vào làm tế bào bị căng ra và phân huỷ. Tuỳ theo côn trùng mà có ít nhất 3 cơ chế tác động gây chết của tinh thể độc. 1 : Sau khi ăn phải tinh thể một thời gian khoảng từ 5 á 20 phút, ruột giữa bị tê liệt, pH trong máu và bạch huyết tăng lên từ 1 á 1,5 đơn vị, còn pH ruột giữa hạ xuống do chất kiềm của ruột thấm vào máu. Tế bào biểu mô ruột bị phá huỷ, sau 1 giờ toàn bộ cơ thể bị tê liệt. 2 : Sau khi ăn phải tinh thể thì côn trùng ngừng ăn, ruột bị tê liệt nhưng pH của máu và bạch huyết không tăng. Sau 24 ngày côn trùng chết mặc dù không bị tê liệt toàn thân. 3 : Đặc biệt là tinh thể nhất thiết phải kèm theo bào tử mới gây chết. Côn trùng chết sau 2 á 4 ngày không có hiện tượng liệt. 3.2.2. Yếu tố ảnh hưởng Tất cả các yếu tố ảnh hưởng của đến quá trình sinh trưởng và phát triển của Bt đều ảnh hưởng đến quá trình hình thành tinh thể độc tố. Vi khuẩn Bt thường sinh trưởng ở khoảng nhiệt độ 27 á 300C, topt là 300C. Nếu nuôi cấy ở 150C trở xuống thì bào tử không hhình thành và pHopt cho sinh trưởng là 7, pH quá cao (pH = 12) hoặc quá thấp (pH = 3,3) đều làm biến tính tinh thể. Một số chất dinh dưỡng có hiệu quả rõ rệt khi cho vào môi trường nồng độ 0,3 á 0,5. Nồng độ O2 ảnh hưởng quan trọng đến sự hình thành bào tử và tinh thể độc vi khuẩn. Quá trình hình thành bào tử đòi hỏi sự tổng hợp của một loại proteaza ngoại bào, ở những chủng đột biến do không có khẩ năng tổng hợp enzim này nên cũng sẽ không sinh ra được bào tử tinh thể. Như vây, sự tạo thành bào tử và tinh thể có liên quan đến sự chuyển hoá phần protein của tế bào sinh dưỡng. Một số axit amin có tác dụng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn cũng như hình thành tinh thể như loxin, izoloxin. Tuy nhiên khi có va lin trong môi trường thì tác dụng này cũng mất đi. Nếu bổ xung thêm treonin hoặc serin vào môi trường thì gây ức chế, nhưng nếu đưa cả hai vào môi trường thì không có hiện tượng này. Tác dụng ức chế của serin cũng mất đi nếu có mặt của methionin. Những nhân tố ảnh hưởng đến sự trao đổi chất axit axetic cũng làm ức chế sự tạo thành bào tử và tinh thể độc . Chất kháng sinh erytromcyin ở nồng độ thấp chưa đủ ức chế Bt sinh trưởng nhưng nó lại cản trở sự hình thành bào tử. Sự có mặt của chất kháng sinh này làm thể mang bào tử không bị phân giải và tinh thể còn lại sẽ bị giữ lại trong phần còn lại của thành tế bào. 3.3. Các gen mã hoá độc tố Hàng loạt chúng Bt có khả năng sản sinh tinh thể độc tố diệt ấu trùng của một số loài côn trùng cánh vẩy, cánh cứng, hai cánh đã được nghiên cứu ở mức độ phân tử. Người ta đã nghiên cứu trình tự 50 gen độc tố. Một số giống nhau hoàn toàn, một số khác gần giống nhau đại diện cho cùng một gen hoặc biến dạng từ một gen. Có 14 gen riêng biệt trong đó 13 gen được gọi là gen độc tố (gen Cry) mã hoá tổng hợp protein gây độc với côn trùng và một gen tổng hợp protein gây độc với tế bào động vật có xương sống gọi là gen CytA . Hiện nay gen Cry được chia thành 6 lớp chính có ký hiệu : CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV, CryVI trên cơ sở cấu tạo giống nhau và phổ tác dụng với côn trùng thì : Nhóm gen Cry Kích thước Hình dạng Phổ tác dụng CryI(A,B,C,D,E,F) 130 –138 kDa Tinh thể hình tháp. Côn trùng cánh cứng, vảy CryII(A,B,C) 70 –71 kDa Tinh thể hình lập phương . Côn trùng cánh cứng, vảy CryIII(A,B,C,D) 66 – 73 kDa Tinh thể hình thoi dẹt . Côn trùng cánh cứng CryIV(A,B,C) 135 – 145 kDa Tinh thể hình cầu, chữ nhật. Côn trùng hai cánh CryV(A,C) 81 kDa Tinh thể hình tháp . Côn trùng cánh cứng,vảy CryVI 44 – 45 kDa Tinh thể hình tháp. Giun tròn Bảng tra nhóm gen Cry Trong tất cả các gen Cry thì gen CryI được nghiên cứu kỹ nhất. Vì gen CryI có trọng lượng phân tử 130 á 138 kDa. Mã hoá cho các protein độc tố, có cấu trúc tương đồng và kháng ấu trùng cánh vẩy. Gen CryI bao gồm 6 nhóm phụ ký hiệu từ CryIA đ CryIF. Trong đó CryIA được phân thành 3 nhóm nhỏ hơn là CryIA(a), CryIA(b), CryIA(c). Với lí do là gen CryI có tỷ lệ aa đồng nhất cao (vì có hơn 80% aa đồng nhất). Nhóm gen Cry được nghiên cứu nhiều và nó có 20 gen khác nhau ddã đươc giải trình tự và từ năm 1980 người ta thành công lần đầu tiên là tạo được thuốc trừ sâu baừng kỹ thuật gen . Những nghiên cứu ban đầu cho thấy quá trinh hình thành tinh thể độc tố liên quan mật thiết đến sự có mặt của plasmid. Gen mã hoá độc tố tự nhiên thường nằm trên plasmit cỡ lớn và dài tới 3 kb. Nhưng chỉ có đoan 2 kb tính từ đầu 5’ mã hoá đoạn protein có tính độc, phần còn lại mã hoá đoạn protein có liên quan tới tính gắn. Bảng tra kí hiệu protein độc tố (Các serotype Bt nguồn gốc Crickmore 1996) Kí hiệu Chủng Bt Diệt sâu hại Bộ CryI (a,c) Kusstaki Sâu xanh đục thân Lepidoptera Alesti Sâu đo, sâu xám, mối Lep. Diptera CryI (b) Berlinet Sâu keo, mối, sâu hại kho Lep. Coleoptera CryI (b,c) Thurigens Sâu tơ, sâu xanh hạt cải Lep CryI (d,l,f) Aizawai Sâu bộ cánh vẩy Lep CryIII (a,b,c) Ruristaki Sâu bộ cánh vẩy Lep CryIII a Shangai Bọ khoai tây Coleoptera CryIII a Tenebrionis Bọ cánh cứng Coleoptera CryIV a Israelausis Muỗi Culex và Aedes Diptera Mỗi chủng Bt có ký hiệu protein độc tố riêng, căn cứ vào các protein độc tố này mà người ta đã nhận biết được chủng Bt có khả năng diệt sâu hại ở bộ nào mà định hướng cho việc sản xuất ra chế phẩm Bt. IV. Công nghệ sản xuất Bt 4.1. Sản xuất chế phẩm Bt (theo phương pháp cổ truyền ) Sản xuất Bt được thựchiện bằng cả hai phương pháp lên men chìm và lên men xốp. Trong công nghệ lên men xốp thường dùng những hạt cơ chất rắn, những hạt này có thể hoặc không có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trên bề mặt. Các hạt cơ chất rắn này đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng hoặc chất mang vô cơ. Bên cạnh đó công nghệ sản xuất Bt qui mô lớn gặp nhiều khó khăn. Đó là việc cung cấp khí cho môi trường, ngăn chặn sự nhiễm. Điều chỉnh sự lên men thu hoạch. Phương pháp lên men xốp có sản lượng thấp so với lên men chìm và nó không phải là phương pháp thực tế để sản xuất chế phẩm thương mại. Đối với phương pháp lên men chìm, việc nghiên cứu tìm ra môi trường dinh dưỡng tối ưu là rất càn thiết. Ngoài ra phải quan tâm tới các thông số trong quá trình lên men như : nhiệt độ, độ pH, độ O2 hoà tan, tốc độ không khí, để xác định thời gian thu hoạch tối ưu. Quá trình sản xuất lên men Bt : Chủng BT (trong ống thạch) Nhân giống cấp I (trên máy lắc) Nhân giống cấp II Kích thích lên men (nhiệt độ, thông gió, pH) Lọc Ly tâm + chất phụ gia(trộn) Sấy chế phẩm thô đóng gói sản phẩm Chất bảo quản + chất phụ gia Dung dịch đóng chai bảo quản 4.2. Sự chuyển gen Bt vào thực vật 4.2.1. Chuyển nạp gen Cry IA(b) vào cây lúa Gen CryIA(b) dạng khảm tinh thể cụt với 2 promoter có tính chất cấu trúc là 355 CaMV và Actin – 1, hai promoter chuyển tính trên mô chúng được chuyển nạp vào cây lúa với hai dạng hình khác nhau và bằng phương pháp bắn gen trên tế bào trần (Datta và công sự năm 1998) đã sử dụng 1800 cây lúa được giả định đã chuyển nạp thành công gen Bt này. Sau đó người ta phân tích và kết quả là có hơn 100 cây chuyển nạp được xác nhận có sự có sự hợp nhất của gen CryIA(b) và genome của cây lúa. Người ta cũng ghi nhận mức độ cao của CryIA(b) protein trong mô lá tươi và thân lúa với những cây sử dụng( PEPC) promoter. Và sự khác biệt nhỏ về protein ở lá và thân cây lúa transgenis sử dụng promoter 355 hoặc Actin – 1 được ghi nhận. Có 81 cây lúa trong 800 cây sau khi có kết quả dương về phân tích Southern được thanh lọc với sâu đục thân màu vàng cho thấy 100% sâu non chết. Gen CryIA(b) này được kết hợp với nhiều promoter cho thấy mức độ thể hiện protein có khác nhau (thấp hoặc cao). Promoter (PEPC) hoặc Pith đã được khuyến cáo và sử dụng đơn độc hoặc kết hợp với nhau, cho phép thể hiện protein CryIA(b) trên thân, lá, tối thiểu hoá protein này trong hạt lúa. Công trình của( Nayar và cộng sự năm 1997) cho thấy trên cây lúa indica được chuyển nạp gen CryIA(c) cũng có kết quả diệt được sâu đục thân màu vàng. Cả hai CryIA(b) và CryIA(c) đều là những candictate genes đối với sâu đục thân màu vàng trên lúa. Gen CryIA(c) được thiết lập với promoter và terminator. Công thức gen này được chuyển nạp vào calli của phôi giống lúa gây độc tính cho sâu trong đó có hai dòng thể hiện rất ổn định ở thế hệ T2 Phương pháp bắn gen : Đây là phương pháp chuyển nạp gen trực tiếp vào cây trồng. Kết quả chuyển nạp Cơ quan Phương pháp Tác giả Hoạt động transient Callus của Japonica ổn định Cây transgenic (Japonica) Cây endica đầu tiên Tế bào trần Tế bào trần Tế bào trần Tế bào trần Tế bào trần Tế bào trần PEG PFG Mở lỗ bằng xung điện Mở lỗ bằng xung điện PEG PEG Cu-Lee và CS 1986 Uchimya và CS 1986 Toriyama và CS 1988 Zhang và CS 1988 Zhang và Wu 1988 Datta và CS 1990 Kết quả chuyển nạp Cơ quan Phương pháp Tác giả Giống lúa Chuyển agrobacterium Thử nghiệm trên ruộng đầu tiên (gen kháng thuốc cỏ) Phôi chưa trưởng thành Phôi Phôi chưa trưởng thành Bắn gen Agrobacterium Bắn gen Christou và CS 1991, 1992 Hiei và CS 1997 Oard và CS 1996 Lịch sử phát triển của công nghệ chuyển nạp gen trên lúa Hiện nay trong phương pháp bắn gen có 3 loại dụng cụ khác nhau và điểm khác nhau chủ yếu là phương pháp điều khiển. Dụng cụ ban đầu là một bộ phận cung cấp năng lượng giống như khẩu súng gây nổ nhờ một kim lửa. Dụng cụ kiểu thứ hai hoạt động theo nguyên tắc phóng điện đưa DNA phủ lên các phân tử bằng vàng cực mịn. Dụng cụ kiểu thứ ba hoạt động bằng áp suất của gas từ một xi lanh chứa gas, nhằm thúc