Đề tài Công nghệ lên men - Methionine

fhydrylase, [11] serine hydrooxymethyle transferase. Ngoài ra trong quá trình lên men cũng có những biến đổi khác như: + Một số phản ứng hóa học khác có thể xảy ra do sự thay đổi nhiệt độ và thành phần hóa học trong canh trường + Tăng nhiệt độ do quá trình lên men tỏa nhiệt + Sự sinh khí CO2 ● Các yếu tố ảnh hưởng: + Nhiệt độ: cần được duy trì ở nhiệt độ tối ưu cho vi sinh vật tổng hợp methionine. Cao quá hay thấp quá sẽ ảnh hưởng đến hoạt tính của vi sinh vật. Nhiệt độ cao làm giảm hoạt tính bất thuận nghịch. Nhiệt độ thấp thì biến đổi là thuận nghịch nhưng nhiệt độ thấp thì thời gian lên men sẽ phải kéo dài mới đạt được một lượng sản phẩm như yêu cầu. Bản thân quá trình lên men cũng làm tăng nhiệt độ, do đó điều chỉnh nhiệt độ là yếu tố quan trọng trong suốt quá trình. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 16 + pH đầu: pH cũng gây ảnh hưởng tương tự như nhiệt độ. Tuy nhiên chỉnh pH trong quá trình lên men là rất khó. Do đó, pH ban đầu của hỗn hợp lên men có yếu tố quyết định. Trong thời gian lên men, không có sự điều chỉnh pH. + Nồng độ chất khô: Chất khô là những thành phần cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật. Nồng độ chất khô thấp, vi sinh vật bị thiếu nguồn dinh dưỡng, thiếu cơ chất tạo sản phẩm nên hiệu suất lên men sẽ không cao. Nồng độ chất khô cao quá thì sẽ ức chế vi sinh vật. Do đó, cần phải chọ một nồng độ thích hợp nhất. + Tỷ lệ giống cấy: Tuỳ thuộc vào lượng sản phẩm, thể tích môi trường, nồng độ chất khô mà chọn tỷ lệ giống cấy cho phù hợp. Thấp quá thì thừa cơ chất và ít sản phẩm. Nhiều quá thì vi sinh vật không có được điều kiện tối ưu nên hoạt tính cũng không cao. + Lượng oxy hòa tan, tốc độ dòng khí và tốc độ khuấy trộn: C. lilium là vi sinh vật kị khí tùy tiện, do đó đòi hỏi một lượng oxi nhất định cho sự sinh trưởng. Từ đồ thị trực tuyến của DO, tốc độ dòng khí và tốc độ khuấy trộn ( Hình. 7) thể hiện rõ ràng nhu cầu mạnh mẽ của C.lilium M128 trong vòng 2 giờ đầu tiên của quá trình lên men. Vận tốc dòng khí bắt đầu tăng cho đến khi đạt giá trị tối đa là 18 lpm. Tại thởi điểm này tốc độ khuấy trộn bắt đầu tăng và thay đổi để điều khiển DO về giá trị 40%. Sau khoảng 24h, sự phát triển của tế bào đã tiến tới pha tĩnh của nó và do đó giảm nhu cầu oxi thể hiện bởi sự giảm dần giá trị của agitation and airflow rate values ( Hình. 7). Hình. 7. Cascade control of DO during methionine production by C. lilium M-128 showing the changing oxygen demand reflected by the agitation speed and air flow rate values. DO ( *), agitation speed (₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ), airflow rate ( ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ₃ ). + Một yếu tố có ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men là lượng cystein được thêm vào. Ở đây, cystein được thêm vào với hàm lượng 1-3 g/l, sai số 0.5 g/l. