Đề tài Công nghệ lên men Gluconic acid

đầu, có nhiều cuống nhỏ. Tùy loại có cuống nhỏ 1 tầng hoặc 2 tầng. Tất cả cuống nhỏ có hình chai và gọi là tế bào hình chai, khi trưởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống. Các đính bào tử xếp thành chuỗi dài và càng tận cùng càng lớn dần. Những chuỗi đính bào tử xếp đối xứng từng quả tròn trên chóp nang trông như đóa hoa cúc. Đính bào tử điển hình thường hình cầu, đơn bào, đa hạch bề mặt xù xì. Do cuống sinh bào tử và đính bào tử có màu sắc nên màu của chúng trở thành màu của khuẩn lạc mốc. Các khuẩn lạc của mốc Aspergillus thường là: vàng, vàng lục, đen, tro, nâu. Đặc điểm của giống Aspergillus là giàu các enzyme thủy phân ngoại bào (amylase, protease, pectinase, lipase…). Hiện nay người ta sử dụng rộng rãi loài Aspergilus vào công nghiệp thực phẩm và một số ngành khác để thu acid hữu cơ và enzyme. Một trong những chủng được nghiên cứu kỹ trong phòng thí nghiệm và các quá trình sản xuất là Aspergilus niger. Chủng này trong quá trình phân hủy các glucid có khả năng tích lũy ở môi trường một lượng acid hữu cơ và enzyme khá lớn. 2.2 Giới thiệu về Aspergillus niger  Nhóm Aspergillus niger  Giống Aspergillus  Họ Aspergillaceae  Bộ Moniliales  Lớp Fungi imperfecti Vị trí phân loại của Aspergilus niger:  Thuộc bộ các khuẩn (Plectascales), họ Aspergillaceae, lớp Ascomycetes.  Hội nghị Utrecht năm 1952 công nhận như sau: Ở giai đoạn đỉnh bào tử - giai đoạn phát triển chính của A. niger người ta xác định chúng thuộc bộ Moniliales, lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes). Ở giai đoạn hình thành túi bào tử thì chúng thuộc bộ Plectascales, lớp nấm túi Ascomycetes. Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 7 Hình 1: Nấm mốc Aspergillus niger Aspergillus niger phát triển mạnh trên môi trường thạch malt và tạo thành bào tử dài khoảng 7-10 micromet, khuẩn lạc màu đen, trên những cuống bào tử có vô số những bào tử. Cuống bào tử có hai phần: phần thứ nhất dài và to, khoảng 2-3 micromet có màu nâu nhạt hay hoàn toàn đen. Chủng nấm mốc này có thể chịu được pH thấp 2.1-2.2, nhiệt độ thích hợp là 30-33oC và dễ phát triển trên môi trường tinh bột. Aspergillus niger được dùng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để thu nhận các acid hữu cơ như citric acid, gluconic acid, fumaric acid.... Ngoài ra nó còn ứng dụng để thu nhận các chế phẩm enzyme như: amylase, protease, pectinase, glucoseoxydase… 2.3 Tiêu chẩn chọn giống  Là chủng nấm mốc thuần khiết, không lẫn các chủng vi sinh vật khác.  Khả năng thích ứng cao, sinh sản mạnh.  Lên men đường glucose với hiệu suất cao, thời gian lên men ngắn, sản phẩm chính là gluconic acid chiếm tỷ lệ cao.  Sau khi lên men dễ tách sinh khối và sản phẩm.  