đẩy tiến trình bắn DNA. Vận tốc của tiến trình loại dụng cụ 3 này chậm hơn so với loại 1 nhưng nó lại có hiệu quả trong việc vận chuyển plasmit DNA vào cây trồng. Thí nghiệm đầu tiên người ta phân lập phôi lúa chưa trưởng thành (phôi non) rồi tiến hành bắn gen. Chồi mầm của phôi cũng được thí nghiệm 24 giờ sau khi bắn gen, hoạt động của “transient” đối với gen mới du nhập đã được ghi nhận. Mức độ hoạt động của “transient” thay đổi tuỳ theo loại DNA, mật độ “loading” các phân tử kim loại kèm theo lực bắn, độ sâu để chuyển nạp xâm nhập vào phôi. Thông thường hoạt động GUS có tính chất “transient” được tìm thấy gia tăng theo sự tăng của hàm lượng DNAvà giảm theo lực, giảm theo mật độ thấp của các phân tử kim loại. Mô được bắn gen xong sẽ được đưa vào môi trường tái sinh, bổ sung thêm các chất có tính chọn lọc một cách thích hợp, kháng sinh gromycin B hoặc Basta (thuốc cỏ), hoặc chất đồng phân của nó. Sự xuất hiện của calluscos chứa gen chuyển nạp sẽ được quan sát 5 á 7 ngày sau khi bắn gen. Mô đã được bắn gen với plasmit không chứa kháng sinh hoậc kháng thuốc cỏ hoặc có những phần tử vàng (không phải DNA) thì không phát sinh ra callus chúng sẽ chết trong vòng vài ngày, sau khi đặt vào môi trường có tính chọn lọc. Việc chọn lọc liên tục có phản ứng dương tính trên môi trường có chứa “Hgm” sẽ tạo ra sự thể hiện callus của phôi đã được chuyển nạp. Callus này sau đó phát sinh vào phôi được chuyển nạp và những mô khác có tính chất “transgenis”, như chồi hoặc rễ để ròi cho ra cây transgenis hoàn chỉnh. 4.2.2. Chuyển nạp gen CryIIIA vào cây lúa. Đối với côn trùng thuộc coleoptera như mọt gạo và bọ xít đã được xem như đối tượng quan trọng trong chiến lược sử dụng gen CryIIIA để phòng trị. Endotoxin CryIIA của Bt. Vartenebrionis là một phân tử protein 65 kDa. Gen CryIIIA được phân lập, đầu N được xác định bằng cách sử dụng một codon tổng hợp của threonine và proline. Công thức gen cải tiến của CryIIIA bao gồm promoter CaMV35S, teminator phục vụ sự thể hiện gen. Sự thể hiện gen CryIIIA trong giống lúa indica được chứng minh thông qua xét nghiệm sự thể hiện “transient” trong tế bào trần. Kỹ thuật cloning gen CryIIIAcũng được mô tả : Vector dùng cho thể hiện gen là pCN18, được triển khai bằng cách chuyển đoạn phân tử E. coRI – Hind HI của vector pBH 21 sang pUC18 để hình thành pCN18. Gen uid A cũng có trong phân tử này được loại bỏ nhờ restriotion enzimme smal, sst I theo kiểu cắt “blund end” rồi nối lại sau khi hoàn thiện ở đầu dây bằng Klenow. Gen CryIIIA có trong pBTT2 được cắt bởi Hind HI, một đoạn phân tử có kích thước 2,3 kb, dạng cắt “blunt end” gắn vào vị trí Bam HI của pCN18. Người ta tiến hành chọn lọc một clone (pCN BTI) ở đó gen Cry IIA được gắn vào thế (insert), clone này có thể phục hồi bằng cách phân cách Bam HI và Bgl H. ị ảnh hưởng của gen Bt trên sự biến thái của côn trùng, khi cho chúng ăn với liều lượng 40mg ICP/mg RFP (Johnson và CS 1996). Nghiệm thức Tỷ lệ sống sót (%) Tỷ lệ biến thái (%) Kiểm chứng (không có ICP) Có ICP của isolate thuộc Bt vartenebrionis Dòng xử lý (Ecoli thể hiện ICP do gen CryIIIA) 86,60 36,66 40,00 96,10 45,45 41,60 ị