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 17 Với sự có mặt của cystein, nhu cầu năng lượng dưới dạng ATP giảm đi 20% so với khi không có mặt cystein. Sự bổ sung cystein làm giảm đi sự khắc khe trong phản ứng tạo OaA (oxaloacetate) từ PEP (phosphoenol pyruvate) do đó làm tăng lượng methionine thu được. Hình 8. Metabolic flux analysis showing effect of cysteine on of methionine production by mutant strain. The flux values have been normalized based on 100 mmol g−1 h−1 of glucose. Flux values for fermentation with cysteine supplementation are given in italics [134]: Glc6P, glucose 6 phosphate; Fru6P, fructose 6 phosphate; GaP, glyceroldehyde 3 phosphate; G3P, 3 phosphoglycerate; PEP, phosphoenol pyruvate; Pyr, pyruvate; AcCoA, acetyl coenzyme A; OaA, oxaloacetate; Isocit, isocitrate; aKG, alpha keto glutarate; SucCoA, succinyl coenzyme A; Suc, succinate; Mal, malate; Asp, aspartate; O-Shs, orthoacetylhomoserine; Meth, methionine; Lys, lysine; Thr, threonine; Ribu5P, ribulose 5 Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 18 phosphate; Rib5p, ribose 5 phosphate; Xyl5p, xylulose 5 phosphate; Sed7P, sedoheptulose 7 phosphate; E4P, erythrose 4 phosphate; ADP, adenosine diphosphate; NADH, reduced nicotinamide adenine dinucleotide; FADH, reduced Flavin adenine dinucleotide; NAD, nicotinamide adenine dinucleotide; FAD, Flavin adenine dinucleotide; ATP, adenosine triphosphate Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 19 ● Thiết bị_thông số công nghệ: Qui mô phòng thí nghiệm: bình thủy tinh 15 lit 1.Stainless steel lid with equipment (electrodes, inlets, connection stirring motor to stirring shaft, cooling system, aeration, exhaust air, sampling) 2.single-wall glass vessel 3.sampling bottle 4.rotameter aeration control 5.heating / cooling plate connected with heat and cooling system 6.bottles for addition / feeding with pump system (acid, base, glucose, anti- 7.automatic control technique with display unit Hình 9: Picture of the bioreactor (company Infors, type Minifors) and the automatic control unit (controlling of temperature and cooling system, aeration rate, foam sensor, pumping systems for acids, bases, anti- foam substances and fed batch supply). Chú thích : 1. Thiết bị nắp đậy bằng thép không gỉ (điện cực, ống vào,kết nối motor cánh khuấy với cán cánh khuấy, hệ thống lám lạnh, quạt thổi CO2 vào, ống xả khí, bộ phận lấy mẫu). 2. Các ống bằng thủy tinh 3. Chai lấy mẫu 4. Điều khiển dòng khí vào bằng lưu lượng kế kiểu phao 5. Gia nhiệt/ làm nguội bản mỏng với hệ thống gia nhiệt làm nguội 6. Các chai để thêm/ châm cơ chất với hệ thống bơm (acid, base, glucose, anti- foam) 7. Bộ phận hiển thị điện tử các thông số công nghệ của quá trình. Quy mô công nghiệp : Thể tích bình lên men : thể tích sử dụng 1m3 Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 20 Hình 10 :Bình lên men Các thông số: + pH: 7.0 + Nhiệt độ: 30 oC + Nồng độ oxi hòa tan (DO): 40% so với mức bão hòa + Tốc độ khuấy trộn: 150rpm + Thời gian: 48h 6. Tinh sạch: ●Mục đích công nghệ: thu nhận và tinh sạch methionine từ canh trường sau lên men. ●Phương pháp: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 21 a)Tách sinh khối : - Mục đích :tách bỏ xác vi sinh vật và tạp chất rắn khỏi dung dịch sau lên men -Thiết bị :ly tâm lắng . Thiết bị gồm thùng