Khả năng bảo quản dễ dàng, các đặc tính di truyền được bảo tồn trong suốt thời gian bảo quản và sử dụng. 2.4 Môi trường nuôi cấy Trong sản xuất gluconic acid môi trường nuôi cấy cần đáp ứng các yêu cầu sau:  Nồng độ glucose ở mức cao: 150 – 250gL-1  Hàm lượng nitơ thấp: khoảng 20 mM nitơ  Hàm lượng phospho thấp  Bổ sung thêm các chất khoáng, theo Bern Haure (1928) cần thêm 0.7 – 13 mM mangan  pH thích hợp cho nấm mốc phát triển: 4.5 – 6.5, dưới pH < 3 ức chế enzyme glucose oxydase  Tốc độ sục khí cao: có thể lên đến 4 bar Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 8 Chương 3: QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ Trong quá trình sản xuất gluconic acid tùy thuộc và tác nhân trung hòa là NaOH hay CaCO3, điều kiện lên men mà sản phẩm thu nhận có thể là các sản phẩm khác nhau như gluconic acid, calcium gluconate, sodium gluconate. Vì mỗi sản phẩm đều có những vai trò hết sức khác nhau trong lĩnh vực dược phẩm hay trong lĩnh vực thực phẩm. 3.1 Sơ đồ khối Trong khuôn khổ bài báo cáo chúng tôi có đưa ra 3 quy trình công nghệ khác nhau dựa theo sản phẩm thu nhận. Quy trình công nghệ sản xuất gluconic acid và calcium gluconate Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 9 Quy trình công nghệ sản xuất sodium gluconate 3.2 Sơ đồ thiết bị: Chuẩn bị môi trường Thanh trùng Lên men Lọc Cô đặc Tiệt trùngNhân giống Nguyên liệu Giống VSV NaOH Cặn Sodium gluconate Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 10 Chương 4: GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 4.1 Xử lý mật rỉ Mục đích:  Tiêu diệt hệ vi sinh vật gây bệnh ngoại trừ Bacillus, Clostridium.  Tiêu diệt / ức chế các vi sinh vật khác trong môi trường.  Tách các chất không hòa tan trong mật rỉ. Các biến đổi:  Vật lý: có sự thay đổi về gradient nhiệt độ.  Sinh học: các vi sinh vật bị tiêu diệt. Thiết bị: Hình 2: Thiết bị xử lý nhiệt mật rỉ Cấu tạo: thiết bị hình trụ, đáy côn, làm bằng thép không rỉ. Bên trong có hệ thống ống xoắn để gia nhiệt, bên ngoài có lớp vỏ áo để làm nguội. Động cơ gắn với cánh khuấy giúp cho quá trình đảo trộn nguyên liệu. Thông số công nghệ: thực hiện tuần tự theo các bước sau:  Pha loãng mật rỉ với nước (45 – 50%)  Môi trường được đun nóng đến một nhiệt độ nhất định (90 - 1000C)  Giữ ở nhiệt độ đó trong khoảng thời gian 45 – 60 phút.  Làm nguội đến nhiệt độ cần thiết (33-350C đối với đa số nấm mốc)  Sau khi làm nguội nguyên liệu được cho qua thiết bị ly tâm để tách các tạp chất không tan Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 11 Hình 3: Thiết bị ly tâm làm sạch mật rỉ Cấu tạo: thiết bị có dạng hình trụ, bên trong có bố trí các thanh chặn. Khi động cơ truyền động cho rôto bên trong quay, dưới tác động của lực ly tâm các cấu tử không tan sẽ bị văng ra, giữ lại trên các thanh chặn. Thông số công nghệ:  Đường kính trong của rôto: 1000 mm  Số vòng quay lớn nhất: 1500 vòng/phút 4.2 Phối trộn Mục đích: chuẩn bị môi trường lên men cho nấm mốc sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp gluconic acid Thành phần môi trường Môi trường bao gồm:  Glucose 110-150 g L-1  (NH4)2HPO4 0.388 g L-1  KH2PO4 0.188 g L-1  MgSO4. 7H2O 0.156 g L-1  CaCO3 26 g L-1  Môi trường được chỉnh ở pH = 6.5 Các biến đổi:  Vật lý: độ nhớt của dung dịch tăng lên do các cấu tử rắn hòa tan vào dung dịch glucose  Hóa lý: sự chuyển pha rắn sang lỏng của các muối vô cơ trong môi trường hòa tan vào dung dịch khi khuấy trộn. Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 12 Thiết bị: chọn thiết bị trộn có cánh khuấy mái chèo. Hình 4: Thiết bị khuấy trộn Cấu tạo thiết bị bao gồm 1 thùng khuấy, bên trong có gắn 2 cánh khuấy mái chèo được đặt lệch tâm, thành thùng khuấy đặt các thanh chặn. Thiết bị này dùng cho chất lỏng có độ nhớt trung bình. Thông số công nghệ:  Tốc độ khuấy: 200 rpm  pH = 6.5 (hiệu chỉnh bằng H2SO4) 4.3 Nhân giống Mục đích: làm gia tăng lượng tế bào (tăng sinh khối), nhằm tích lũy đủ số lượng bào tử cần thiết để cấy vào môi trường lên men. Phương pháp thực hiện: trong công nghiệp sản xuất gluconic acid quá trình nhân giống vi sinh vật thường được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh (nuôi cấy theo từng mẻ - batch culture). Nhân giống trên môi trường lỏng rất ít được sử dụng, lý do thời gian nuôi kéo dài và hoạt tính enzyme thường không cao so với nuôi cấy bề mặt. Môi trường thường dùng để nuôi cấy nấm mốc thường là môi trường bán rắn với thành phần: cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê, hoặc một số loại hạt, bột kém chất lượng khác. Để làm tăng độ xốp của môi trường, thường trong sản xuất có trộn thêm các phụ liệu khác như vỏ trấu (15–20%). Quá trình nhân giống tiến hành qua nhiều cấp nhân giống trên các khay đựng canh trường đã phối trộn, thực hiện trong phòng nuôi cấy Các biến đổi:  Sinh học: trong suốt quá trình phát triển của nấm mốc theo thời gian nhân giống trong môi trường bán rắn, nấm mốc thường trải qua 3 giai đoạn:  Giai đoạn 1: kéo dài 10–14h. Bào tử bắt đầu trương nở và bắt đầu hô hấp do đó nhiệt độ phòng nuôi phải được duy trì 28–300C.  Giai đoạn 2: kéo dài 14–18h. Hệ nấm bắt đầu phát triển, quá trình hô hấp diễn ra mạnh, nhiệt độ phòng nuôi tăng nhanh. Vì vậy phải thông gió và duy trì độ ẩm môi trường khoảng 80 – 90% trong giai đoạn này. Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 13  Giai đoạn 3: kéo dài 10–12h. Cường độ hô hấp giảm, nhiệt độ môi trường bán rắn giảm. Nấm mốc bắt đầu sinh bào tử.  Vật lý: thành phần môi trường thay đổi, nồng độ cơ chất tại mỗi điểm trên khay nhân giống là khác nhau. Thông số công nghệ:  Độ ẩm của môi trường bán rắn: 58–60%.  Nhiệt độ môi trường: 28–300C.  Thời gian nuôi: 36–72h, theo mỗi cấp nhân giống.  Chiều dày của lớp môi trường tốt nhất: 5–10cm.  Thời gian kết thúc quá trình nhân giống khi thu được số lượng bào tử cần thiết cho quá trình lên men (do nhà sản xuất đặt ra). 4.4 Lên men Mục đích: chuyển hóa glucose thành gluconic acid. Các biến đổi:  Vât lý: quá trình lên men làm cho nhiệt độ trong thùng lên men tăng, cần phải bố trí thiết bị làm mát trong quá trình lên men.  Sinh học: sinh trưởng và trao đổi chất của nấm mốc, sinh khối tăng trong giai đoạn đầu, giai đoạn sau quá trình trao đổi chất diễn ra, hệ quả tạo ra gluconic acid và các sản phẩm phụ khác.  