Sự tổng hợp các trường hợp khác trong chuyển nạp gen : Danh sách các cây được chuyển nạp gen Cry Crystal protein Côn trùng Cây chuyển nạp CryIAa Lepidoptera Cranberry, poplar, rutabaga CryIAb Lep Táo, bông vải, bắp, poplar, khoai tây, lúa, thuốc lá, cà chua, White clover CryIAc Lep Táo, broccoli, bắp cải, bông vải, nho, mù tạt, đậu phụng, lúa, đậu nành... CryIBa Lep White clover CryICa Lep Alfalfa, arabidopsis, thuốc lá CryIH Lep Bắp CryIIAa Lep Bông vải CryIIIA Coleoptera Cà tím, khoai tây, thuốc lá CryVIA Coleoptera Alfalfa CryIXC Lep Bắp Bt không chuyên tính Juneberry, hawthorn, đào lông, mía 4.3. Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật. ( Chuyển nạp gen bằng phương pháp Agrobacterium) Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh ghẻ khối u trên cây, nó là một thể phát sinh ung thư chuyển vào tế bàothực vật tạo ra trực tiếp hình thành khối u để tổng hợp ra một loại dinh dưỡng đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển. Cơ chế hình thành khối u ở mức độ phân tử đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Ban đầu họ chỉ nhằm tìm ra phương thức phòng trừ căn bệnh căn bệnh này cho cây. Khi phát hiện ra Ti-plasmit thì người ta mới chú ý khả năng sử dụng chúng như một vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào tế bào và mô thực vật. Đến nay phương pháp chuyển gen qua Agrobacterium đã thực hiện thành công trên cây hai lá mầm. Mặc dù cây một lá mầm không phải làvật chủ tự nhiên của Agrobacterium nỗ lực để chuyển gen vào ngô và các cây thuộc họ ngũ cốc. ð Cấu trúc của Ti – plasmit : Ti – plasmit đượctìm thấy ở tất cả các chủng Agrobacterium gây nhiễm và tồ tại bền vững ở nhiệt độ dưới 300C. Chúng là một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử bằng 3 – 5% so với trọng lượng nhiễm sắc thể vi khuẩn. Trong tế bào chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập. Mặc dù được tác ra ở các chủng Agrobacterium khác nhau, Ti – plasmit đều có 4 vùng tương đồng. Phân tích di truyền cho thấy 2 trong 4 vùng, vùng T – DNA và vùng vir (virulence), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u. Hai vùng còn lại chứa gen mã hoá cho việc tái bản plasmid (replication) và chuyển nạp (conjugative transfer). Bản đồ Ti – plasmit dạng octophin (pTiAch5) và dạng nopalin (pTiC58) : vùng tương đồng giữa hai plasmit CON : vùng chuyển nạp ORI : Vùng tái bản plasmit VIR : Vùng lây nhiễm T-DNA, TL, TR : vùng chứa T-DNA Trên Ti-plasmit chỉ có duy nhất vùng T-DNA được chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium sang bộ gen của cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở đó. Tuy nhiên vùng này lại không mã hoá những sản phẩm làm trung gian cho quá trình chuyển mà cần có sự trợ giúp đặc biệt của các gen gây nhiễm (virulence genes). Các gen này nằm trong một vùng khoảng 40 kb trong Ti-plasmit (vùng vir) hay trên nhiễm sắc thể vi khuẩn (chv genes). Gen chvA và chvB đóng vai trò quan trọng trong quá trình tấn công của Agrobacteriumvào thành tế bào thực vật. Gen chvB mã hoá cho một protein liên quan đến sự hình thành vòng b - 1,2 glucan, trong khi gen chvA mã hoá cho một