quay hình trụ có vách đục lỗ bên ngoài bọc vải lọc,moteur và trục quay. Khi thùng quay với tốc độ cao tạo ra lực li tâm làm dung dịch trong thùng quay ép sát vào vách thùng quay .Phần lỏng cùng với các cấu tử hòa tan sẽ qua vải lọc ra ngoài còn chất rắn là xác vi sinh vật bị giữ lại bên trong thùng quay. - Thông số công nghệ : tốc độ vòng quay 1000 vòng /phút , thể tích thùng quay : 2m3 Canh trường sau lên men Tách sinh khối Cô chân không Acid hoá Trao đổi ion Kết tinh Sản phẩm Sấy Xử lí than hoạt tính Li tâm Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 22 Hình 11. Thiết bị ly tâm lắng b) Xử lí than hoạt tính : -Mục đích :tách bỏ các chất màu ,mùi loại một số tập chất tan ra khỏi dung dịch lọc c) Trao đổi ion : -Mục đích : thu methionine bằng cột trao đổi ion -Cách tiến hành : cho dịch lên men vừa lọc qua cột trao đổi ion để thu Methionine .Chọn cột trao đổi ion Amberlite IR-120(H+) ,là loại cationit ,trao đổi ion dương ,kiểu acid mạnh , nhóm chức -SO3H ,cỡ hạt từ 100-200µm. Quá trình được lặp lại cho đến khi không còn methionine được phát hiện. Cột thu được đem rửa với nước cất và tách Methionine bằng cách xử lý với NH4OH 1N * Amberlit IR-120 (tên nhựa trao đổi ion) : - Kiểu nhựa : HC sulfo - Cationit loại acid mạnh (bắt các cation) - Dung lượng trao đổi : 4,2 mgđl/g - Hãng Down, Mỹ : 2,6 mgđl/ml - Acid mạnh : -SO3H - Hiệu quả trong phạm vi pH = 1 – 14. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 23 (“Sách tra cứu hóa sinh”-Ngô Tuấn Kỳ. NXB Khoa học kĩ thuật, 1984) d) Cô chân không : -Mục đích :làm tăng nồng độ Methionine trong dung dịch sau rửa giải ,chuẩn bị cho quá trình kết tinh Hình 12 : Thiết bị cô đặc chân không e) Acid hóa : -Dùng H2SO4 , chỉnh về pH = 5.7 gần với điểm đẳng điện của Methionine để dễ kết tủa f) Kết tinh : - Mục đích :khai thác ,thu Methionine ở dạng rắn nguyên chất - Tốc độ kết tinh phụ thuộc :hiệu số nồng độ lớp dung dịch và trên bề mặt tinh thể , nhiệt độ,độ nhớt ,bề dày lớp dung dịch ,hình dạng và kích thước tinh thể - Thiết bị : thiết bị nấu dưới áp suất chân không ,cấu tạo giống thiết bị cô đặc nhưng vì nồng độ lớn nên bán kính và chiều cao thấp hơn , có bộ phận khuấy đảo tốc độ chậm để ngăn tinh thể lắng xuống đáy thiết bị và tăng tốc độ kết tinh .hệ thống thiết bị phải bao gồm cả hệ thống kiểm tra như : đo nhiệt độ , đo áp suất ,hệ số quá bão hòa ,kích thước và số lượng tinh thể - Độ tinh sạch = 99 % Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 24 Hình 13:Sơ đồ quá trình kết tinh g) Li tâm : - Mục đích :thu tinh thể Methionine - Thiết bị :li tâm lắng ,nằm ngang - Thông số công nghệ :hiệu suất thu hồi = 90 % ; độ ẩm sau li tâm 4 % Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 25 Hình 14:Thiết bị li tâm thu tinh thể h) Sấy : -Mục đích :giảm hàm ẩm để bảo quản sản phẩm -Thiết bị : chọn thiết bị sấy tầng sôi.Cấu tạo : gồm thùng dạng hộp hay trụ ,bên trong có lớp lưới để đỡ vật liệu và phân phối tác nhân sấy .Không khí nóng được thổi từ phía dưới lên với vận tốc sao cho lực đẩy của không khí cân bằng với trọng lực tác động lên hạt vật liệu làm cho vật liệu ở trạng thái