Hóa học và hóa sinh: chuyển hóa glucose thành gluconic acid xúc tác enzyme glucose oxydase Các yếu tố ảnh hưởng: hai yếu tố ảnh hưởng lớn nhất là oxy và pH  Oxy: là chất nền của quá trình oxy hóa glucose. Gradient nồng độ và thể tích oxy vận chuyển qua môi trường ảnh hưởng đến sự chuyển pha của oxy từ thể khí sang thể lỏng. Trong quá trình sản xuất gluconic acid đòi hỏi lượng oxy hòa tan cao, điều này là rất cần thiết cho nấm mốc chuyển hóa các hợp chất hữu cơ trong môi trường thành năng lượng, sinh tổng hợp gluconic acid. Ví dụ, khi Sakurai et al tiến hành sục oxy với áp suất cao lên xấp xỉ 6 bar kết quả đã duy trì được lượng oxy hòa tan 150 ppm. Nghiên cứu cũng cho thấy rằng trong sản xuất gluconic acid A. niger sử dụng oxy tinh khiết nhiều hơn so với khi chúng phát triển ngoài không khí. Theo Kapat et al: khi khuấy trộn với tốc độ 420 rpm và tốc độ thông khí 0.25 vvm, nồng độ oxy hòa tan lúc này là tốt nhất cho sự sản sinh glucose oxidase. Theo Lee et al: để sản xuất đạt năng suất cao thì phải sử dụng áp suất sục khí cao (2-6 bar) lúc này lượng oxy hòa tan trong môi trường có thể đạt đến 150 ppm. Nói chung trong quá trình phát triển của hệ sợi nấm lượng oxy cung cấp không đều, nguyên nhân do kích thước của các bong bóng khí ảnh hưởng nhiều bởi độ nhớt của môi trường nuôi cấy...Nên cần theo dõi trong suốt quá trình sản xuất.  pH: là yếu tố quan trọng trong việc sản xuất gluconic acid vì ở những pH khác nhau A. niger cho những sản phẩm khác nhau như: citric acid , gluconic acid và oxalic acid. Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 14 Việc tích lũy các sản phẩm này dựa vào các giá trị pH trung bình. Ví dụ pH dưới 3,5 tạo điều kiện cho sự tích tụ citric acid, để sản xuất gluconic acid thì pH = 4,5- 7,0 (pH tối ưu là 5.5). Nghiên cứu của Franke khi thu thập dữ liệu về mức độ hoạt động của của glucose oxidase ở các cấp độ pH khác nhau và thu được kết quả : 5% (pH=2.0 ) và 35 % (pH= 3.0) hoạt tính, trên nền tảng 100 % ( pH=5.6) hoạt tính. Hình 5: Nồng độ gluconic acid sinh ra theo thời gian lên men Hình 6: Lượng oxy hòa tan theo thời gian lên men Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 15 Thiết bị: thiết bị lên men bề sâu Cấu tạo: thiết bị này có cấu tạo là một thùng hình trụ đứng được cấu tạo từ thép không rỉ hay lớp kim loại kép có đáy và nắp hình nón, trên nắp có gắn động cơ chuyển đảo và các ống nối cho môi trường và các tác nhân hỗ trợ quá trình lên men, van bảo hiểm và các khớp nối để gắn các dụng cụ kiểm tra. Các bộ phận chính của thiết bị 1) Động cơ 2) Hộp giảm tốc 3) Khớp nối 4) Ổ bi 5) Vòng bít kín 6) Trục 7) Thành thiết bị 8) Máy khuấy trộn tuabin 9) Bộ trao đổi nhiệt dạng ống xoắn 10) Khớp nối 11) Ống nạp không khí 12) Máy trộn kiểu cánh quạt 13) Bộ sủi bọt 14) Máy khuấy dạng vit 15) Ổ đỡ 16) Khớp để tháo 17) Áo 18) Khớp nạp liệu 19) Khớp tháo không khí Xử lý thiết bị với H2SO4 và HNO3 loãng, thông khí trong 24h Tiệt trùng thiết bị bằng hơi nước (0.2 bar), làm nguội bằng tác nhân lạnh thông qua vỏ áo. Hình 7: Thiết bị lên men bề sâu Thông số công nghệ:  Nhiệt độ lên men 340C.  pH dao động 4.5 – 6.5.  Lưu lượng khí 0.25 – 1 vvm.  Áp suất sục khí 1.5 – 2 kg/cm2.  Thời gian lên men 40h.  Thời điểm kết thúc lên men khi nồng độ đường còn lại 0.1%. Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 16 4.5 Lọc Mục đích: loại bỏ sinh khối vi sinh vật trong dịch men. Các biến đổi:  Vật lý: thay đổi khối lượng dịch lên men, màu sắc dung dịch chuyển từ đục sang trong, độ nhớt giảm. Thiết bị: chọn thiết bị lọc khung bản (lọc ép) Cấu tạo: khung lọc và bản lọc đặt xen kẽ, ở giữa ta đặt vải lọc. Ép chặt lại ta được máy lọc khung bản. Khi bã lọc nằm đầy trong khung lọc ta tiến hành rửa bã để tận thu, sau đó làm vệ sinh rồi lọc tiếp. Hình 8: Thiết bị lọc khung bản Thông số công nghệ:  Kích thước màng lọc: 50 μm  Độ ẩm nguyên liệu ~ 90%, độ ẩm bã ~ 30%. 4.6 Acid hóa Mục đích: thu hồi gluconic acid. Các biến đổi:  Vật lý: dung dịch đổi màu đục, độ nhớt tăng  Hóa học: xảy ra phản ứng Calcium gluconate + H2SO4 = gluconic acid + CaSO4  Hóa lý: sự tách làm hai pha rắn và lỏng, kết tủa sinh ra lắng xuống Thiết bị: chọn thiết bị phản ứng có cánh khuấy Thiết bị gồm: vỏ thép hàn có đáy hình nón và nắp phẳng làm bằng thép chịu acid đậy kín bằng mặt lát gỗ. Bề mặt trong của thiết bị được chống gỉ bằng lớp chịu acid. Bề mặt ngoài được phủ lớp cách nhiệt. Trong nắp thiết bị đặt máy trộn bằng thép chịu acid, cửa nối để thoát khí ra khỏi thiết bị. Trong phần nối phía dưới của thiết bị có khớp nối để nhận sản phẩm. Khớp nối bên trong dùng để nạp acid H2SO4. Ở nắp và phần nón bên dưới có các cửa - khe nhìn để sửa chữa, làm sạch và khảo sát thiết bị. Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 17 Hình 9: Thiết bị phản ứng Thông số công nghệ:  Lượng H2SO4 dùng để acid hóa môi trường tương đương với lượng CaCO3 cho vào theo phương trình phản ứng: Calcium gluconate + H2SO4 = gluconic acid + CaSO4  Dung dịch sau acid hóa có pH ≈ 3.7 4.7 Ly tâm Mục đích: tách kết tủa CaSO4, huyền phù trong dung dịch. Các biến đổi:  Vật lý: độ nhớt giảm, tỷ trọng giảm  Hóa lý: sự tách làm hai pha rắn và lỏng riêng biệt Thiết bị: chọn thiết bị ly tâm lắng Cấu tạo máy gồm có hai rôto. Rôto ngoài có dạng hình nón hoăc trụ-nón, rôto trong có dạng hình trụ mà mặt ngoài của nó có gắn vít tải. Rôto trong và rôto ngoài quay cùng chiều nhưng rôto trong quay chậm hơn rôto ngoài 1,5-2 % (khoảng 20-100vg/ph) nhờ hộp giảm tốc vi sai. Rôto trong có đục các lỗ để dẫn huyền phù nhập liệu. Góc nghiêng phần hình nón của rôto khoảng 9-100 . Quá trình lắng xảy ra trong khoảng không gian giữa hai rôto, bã bám vào mặt trong của rôto ngoài và được vít tải đẩy về phía cửa tháo bã. Nước trong đi về phía ngược lại, chảy qua các cửa ở trên đáy rồi đi ra ngoài. Trong phần rôto không bị ngập nước, bã vừa được đưa ra khỏi rôto vừa được làm khô. Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 18 Hình 10: Máy ly tâm lắng nằm ngang Thông số công nghệ:  Đường kính trong của roto: 325 mm  Số vòng quay của roto: 3500 vòng/phút 4.8 Trao đổi ion Mục đích:  Khai thác: thu nhận acid gluconic  Hoàn thiện : tách các tạp chất ra khỏi acid Các biến đổi : sự tương tác tĩnh điện giữa các cấu tử mang điện trong dung dịch lên men với các hạt nhựa mang điện tích trái dấu. Phương pháp thực hiện : Do acid gluconic tích