protein vận chuyển nằm trong màng tế bào vi khuẩn. Protein này có nhiệm vụ chuyển b - 1,2 glucan, trong khi gen chvA mã hoá cho một protein vận chuyển trong màng tế bào vi khuẩn. Protein này có nhiệm vụ chuyển b - 1,2 glucan vào khoang chu chất. Vùng vir phụ trách khả năng gây nhiễm, làm trung gian cho quá trình chuyển T–DNA. Có tới 24 gen độc nằm trong vùng vir trên Ti-plasmit dạng octophin. Các gen này được bố trí trong 8 operon kí hiệu virA đ virH, chúng cùng được điều hoà và tạo thành một cấu trúc regulon. Mỗi operon thường chứa vài gen. Sản phẩm hoạt động của các gen này dưới tác dụng kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt protein đặc hiệu. Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T–DNA, bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với bộ gen của cây chủ một cách an toàn. Hoàn toàn khác với các tế bào thực vật bình thường, tế bào ung thư phát triển vô tổ chức ngay trong điều kiện thiếu các hormon sinh trưởng (auxin và cytokinin). Sở dĩ như vậy vì agrobacterium đã chuyển một đoạn T-DNA sang tế bào thực vật và T-DNA điều khiển quá trình tổng hợp các hợp chất đó. Trong bộ gen của cây bị khối u tồn tại một hoặc vài bản sao của T-DNA. Cũng có một số rất ít trường hợp, hệ gen thực vật chứa hơn 10 bản sao của T-DNA. Chúng có thể nằm trên cùng một locus hoặc cũng có thể tách rời nhau và gắn kết các vùng khác nhau trên DNA thực vật. Vị trí tiếp xúc của T-DNA với DNA thực vật hoàn toàn ngẫu nhiên mà không vào một vị trí đặc biệt nào. ở cà chua, 7 đoạn T-DNA của Ti-plasmit đã gắn vào 5 nhiễm sắc thể khác nhau. Trong khi ở Crepis capillaris T-DNA chỉ được tìm thấy trên 3 nhiễm sắc thể. Nghiên cứu trình tự gen trên vùng T ở các Ti-plasmit khác nhau, người ta thấy rằng T-DNA được giới bởi một đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn từ 25 cặp bazơ : TGGCAGGATATATTCCGTTGTAAT và gọi là đoạn ranh giới (T- DNA border sequence). Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật. ở đoạn ranh giới bên phải có yếu tố hoạt động cis cần cho quá trình chuyển T-DNA. Đoạn ranh giới bên trái là dấu hiệu để quá trình chuyển T-DNA kết thúc bình thường. Các nghiên cứu cho thấy các khối u không được hình thành hoặc bị suy giảm nếu bị cắt đoạn ranh giới bên phải. Trong khi đoạn ranh giới bên trái có ảnh hưởng rất ít đến sự hình thành khối u. T-DNA mang rất nhiều gen và biểu hiện trong quá trình chuyển vào tế bào thực vật. Các phân tích trình tự gen trên T-DNA cho thấy T-DNA cũng mang các dấu hiệu khởi đầu phiên mã (hộp TATA) và kết thúc phiên mã (hộp AATAAA). Gen tồn tại trên T-DNA được chia ra làm hai hệ chính. - Hệ gen mã hoá cho các enzim cho các quá trình sinh tổng hợp opin. Sản phẩm đặc biệt này chỉ được vi khuẩn sử dụng làm nguồn năng lượng cung cấp cacbon và nitơ, còn bản thân tế bào chủ lại không tiêu thụ được các axit amin này. - Hệ gen gây khối u mang các gen tms1, tms2 mã hoá cho sinh tổng hợp auxin ; tmr mã hoá cho enzim liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin. Khi T-DNA xâm nhập vào bộ gen của cây chủ, chúng bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin. Cây bị nhiễm bệnh. Toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo các khối u. Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật chủ. Khi các tế bào của cây bị tổn thương, chúng sẽ tiết ra các hợp chất dạng phenol như axetosyringon, a-hydroxy- axetosyringon dẫn dụ hoá học vi khuẩn. Nhờ đó, Agrobacterium nhận ra tế bào chủ thích hợp và gắn vào thành tế bào thực vật. quá trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir. Cũng chính các hợp chất này, với vai trò cảm ứng giúp cho các gen vùng vir trên Ti-plasmit hoạt động. Gen virA và virG được biểu hiện trong giai đoạn phát triển sinh dưỡng của vi khuẩn. Khi Agrobacterium xâm nhiễm tế bào thực vật qua vết thương, sản phẩm gen virA nhận biết sự có mặt và tương tác với các phân tử auxetosygingon rồi truyền thông tin ngoại bào này vào trong tế bào dẫn đến sự hoạt động của các sản phẩm gen virG. Tiếp theo, các protein VirG lại kích hoạt các gen gây độc còn lại như virB, virC, virD và virE cũng như là tăng cường độ phiên mã của locus virG. Sau đó, virD mã hoá cho một loại endonuleaza nhận ra trình tự đoạn ranh giới bên phải tại bazơ thứ 3 hoặc 4 tính từ trái sang và tách T-DNA thành hai mạch đơn. Một mạch đơn sẽ chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5’ đi trước. Đoạn mạch đơn còn lại trên Ti-plasmitsex làm khuôn để tổng hợp nên mạch DNA bổ trợ mới. Trong quá trình di chuyển, sợi đơn DNA phải chui qua rất nhiều màng trước khi vào được đến nhân tế bào thực vật. Vì vậy, để giữ được tình trạng nguyên vẹn T-DNA sợi đơn được gắn với virE. Sản phẩm của gen virB nằm trên màng tế bào vi khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp T-DNA sợi đơn sang tế bào thực vật. Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật gần giống với quá trình tiếp hợp của vi khuẩn, trong đó protein VirB, tương đương với nhân tố F (lông F) ở quá trình tiếp hợp, hoạt động như một cầu nối chuyển gen. Cơ chế chuyển T-DNA từ A.tumefaciens vào tế bào thực vật : a. Mật độ virA tăng lên nhanh chóng dưới sự kích thích của hợp chất dạng phenol. VirA kích hoạt virG thông qua cơ chế phosphoril hoá và virG lại hoạt hoá các protein khác. b. VirD là một loại endonucleaza. c. VirE là một protein bám vào DNA sợi đơn. d. Vir B hoạt động như một cầu nối tiếp hợp giữa Agrobacterium và tế bào thực vật. Sau khi T-DNA đã chui được qua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với DNA nhân thực vật ở những vị trí ngẫu nhiên. Tại đó các gen trên T-DNA, nhờ sự điều khiển của gen thực vật, bắt đầu hoạt động sản sinh ra opxin, auxin, cytokinin dẫn đến sự hình thành khối u. Khả năng chuyển gen tự nhiên của Agrobacterium vào tế bào thực vật người ta đã khai thác khả năng sử dụng chúng như một vector tự nhiên để đưa các gen ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. Kết quả tạo ra được cây trồng với các đặc tính mong muốn. Tuy nhiên Ti-plasmit rất cồng kềnh, kích thước lớn tới 200 kb nên rất khó cho việc chuyển gen. Mặt khác, Ti-plasmit lại chứa trong nó các gen gây khối u, làm cho cây trồng tiếp thu nó sẽ trở thành dị dạng nên không thể được dùng trực tiếp làm vector... Vì vậy, đã có nhiều cố gắng nhằm cải tiến