lơ lửng ,diện tích tiếp xúc với tác nhân sấy lớn làm tăng hiệu quả quá trình sấy - Thông số công nghệ : +Tốc độ dòng tác nhân sấy : 1-2 m/s +Lưu lượng không khí :2.5 m3/h +Nhiệt độ không khí khi rời caloriphe :120  C +Độ ẩm vật liệu sau sấy :0.3-0.4 % +Chiều dài thân máy :2,5 m ; chiều rộng 0,9 m ; chiều cao 3,5 m +Thời gian sấy :10-15 giây +Hiệu suất thu hồi :trên 90 % Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 26 1.Quạt làm mát , 2.Xyclon thu bụi , 3.Vít tải ,4. Cụm đánh tơi , 5.Buồng sấy ,6.Cửa ra sản phẩm, 7.Quạt cấp nhiệt sấy ,8. Buồng đốt , 9.Quạt hút ẩm ,10 .Thiết bị lọc bụi ,11.Bơm hoàn lưu Hình 15: Sơ đồ thiết bị sấy tầng sôi Hình 16:Thiết bị sấy tầng sôi - Bảo quản sản phẩm ở 4 oC Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 27 IV/ SẢN PHẨM : 1. Kết quả: Hàm lượng methionine thu được sau 48h lên men tối đa là 2.3 mg ml-1. Tốc độ tăng trưởng cực đại của C. lilium là 0.18 h-1 và hệ số X / S là 0.34 gg-1. và không bị hạn chế bởi kiểu đột biến của vi sinh vật. Một trong những tính chất của thể đột biến bằng tác nhân NTG là nông độ sinh khối sau 48h lên men chìm là khoảng 17 gl-1, lượng này gấp đôi so với thể đột biến nhờ tác nhân là tia UV. Hình 17. Methionine production, growth and glucose utilisation by C. lilium M-128 showing the concentration profiles for five batch experiments. Run 1 (₃ ), Run 2 (k), Run 3 (₃ ), Run 4 (^), Run 5 (2). Average trend for five batches ( *). 1. Chỉ tiêu chất lượng: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 28 Chỉ tiêu Yêu cầu Hình dạng, cấu trúc Bột tinh thể trắng Độ đồng nhất Đạt yêu cầu Góc quay mặt phẳng phân cực + 23.0 - + 24.0o Phép thử ( assay),% 99.0 – 101.0 pH 5.6 – 6.1 Tổn thất do sấy,% ≤ 0.20 Kim loại nặng ( Pb), ppm ≤ 10 Hệ số chuyển đổi, % ≥ 98.0 Tro, % ≤ 0.10 Chloride, % ≤ 0.020 Sulphate, % ≤ 0.020 Arsenic (As2O3), ppm ≤ 1 Iron (Fe), ppm ≤ 10 Amino acid khác Không có 2. Giới thiệu về sản phẩm: *Lịch sử: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 29 Methionine, một amino acid thiết yếu, lần đầu tiên được tách (isolate) từ protein bởi Mueller năm 1922 và cấu trúc của nó được nhận ra như là dẫn xuất з-methylthiol của amino-n-butyric acid bởi Barger và Coyne vào năm 1928. Chức năng của methionine trong transmethylation (chuyển nhóm methyl) được suy ra gián tiếp từ bằng chứng thu được trong nghiên cứu dinh dưỡng động vật của Vigneaud et al. vào năm 1939. Người đã quan sát thấy rằng homocysteine có thể thay thế methionine trong chế độ ăn của động vật nếu ta bổ sung choline hoặc betaine. Hơn một thập kỷ sau đó, năm 1953, Cantoni khẳng định chức năng xác định của methionine như là một nhân tố chính chứa nhóm methyl trong S-adenosylmethionine (SAM). Trong 1958, Tabor et al. thành lập vai trò methionine như là một precursor của các polyamine. Một chức năng quan trọng khác của methionine là sự tham gia vào quá trình dịch mã m-RNA như là amino acid cuối cùng của chuỗi peptide, đây là kết quả nghiên cứu của Adams và Capecchi năm 1966 và Clark và Marcker vào năm 1968. Những khám phá của quá trình sản xuất acid glutamic từ vi sinh vật kích thích nghiên