điện âm nên sẽ bị hấp phụ bởi anionit có các nhóm điện tích là base. Khi đó các ion âm chủ yếu là acid gluconic (ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như citric acid …) hấp phụ trên hạt nhựa (pha tĩnh) giữ lại trên cột còn các phần tử khác (ion dương và tạp chất không tích điện ) do không bị giữ lại bởi pha tĩnh nên bị loại khỏi cột. Do ái lực khác nhau giữa các ion với nhựa anionit và sự phản hấp phụ do dung dịch rửa giải, ion trao đổi khuếch tán vào dung dịch rửa giải. Ta dùng dung dịch giải hấp phụ là HCl loãng để lôi cuốn gluconic acid ra khỏi cột. Thông số công nghệ :  Nhựa trao đổi anionit sử dụng là anionit có nhóm điện tích –CH2N+R3 ( có khoảng pH hoạt động rộng với dung lượng trao đổi ion là 4mM OH-/g ). Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 19 4.9 Cô đặc Mục đích: nâng cao nồng độ gluconic acid trong sản phẩm. Các biến đổi:  Vật lý:  Hệ số truyền nhiệt giảm  Độ nhớt tăng, khối lượng riêng tăng  Thể tích dung dịch giảm  Hóa lý: sự bốc hơi nước Thiết bị: sử dụng thiết bị cô đặc chân không Cấu tạo: máy gồm 3 bộ phận chính: buồng đốt ngoài, buồng bốc và thiết bị ngưng tụ.  Buồng đốt ngoài: thiết bị thường dùng các loại ống có đường kính d25, và d38, chiều dài của ống truyền nhiệt là bội số của 0.5m (tối thiểu là 0.5m, tối đa là 9m), ống thường bố trí ở đỉnh tam giác đều với bước ống s khoảng (1.3–1.5)d0. Mục đích: gia nhiệt cho hỗn hợp dung dịch lỏng tới nhiệt độ sôi tai áp suất làm việc.  Buồng bốc: thiết bị có dạng hình trụ với đường kính lớn. Nhiệm vụ chủ yếu của bường bốc là tách hổn hợp lỏng – hơi thành những giọt lỏng rơi trở lại.  Thiết bị ngưng tụ: đưa dòng nước lạnh tiếp xúc với dòng hơi. Hình 11: Thiết bị cô đặc chân không Thông số công nghệ:  Áp suất cô đặc chân không: 0,06 atm  Nhiệt độ cô đặc: 50 - 60 0C Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 20 Chương 5: SẢN PHẨM 5.1 Sản phẩm  CTPT : C6H12O7  Tên gọi đầy đủ: 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoic acid  pKa: 3.7  Nhiệt độ nóng chảy (dung dịch 50%) : trên 120C  Nhiệt độ hóa hơi (dung dịch 50%) : hơn 1000C  Khối lượng riêng: 1.24 g/ml  Màu sắc: không màu tới nâu Gluconic acid: là acid hữu cơ nhẹ, không ăn mòn, không độc, phổ biến trong các loài thực vật, hoa quả và các thực phẩm khác như gạo, thịt, sản phẩm sữa, rượu (lên đến 0,25%), mật ong (lên đến 1%), và dấm ăn. Gluconic acid được ứng dụng làm chất tạo vị chua (E574) trong một số thực phẩm như rượu vang, nước hoa quả.... Nó còn làm chất tẩy rửa các thiết bị của dây chuyền chế biến hay thiết bị lên men trong công nghiệp thực phẩm. Chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm:  Trạng thái: dung dịch lỏng, min 50% w/v.  Màu sắc: sáng ánh màu vàng.  Mùi vị: mùi chua nhẹ của giấm.  Mật độ tương đối: 1,2 – 1,24.  Chloride: max 0,05%.  Sulphate: max 0,05%.  Sắt: max 0,005%.  Kim loại nặng (như chì): max 0,002%.  Vận chuyển: thùng HDPE. Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 21 5.2 Sơ đồ chuyển hóa Có nhiều phương pháp sản xuất gluconic acid: hóa học, điện hóa, hóa sinh, bioelectrochemical, tại đó sử dụng các tác nhân oxy hóa khác nhau. Tuy nhiên trong thực tế việc sử dụng quá trình lên men sử dung A. niger được ứng dụng rộng rãi, bên cạnh đó những quá trình sản xuất sử dụng G. oxydans cũng đem lại những kết quả đáng chú ý. Hình 12: Sơ đồ tổng quát chuyển hóa glucose trong các vi sinh vật Chú thích:  1-2-3-4-7: A. niger, Penicillium.  1’-1’’-3-4-7: Gluconobacter oxydans  1’-1’’-3-5-6: Acetobacter và Pseudomonas savastanoi  1’-1’’-3-4-5’-6’: một số vi khuẩn khác Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 22 5.2.1 Sản xuất từ Aspergillus niger và Penicillium luteum Hình 13: Sơ đồ chuyển hóa glucose thành gluconic acid bởi A. niger Sự có mặt của ion Ca2+ làm cho A. niger sinh tổng hợp đồng thời 2 enzyme đó là glucose oxidase và catalase, làm thay đổi quá trình chuyển hóa glucose từ con đường EMP sang con đường oxy hóa trực tiếp dưới xúc tác của các enzyme. Gluconic acid (pentahydroxycaproic acid) được sản xuất từ glucose bằng phản ứng loại bỏ hydrogen, xúc tác bởi emzyme glucose oxydase, khi đó nhóm aldedyde trên C-1 của β-D-glucose sẽ chuyển hóa thành nhóm carbonxyl, bên cạnh đó còn có glucono-δ-lactone (C6H10O6) và hydrogen peroxide. Ngoài ra glucono-δ-lactone cũng thủy phân thành gluconic acid, giai đoạn này có thể sảy ra một cách tự nhiên hoặc có enzyme gluconolactonase xúc tác, trong khi hydrogen peroxide phân hủy thành nước và oxy dưới tác dụng của enzyme peroxidase. A. niger sản xuất tất cả các enzym cần thiết cho các chuyển đổi của glucose thành axid gluconic, trong đó bao gồm glucose oxidase, catalase, lactonase và mutarotase (phục vụ để tăng tốc độ phản ứng).  Trong quá trình sản xuất sự tích tụ của lactone (Glucono-δ-lactone) trong môi trường gây hiệu ứng xấu đến glucose oxidase, và việc sản xuất acid gluconic bị gián đoạn. Tuy nhiên sự có mặt của lactonase (A. niger tiết ra) làm cho sự thủy phân Glucono-δ-lactone sẽ diển ra nhanh hơn, điều kiện phản ứng này gần như trung tính, điều này có thể giải quyết bằng cách bổ sung NaOH hay CaCO3,.  Catalase xúc tác cho phản ứng phân hủy H2O2 thành O2 và H2O Quá trình lên men làm cho pH môi trường giảm xuống làm ức chế enzyme glucose oxidase dẩn đến sản suất bị dừng lại, để kiểm soát pH biện pháp đã được đưa ra là sử dụng CaCO3 với lượng vừa đủ (thừa CaCO3 sẽ làm chậm sự lên men Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 23 do CaCO3 ngăn cản sự tiếp xúc tự do giữa môi trường và hệ sợi nấm). Nhưng vấn đề quan trọng là tính khó tan của Calcium gluconate trong nước (4 % tại 30 °C), tại nơi tập trung glucose cao lên đến 15 %, xảy ra sự quá bão hòa, và nếu nó vượt quá giới hạn calcium gluconate sẽ bị kết tủa trong hệ sợi nấm, điều này làm ngăn cản vận chuyển oxy. Sản xuất gluconic acid đã được nghiên cứa tổng quát bởi May et al, Moyer, Wells et al, và Stubbs et al sử dụng A. niger , Currie et al sử dụng Penicillium luteum và A. niger cho hiệu suất tạo gluconic acid tới 90 % trong 48–60 h. Sau đó Moyer et al trong quá trình nghiên cứu sử dụng A. niger đã cho hiệu suất tạo gluconic acid lên đến 95% trong