Ti-plasmit, cắt bỏ hầu hết các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết. Kết quả tế bào thực vật được biến nạp vừa mang gen mong muốn, không bị hình thành khối u, có khả năng tái sinh và phát triển bình thường. Các vector Ti-plasmit nhân tạo được sử dụng trong công nghệ gen thực vật có thể chia thành hai dạng chính : vector liên hợp (cointegrate vector) và vector nhị thể (binary vector). Vector liên hợp được thiết kế dựa trên Ti-plasmit với vùng vir được giữ lại, Ti-DNAmã hoá chức năng gây ung thư bị loại bỏ thay thế vào đó là đoạn DNA mới. Các đoạn DNA này đồng thời xâm nhập vào bộ gen của cây chủ và cùng hoạt động. Do đó gọi là vector liên hợp. Bên cạnh đó, để đưa DNA lạ vào giữa hai đoạn ranh giới cần sử dụng một vector trung gian. Vector này có khả năng hoạt động trong E.colivà có mọt vùng tương đồng với vùng nằm giữa hai trình tự ranh giới của vector liên hợp. Qua sự tiếp hợp, nó được chuyển từ E.coli sang Agrobacterium nhờ sự trợ giúp của các plasmit hỗ trợ như pGJ28 nhằm cung cấp yếu tố ColE1 cần cho quá trình tiếp hợp. Sau đó dựa trên các dấu chuẩn di truyền thích hợp như kháng kháng sinh các thể tái tổ hợp sẽ được chọn lọc. Sơ đồ vectơr liên hợp. HOM : vùng tương đồng, nơi có thể xảy ra quá trình tái tổ hợp ; LB, RB : bờ phải, bờ trái ; MCS : các vị trí giới hạn PTM : dấu chuẩn di truyền chọn lọc thực vật. RES : dấu chuẩn kháng kháng sinh chọn lọc vi khuẩn. Ori T : đầu tái bản trong E.coli Các nghiên cứu cho thấy vùng vir và T-DNA không nhất thiết phải nằm trên cùng một plasmit. Đây là cơ sở cho hệ thống vector nhị thể ra đời. Vector nhị thể được thiết kế dựa trên các plasmit có thể nhân lên trong E.coli cũng như trong Agrobacterium và có mang đoạn ranh giới T-DNA. Đoạn ranh giới này nằm kề sát vùng cắt gắn đa vị (MCS = multipe cloning sites) – vùng cho phép gắn đoạn DNA ngoại lai vào và các dấu chuẩn (chỉ thị) cho phép chọn lọc trực tiếp các tế bào đã biến nạp. Vector nhị thể đầu tiên được nhân lên trong tế bào E.coli và sau đó chuyển toàn bộ vào trong tế bào Agrobacterium thông qua quá trình tiếp hợp. Bản thân tế bào Agrobacterium này mang Ti-plasmit với vùng vir được giữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và các đoạn ranh giới trái và phải. Vùng vir đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển của vector nhị thể. Sơ đồ vec tơ nhị thể. Sau khi tách chiết xử lý vector cùng gen gây độc tố và xử lý plasmid bằng enzim giới hạn sau đó người ta gắn kết cấu gên độc tố Bt vào vector Ti-plasmid. Có hai khả năng để gắn đoạn DNA ngoại lai vào plasmid. Đó là phương pháp sử dụng đầu dính và phương pháp tổng hợp các đầu bổ trợ ở cuối các phân tử DNA.Các thí nghiệm thường được tiến hành theo phương pháp thứ nhất . Vectơr và kết cấu gen độc tố Bt được xử lý bằng cùng một loại enzim giớihạn . Sản phẩm là các đoạn DNA plasmid đã được làm duỗi và đoạn gắn (insert) cầnthiết có dấu cắt tương đồng . Sau đó chúng đươc trộn lẫn theo một tỷ lệ nhất định với sự có mặt của ligaza . Ligaza xúc tác phản ứng nối vectơr với đoạn gắn tạo thành vectơr tái tổ hơp .Sau đó ta đưa plasmid vào tế bào vật chủ thích hợp ,khi vectơr t