cứu sự sản xuất các amino acid khác bằng phương pháp vi sinh. Kể từ đó, đã có nhiều báo cáo về những nỗ lực của một số nhà nghiên cứu về chủng vi sinh vật cho sản xuất methionine bằng phương pháp lên men chìm. Việc sản xuất methionine bằng canh trường chìm sản xuất ra các L- acid amin có hoạt tính sinh học. Phương pháp này sẽ có lợi thế hơn các phương pháp tổng hợp và bán tổng hợp vì có thể đạt được với một nồng độ cao. Mặc dù một số amino acid khác như: Lysine, threonine, isoleucine và histidine, đang được sản xuất thành công bằng cách lên men, vẫn chưa có ứng dụng cụ thể nào của phương pháp lên men sản xuất L-methionine theo phương pháp lên men chìm. Việc sản xuất L-Methionine bằng canh trường nuôi cấy chìm chưa được sử dụng thương mại do những vi sinh vật, hoặc được đột biến hoặc tái tổ hợp gen, sản xuất không đủ cao lượng methionine. Nhu cầu methionine mỗi năm trên toàn cầu khoảng 350.000 tấn dưới dạng DL- methionine sản xuất theo phương pháp hóa học. Hầu hết các nhu cầu methionine xuất phát từ gia cầm và thức ăn chăn nuôi công nghiệp và các nhu cầu còn lại là cho chữa trị lâm sàng. L- methionine là hình thức thu được từ quá trình racemic DL-methionine. Quá trình phát triển diễn ra thông qua nhiều giai đoạn, mỗi giai đoạn đòi hỏi một đầu tư đáng kể trong nỗ lực nghiên cứu, nguồn tài trợ và có tính kinh tế chưa được cao khi dùng phương pháp hóa học. Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng L-methionine trong y học đã tăng lên, tạo ra một thị Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 30 trường riêng biệt cho L-methionine. Gần đây, nhờ sự phát triển trong lĩnh vực công nghệ sinh học, tính khả thi về thương mại khi sản xuất L-methionine cần phải được tái kiểm tra. *Tính chất: *Một số sản phẩm thương mại: Tính chất Lượng Phân tử lượng 149.22 Nhiệt độ phân hủy 283 Độ tan (g/100g; 25°C) 3.5 pKCO OH 2.28 pKNH 3 + 9.21 pH đẳng điện 5.74 Tỷ trọng (g/cm3) 1.34 Vị trong dung dịch với nước Có vị Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 31 *Vai trò sinh học và y học: Methionine cần thiết trong chế độ ăn uống của con người và các loài động vật có vú ở một lượng nhỏ cho tốc độ tăng trưởng bình thường và các chức năng cơ thể. Ở con người, một số bệnh di truyền như cystathioninuria và Homocystinuria được gây ra bởi khiếm khuyết của sự trao đổi methionine. Cả cystathioninuria và homocystinuria được di truyền như nhũng gen lặn. Bệnh nhân có thể có một hoặc nhiều triệu chứng như: chậm trí, động kinh, có vấn đề về tiểu cầu, bàn chân quẹo, xương dị thường, bị ảnh hưởng thị giác, thính giác… Chế độ ăn uống thiếu methionine dẫn đến các bệnh như ngộ độc máu, thấp khớp, liệt cơ, rụng tóc, trầm cảm, bệnh tâm thần phân liệt, bệnh Parkinson, tổn thương gan, và suy yếu khả năng sinh trưởng… Chức năng của methionine là xây dựng khối protein và là nguồn polyamines. Nó là một precursor của SAM, trong đó cung cấp nhóm methyl không bền và sulfur đến hơn 100 phản ứng. Nhiều trong số những phản ứng tham gia vào quá trình tổng hợp những hợp chất ảnh hưởng đến sự sống còn của tế bào và cơ quan chức năng. Nó hoạt động như là