điều kiện lý thuyết (dung dịch glucose: 150 - 200 g/L trong 24 h). Porges et al thấy rằng quá trình có thể gián đoạn do sử dụng khuẩn ty chín lần liên tục tại nơi cấy được phục hồi bằng lọc hay tách ly tâm. Những phát hiện của Moyer et al cho thấy: hiệu quả hơn 95% có thể đạt được nếu thêm vào dung dịch bao gồm glucose 250 g / L và hợp chất của Bo 1% sau giai đoạn phát triển của nấm, với sự tái sử dụng khuẩn ty trong vòng 24 h mỗi lần. 5.2.2 Sản xuất gluconic acid từ enzyme glucose oxidase Dựa trên phản ứng chuyển đổi glucose bằng tác nhân nấm sợi (tiết ra enzyme glucose oxidase, enzyme lần đầu được cô lập từ Penicillium glaucum bởi Müller. Emzyme được bảo quản trong đường (crystallised) bởi Kusai et al, từ loài P. amagasakiense. Glucose oxidase trước đây được biết như notatin. Glucose oxidase như là flavoprotein: một hợp chất gồm protein kết hợp hoặc với nhóm ngoại FAD hoặc với FMN (gọi là các Flavin). Glucose oxidase là enzyme có nhóm ngoại FAD, khi oxy hóa glucose, dưới tác dụng của enzyme này sẽ tạo thành sản phẩm trung gian là Glucono-δ-lactone, chất này kết hợp với nước và chuyển thành gluconic acid. Giai đoạn sau có thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc có thể do enzyme glucono-lactonase xúc tác. Glucose oxidase là glycoprotein. Phương pháp sử dụng enzyme trong sản suất gluconic acid có tiềm năng phát triển vì không phải qua giai đoạn tinh sạch sản phẩm. Nếu enzyme được cố định trong màng polymer (có thể trao đổi anion) được tao ra bằng cách ghép polyethylene với 4-vinylpyridine. Tuy nhiên phương pháp này không được dùng trong công nghiệp và sẽ không được cân nhắc xem xét lại vì lý do kinh tế. 5.2.3 Sản xuất gluconic acid từ vi khuẩn  Vi khuẩn acetic và Pseudomonas savastanoi là những vi khuẩn đầu tiên được ứng dụng vào sản xuất gluconic acid. Không giống như nấm mốc trong quá trình chuyển hóa vi khuẩn tiết ra glucose dehydrogenase để oxy hóa glucose thành gluconic acid, tiếp đến bị oxy hóa thành 2-ketogluconate , cuối cùng bị oxy hóa thành 2,5-diketogluconate Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 24 Hình 14: Sơ đồ chuyển hóa glucose thành gluconic acid bởi Acetobacter và Pseudomonas  Gluconobacter oxydans: vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, oxy hóa glucose qua hai con đường: đầu tiên đòi hỏi sự photphoryl hóa, bằng cách oxy hóa theo con đường pentose phosphate. Sản xuất gluconic có hạn chế ở quy mô công nghiệp vì do sự oxy hóa tới các oxogluconic acid, khả năng của Pseudomonas và Gluconobacter spp trong sản xuất gluconolactone và gluconic acid đã được khai thác trong việc sản xuất trên quy mô thương mại chủ yếu trong sản xuất lactone. Gluconic acid GVHD: PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn Trang 25 Chương 6: THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ 6.1 Nguyên liệu Glucose được sử dụng là nguồn carbon cho hầu hết các loài vi sinh vật sản xuất gluconic acid.  Kundu và Das thu được một lượng lớn gluconic acid từ môi trường glucose hay nguyên liệu từ sự thủy phân tinh bột (starch hydrolysat