tác nhân kích thích sử dụng chất béo và ngăn chặn sự tích lũy chất béo trong gan do tăng lecithine. Methionine cần thiết cho việc hấp thu, vận chuyển và hoạt động của kẽm và selen trong tế bào. Methionine là một tác nhân chelating, nó giúp bài tiết cadmium và thủy ngân trong cơ thể. Ở người, methionine được sử dụng để sản xuất creatinine dưới sự điều khiển của não bộ. Những người mắc bệnh AIDS có một mức độ thấp methionine. Một số nhà nghiên cứu cho rằng lượng methionine thấp ở những bệnh nhân AIDS có thể giải thích một số khía cạnh của sự suy giảm xảy ra trong hệ thần kinh gây ra các triệu chứng bao gồm cả mất trí. Ngoài ra, những thử nghiệm sơ bộ còn cho thấy methionine có thể hỗ trợ chữa trị một số triệu chứng của bệnh Parkinson. Methionine còn đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh khả năng sinh lý của folate. Thiếu methionine, folate bị giữ lại trong gan dưới dạng 5-methyl-tetrahydrofolate, gây ra sự thiếu hụt folic acid tạm thời. Điều này cũng thấy trong sự thiếu hụt Vitamin B12 và có thể đây là một yếu tố quan trọng liên quan đến nguyên nhân gây ra d ị ứng và thiếu máu ở một số bệnh nhân. L-methionine được sử dụng rộng rãi trong y học với nhiều mục đích khác nhau, bao gồm cân bằng pH, parental nitrition, phụ gia cho dược phẩm, và các ứng dụng khác. Trong thực tế, nó Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 32 là một trong 800 loại thuốc đứng đầu trong y khoa. D- methionine không tốt cho con người và có thể có phản ứng dị ứng với D-methionine hoặc hỗn hợp racemic của DL-methionine . *Vai trò công nghiệp: Việc sử dụng methionine trong công nghiệp chăn nuôi gia súc, gia cầm có ảnh hưởng gián tiếp đến con người. Methionine là một acid amin giới hạn đầu tiên trong chế độ dinh dưỡng cho gia cầm. Việc tổng hợp methionine trong thức ăn chăn nuôi đã bắt đầu từ những năm 1950 ở mức độ đơn giản bằng cách thêm vào những thành phần tổng hợp. Sự thiếu methionine đã trở thành một vấn đề trong những năm gần đây do sự gia tăng việc sử dụng protein từ đậu nành. Chim biến đổi gen để tăng khả năng chịu nhiệt hay khả năng đẻ trứng. Methionine được tổng hợp cùng với cysteine và choline và cần thiết cho sản xuất keratin trong lông. Trong chăn nuôi, để nâng cao năng suất, các chế độ ăn uống phải chứa đầy đủ số lượng của tất cả các chất dinh dưỡng, bao gồm các acid amino. Sự thiếu methionine, acid amin không thay thế, sẽ làm giảm hiệu quả thức ăn, tăng trưởng chậm, và có thể dẫn đến suy dinh dưỡng. Bổ sung từng acid amin làm tăng hiệu quả thức ăn chuyển đổi, do đó làm giảm chi phí tính trên đơn vị động vật. Amino acid có thể được sử dụng trong chăn nuôi với mục đích chăm sóc sức khỏe. Methionine được sử dụng như là một tác nhân acid trong nước tiểu , bởi vì sự bài tiết ion sulfate làm giảm pH nước tiểu. Ion sulfate cũng thay thế phosphat và do đó hỗ trợ sự hòa tan và ngăn ngừa đá thận và bàng quang đá. V/ THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ: 1.Sản xuất Methionine sử dụng Corynebacterium glutamicum DSM20300 Bản thân Corynebacterium glutamicum DSM20300 thuần chủng ban đầu không có khả năng tạo ra methionine nhiều hơn nhu cầu thiết yếu của bản thân vi sinh vật. Điều này được giải thích là do cơ chế ức chế ngược thể hiện trong hình dưới đây: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 33 Với Corynebacterium glutamicum DSM20300, người ta tiến hành nuôi cấy ba mẫu trong cùng điều kiện với thành phần môi trường cơ bản là giống nhau. *Môi trường : 100ml môi trường SMM cho mỗi thí nghiệm Cách pha chế môi trường: môi trường SMM được pha chế từ 4 dung dịch sau: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 34 Đồng thời thêm các tiền chất sinh tổng hợp khác nhau và lần lượt vào các mẫu: + Mẫu 1: không thêm gì + Mẫu 2: thêm 0.5g/l homoserine Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 35 + Mẫu 3: thêm 0.5g/l homocystine Và kết quả như sau: Mẫu 1: 5.5 mg/l L-methionine được tạo thành sau 24h, và sau 48h thì giảm xuống còn 4 mg/l. Mẫu 2: 11 mg/l L- methionine được tạo thành sau 24h, và sau 48h thì cũng giảm xuống còn 4 mg/l. Mẫu 3: kết quả thu được xấp xỉ mẫu 1. Từ kết quả trên ta có thể đưa ra kết luận: Sự them các tiền chất sinh tổng hợp không có ảnh hưởng đáng kể đến lượng methionine thu được, chúng chỉ có tác dụng trong 24h đầu. Và giá trị 4mg/l chỉ đủ để cung cấp cho nhu cầu thiết yếu của vi sinh vật. Với Corynebacterium glutamicum DSM20300 đột biến bằng tác nhân là tia UV thì lượng methionine sản xuất được là 1g/l. Đây cũng là một giá trị triển vọng và cần thời gian để nghiên cứu sâu hơn nữa. 2.Sản xuất methionine sử dụng Corynebacterium glutamicum KY10574: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 36 Corynebacterium glutamicum KY10574 là vi sinh vật do một công ty của Nhật Kyowa Hakko Kogyo Ltd.. thu nhận được. Những thong tin đầu tiên về môi trường và kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật này là từ công ty trên. Khi nghiên cứu sản xuất methionine trên vi sinh vật này, người ta tiến hành nuôi cấy trên các môi trường có hàm lượng glucose khác nhau. Kết quả thu được, giá trị hàm lượng glucose tối ưu cho vi sinh vật này là 60g/l. Thành phần môi trường nuôi cấy: môi trường nuôi cấy là hỗn hợp các dung dịch có thành phần như sau: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 37 Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 38 3.Những phương pháp sản xuất methionine khác: Hiện nay có rất nhiều phương pháp để tổng hợp methionine, trong đó có 4 hướng chính: tổng hợp hóa học, thủy phân protein, tổng hợp nhờ enzyme và lên men. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 39 chemical synthesis protein hydrolysis (extraction) H R C COOH NH2 enzymatic synthesis fermentation, cultivation (microbial overproducers) Hình 18: Pr inciple possibili ties to produce L-a mino acids or D/L-a mino acids in the case of che mical synthesis (m odif ie d according to Leuc hte nberger et al. 1988). a) Tổng hợp methionine sử dụng enzyme Để thu được L - methionine từ hỗn hợp DL- methionine ta sử dụng enzyme L – Aminoacylase. L – Aminoacylase là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân DL-acetylated amino acid thành L-amino acid. Phản ứng này chỉ tạo sản phẩm dạng L nên rất thuận tiện cho việc tách L- methionine ra khỏi hỗn hợp. Quá trình này lần đầu tiên được đưa ra bởi the Japanese company Tanabe năm 1969 (theo Leuchtenberger et al. 1988). Một phương pháp khác được đưa ra trong những năm 1990 là quá trình chuyển hỗn hợp DL- methyl-thio-ethyl-hydantoin thành L-methionine sử dụng Arthrobacter aurescens DSM7330 (Voelkel 1993; Stehr 1996). Quá trình được miêu tả ở hình bên dưới: Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 40 Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 41 Hình 19: Descr iption of the molecular mecha nis m for the conversion from DL -methyl- thio-ethyl- hyda ntoin (MT E H) to L-methionine with Arthr obacte r aure sce ns DSM7330 (modifie d according to Ste hr 1996). Trong đó: - hydantoin-racemase: xúc tác phản ứng chuyển đồng phân D- thành L-hydantoin - hydantoinase: xúc tác phản ứng thuỷ phân lien kết amide ở vòng - N-carbamoyl-amino-acid-amidohydrolase: xúc tác phản ứng tạo amino acid bằng cách tách carbon dioxide and ammoniac từ sản phẩm trung gian. Ngoài ra, đã và đang có rất nhiều nghiên cứu khác được tiến hành như: - Sản xuất L-methionine có hoạt tính sinh học sử dụng enzyme amino acylase phá vỡ tính không gian của N-acyl-DL -methionine. - Kỹ thuật liên tục sử dụng cột cố định aminoacylases từ nấm mốc phân giải hỗn hợp DL- methionine Tosa et al.1967 - Mori-Naga et al.1984 sản xuất L-methionine từ DL-homocysteine và methanol sử dụng các tế bào đột biến kháng ethionine từ Pseudomonas FM 518. - Morinaga et al.1984 cũng đã sử dụng tế bào OM 33 của con đường ribulose-monophosphate để xúc tác cho sự hình thành methionine từ DL-homocysteine và methanol. Họ thu được 26 mM của L-methionine từ 30 mM của DL-homocysteine và 0,8 mM methanol. - Những phương pháp khác bao gồm DL- methionine được sản xuất bởi sự tổng hợp và thủy phân protein. Trong khi những quá trình hóa học sử dụng những nguyên liệu nguy hiểm, sự sản xuất methionine bởi thủy phân protein yêu cầu vài giai đoạn để tách hỗn hợp amino acid. 4.Sản xuất methionine bởi những vi sinh vật đột biến dinh dưỡng-sinh trưởng và điều chỉnh. Vấn đề nghiêm trọng nhất trong sản xuất methionine trong canh trường lên men chìm là là sự ức chế ngược trong bản thân vi sinh vật. Thông thường vi sinh vật hoang dại không sản xuất một lượng lớn acid amin, đặc biệt là methionine vì lý do này. Các thể đột biến thay đổi cơ chế, có thể cho một lượng lớn hơn cho sản xuất methionine. Các đồng phân methionine đã được sử dụng rộng rãi để cô lập các thể đột biến bởi vì chúng thật sự có hiệu quả với chức năng ức chế ngược mà không tham gia vào các chức năng hữu ích khác trong tế bào. Những thể đột biến kháng những đồng phân này có các enzyme không chịu tác động của sự ức chế ngược và do đó tạo ra nhiều methionine hơn. Báo cáo công nghệ lên men Methionine Page 42 Hình 20. Methionine biosynthesis in C. glutamicum [83]: [1 ] aspartate kinase; [2 ] aspartaldehyde dehydrogenase; [3 ] homoserine dehydrogenase; [4 ] homoserine O -acetyltransferase; [5 ] O - acetylhomoserine (thiol)- lyase (cystathionine ₃ -synthase); [6 ] cystathionine ₃ - lya