Đề tài Công nghệ lên men sản xuất dextran

chúng. (ðộ nhớt ñược ño ở 25oC) f. Áp suất thẩm thấu gel của dung dịch dextran: Áp suất thẩm thấu gel rất quan trọng trong nhiều ứng dụng sử dụng dextran. Khi so sánh áp suất thẩm thấu, ñiều quan trọng là phân tư không ñược ñi xuyên qua màng mà nó tiêp xúc. ðối với những dung dịch tương tự, áp suất thẩm thấu phụ thuộc rất lớn vào khối lượng phân tử của chất tan. Bởi vì dextran là một polymer trung tính có kích thước lớn nên nó dễ dàng thấm vào mô của người và do ñó duy trì mội trường thẩm thấu cần thiết cho cơ thể ví dụ như muối có thể dễ dàng khuếch tán vào trong tế bào và các mô. Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 62 Hình 26: So sánh áp suất thẩm thấu gel của dextran 40 và 70 g. Góc quay cực của dextran: Công thức tính góc quay cực : [α]D = +195 – +201 (ở 25 0C) Với [α]D là góc quay cực của dextran. Khi khối lượng phân tử của dextran nhỏ hơn 20000 Da thì góc quay cực sẽ giảm theo sự giảm của khối lượng phân tử. – Da: ñơn vị ño khối lượng phân tử. – Mw: khối lượng phân tử trung bình – Mn: trung bình số h. Tương tác sinh học của dextran: Ứng dụng trong y học của dextran trong hơn 50 năm qua là bằng chứng thuyết phục về tính an toàn và chất lượng của nó. Hầu hết nghiên cứu ñược áp Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 63 dụng ñối với dextran 40 và 70. Liều gây chết của dextran 70 là 55g/kg thể trọng ở chuột, 18 ở thỏ và 10 ở chó. Dextran có thể ñược tiêu hóa hoàn toàn và bền vững. Quá trình tiêu hóa của dextran ñược theo dõi bởi sự tăng rất nhanh nồng ñộ ñường trong máu và nồng ñộ glycogen trong gan. Từ ñó có thể kết luận là dextran có thể tiêu hóa ñược. Hiện nay, dextran ñã ñược ứng dụng trong ngành dược. Dextran là thành phần của thuốc nhỏ mắt, cream và thuốc mỡ bôi da. Cho nên dextran có tương tác sinh học tốt. i. Sự phân hủy sinh học của dextran: Enzyme dextranase từ nấm mốc như Penicilium và Verticillium có thể phân hủy dextran, tạo các sản phẩm ñường có khối lượng phân tử thấp như là glucose và isomaltose. Nhiều vi khuẩn sinh dextranase ngoại bào cũng có khả năng tương tự như : Lactobacillus, Cellvibrio, Cytophaga, và Bacillus spp. Do vậy dextran dễ bị phân hủy và tạo những sản phẩm dễ hấp thu vào môi trường tự nhiên. 2. Chỉ tiêu chất lượng của dextran: a. Chỉ tiêu vật lý: Tiêu chuẩn về khối lượng phân tử dextran - Tiêu chuẩn GPC (Gel Permeation Chromatography - Sắc ký thẩm thấu gel): Tiêu chuẩn Pharmacosmos GPC cung cấp 10 bộ tiêu chuẩn GPC ñể xác ñịnh khối lượng phân tử dextran trong một khoảng rộng từ 1000 ñến 670000 Da. – Mp : Peak average molecular weight of log(Mw) of Dextran fractions. – Mw : Weight average molecular weight of Dextran fractions. – Mn : Number average molecular weight of Dextran fractions. Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 64 Sản phẩm Phân tử lượng chuẩn GPC standard 1 1,000 Da GPC standard 5 5,000 Da GPC standard 12 12,000 Da GPC standard 25 25,000 Da GPC standard 50 50,000 Da GPC standard 80 80,000 Da GPC standard 150 150,000 Da GPC standard 270 270,000 Da GPC standard 410 410,000 Da GPC standard 670 670,000 Da Có thể tham khảo kỹ hơn bộ tiêu chuẩn này ở phần phụ lục. b. Chỉ tiêu hóa học: pH dung dịch khi hoà tan trong nước ở bất kỳ nồng ñộ nào : 4.5 – 7.0. c. Chỉ tiêu về hóa lý: ðộ nhớt tùy thuộc vào ñộ dài của mạch carbon và thay ñổi tùy theo yêu cầu của từng sản phẩm. d. Chỉ tiêu về sinh học: Sạch về mặt vi sinh. Không lẫn các vi sinh vật như Lactobacillus, Cellvibrio, Cytophaga, và Bacillus spp…vì chúng có khả năng phân giải dextran làm giảm ñi tác dụng của dextran. Không có ñộc tính khi sử dụng. 3. Các loại dextran thường gặp: a. Dextran y học: Dextran ñược ñóng bao bì 100 g, 500 g, 5 kg và 50 kg. Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 65 Khối lượng Mô tả 100 g Hộp chứa dextran, DMF loại III 500 g Hộp chứa dextran, DMF loại III 5 kg Hộp chứa dextran. Bột dextran ñược bảo quản kín bên trong bao PE kép 50 kg Hộp chứa dextran. Bột dextran ñược bảo quản kín bên trong bao PE kép. Dextran 1: MW = 1000 Da. Dùng ñể phòng ngừa phản ứng mẫn cảm với dextran. Dạng tiêm của nó ñược pha vào Dextran 40 và 70, làm cho chúng trở thành những chất làm tăng thể tích huyết thanh an toàn nhất. Dextran 40: MW = 40,000 Da. Dùng làm chất tăng thể tích huyết thanh trong việc ñiều trị chứng giảm lưu lượng máu ñột ngột. Dextran 60: MW = 60,000 Da. Dùng làm chất tăng thể tích huyết thanh trong việc ñiều trị chứng khô mắt với các chỉ dẫn chữa trị tương tự như Dextran 70. Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 66 Dextran 70: MW = 70,000 Da. Công dụng như Dextran 40. b. Dextran kỹ thuật : Dextran kỹ thuật (T-Dextran) là dextran có ñộ tinh khiết cao với khối lượng phân tử trung bình và ñược sắp xếp theo khối lượng phân tử. Có thể hòa tan một cách dễ dàng, các loại dextran kỹ thuật ñược dùng như những chất phản ứng lúc ñầu hay trung gian trong vài quá trình thực phẩm khác nhau, công nghệ sinh học, nhiếp ảnh và công nghiệp sản xuất hóa chất. Bảng 15: Các dòng sản phẩm Dextran công nghiệp Sản phẩm Phân tử khối tiêu chuẩn (Da) Dextran T1 1,000 Dextran T1.5 1,500 Dextran T3.5 3,500 Dextran T5 5,000 Dextran T6 6,000 Dextran T10 10,000 Dextran T20 20,000 Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 67 Dextran T25 25,000 Dextran T40 40,000 Dextran T70 70,000 Dextran T110 110,000 Dextran T150 150,000 Dextran T250 250,000 Dextran T500 500,000 Dextran T2000 2,000,000 c. Sản phẩm dextran từ CMG 713: Dextran sản xuất bởi CMG 713 có khối lượng phân tử lớn. Khối lượng phân tử của dextran khoảng 2 triệu Daltons (Hình 27) và gần với dextran công nghiệp. Trước ñây, maltose và sucrose ñược sử dụng ñể nghiên cứu ảnh hưởng của nó lên khối lượng phân tử dextran và ñã ñi ñến kết luận maltose không có ảnh hưởng lớn ñến khối lượng phân tử dextran. Dextran khối lượng phân tử lớn (>1000kDa) ñược sinh ra khi sucrose ñược sử dụng như là một cơ chất trong suốt quá trình lên men cùng oligodextrin (<10 kDa). Dextran cao phân tử này ñược sản xuất bởi CMG 713 có thể ñược dùng trong công nghệ sinh học, ứng dụng trong công nghiệp cũng như ñược thủy phân ñể trở thành những phần có khối lượng phân tử nhỏ hơn theo nhu cầu của các ngành công nghiệp khác nhau. Dextran có khối lượng phân tử từ 12 – 98 kDa có tầm quan trọng trong y học và có thể thu nhận bằng việc thủy phân dextran cao phân tử chẳng hạn như dextran cao phân tử sản xuất bởi CMG 713. Dextran sản xuất bởi CMG 713 có ñộ nhớt 14.58 cP. Dextran có ñộ nhớt cao ñã chỉ ra rằng nó là mạch dài các liên kết α-1,6 trong các mạch chính. Polysaccharide có liên kết α-1,6 ñại diện cho một loại polymer dẻo và có thể kéo dài ñược. Khối lượng phân tử trung bình của dextran tự nhiên sản xuất bởi NRRL B- 512F ñã ñược khảo sát và giá trị khối lượng phân tử trung bình ñược xác ñịnh trong khoảng 9.106 – 500.106 Da. Bằng chứng về sự hiện diện của những nhánh dài ñã ñược dẫn chứng từ những nghiên cứu về khối lượng phân tử và ñộ nhớt trong quá trình sinh tổng hợp dextran. Mối quan hệ giữa khối lượng phân tử và ñộ nhớt nội tại ñã ñược khảo sát trong một dãy khối lượng phân tử khác nhau. Hibbert et al cũng ñã tìm ra sự khác nhau của tính chất vật lý và hóa học của dextran ñược sản xuất bởi L.mesenteroides. Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 68 Hình 27: Sự phân loại phân tử khối của dextran sản xuất từ L.mesenteroides CMG 713 Phân tử khối trung bình: Blue Dextran: 2,000,000 Dextran công nghiệp: 5,000,000 – 40,000,000 Dextran từ L.mesenteroides CMG 713: 5,000,000 – 20,000,000. Tính chất của dextran sản xuất bởi CMG 713 Sự so sánh tính chất vật lý và hóa học của dextran sản xuất bởi CMG 713 và NRRL B-512F có trong Bảng 16. Dextran sản xuất bởi CMG 713 vô ñịnh hình và không màu. Tuy nhiên những loại dextran sản xuất bởi những chủng L.mesenteroides khác thì lại có dạng sền sệt cho ñến dạng hạt kết tủa. Sự khác nhau về tính chất vật lý này có thể là do sự khác nhau về sự kết tụ các phân tử lại với nhau. Dextran sản xuất từ CMG 713 thì tan trong nước tạo thành dung dịch ñồng nhất có nồng ñộ 5% ñược sử dụng ñể phân tích các tính chất hóa lý của dextran. Các kết quả tương tự cũng ñược công bố cho dextran sản xuất bởi NRRL B-512F rằng nó tan hoàn toàn trong nước, methyl sulfoxide, fomamide, ethylenglycol và glycerol. Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 69 Bảng 16: Sự so sánh tính chất vật lý và hóa học của dextran sản xuất bởi CMG 713 và NRRL B-512F ðặc tính L.mesenteroides CMG713 L.mesenteroides NRRL B512F Màu sắc và kết cấu Trắng, bột vô ñịnh hình Không màu, sáng pH 6.3 5.0-7.0 Tro (%) 9.09 0.056 ðộ ẩm (%) 10.2 - ðộ nhớt (cP) 14.58 2.5 – 3.5 Phân tử lượng trung bình (kDa) 5,000 – 20,000 900 – 50,000 Carbohydrate tổng (%) 79 - Protein tổng (%) 1.9 1.0 ðường khử (%) 1.0 25 Liên kết Chỉ có liên kết α-1,6 Liên kết α-1,6; α-1,4 ở nhánh. V. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ: 1. Hướng phát triển trong tương lai - Cố ñịnh tế bào ñể sản xuất dextran và dextransucrase: A. Cố ñịnh tế bào: Việc gắn enzyme vào một chất nền trơ là một quá trình rất quan trọng cho mục ñích thực tế và lý thuyết. Enzyme thường có nguồn gốc từ vi khuẩn và sự mở rộng khái niệm cố ñịnh là ñính cả tế bào vi khuẩn vào một chất mang trơ mà không cần ngăn cách và làm tinh sạch những thành phần trao ñổi ñặc biệt. Thuận lợi của việc cố ñịnh cả tế bào so với tinh sạch enzyme là rất lớn:  Chi phí ngăn cách, phân lập và tinh sạch enzyme ñược giảm thiểu.  Phạm vi phản ứng rộng hơn bao gồm cả những phản ứng phức tạp sử dụng nhiều enzyme Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 70  Làm tăng tính bền của enzyme thành phẩm bởi vì enzyme ñược duy trì ñược trạng thái tự nhiên của nó.  Kéo dài ñược hoạt tính enzyme bởi sự có mặt của các cofactor và sự tổng hợp sinh học bên trong tế bào.  Sự sản xuất không bị giới hạn trong những sản phẩm lên men cổ ñiển mà còn ñược mở rộng bao gồm những sản phẩm có kích thước của virus, hoặc những tế bào ñồng bộ, sự phân chia quang phổ của những tế bào ñặc biệt cấy vào mô của ñộng vật. a. Cố ñịnh tế bào trên acrylamide: Công nghệ thường ñược dùng là ñính toàn bộ tế bào trên gel polyacrylamide. Tiến trình bao gồm sự polymer hóa dung dịch có nước của các monomer là acrylamide khi các vi sinh vật bị treo lơ lửng. Bảng 17: Hiệu suất cố ñịnh tế bào trên các thành phần hệ gel khác nhau No Acrylamide (%w/v) MBA (%v/v) TEMED (%v/v) Potassium persulphate (g) Khối lượng tế bào ướt (g) Tế bào ñược giữ lại (g) Hiệu suất cố ñịnh tế bào 1 2 3 4 5 6 15.0 15.0 15.0 15.0 15.0 20.0 0.8 0.6 0.4 0.8 0.8 0.8 2.0 1.0 1.0 0.5 1.0 1.0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4934 0.4934 0.4934 0.4934 0.4934 0.4934 0.4092 0.4052 0.4448 0.4124 0.3666 0.4301 82.90 82.12 90.14 83.58 74.30 87.17 MBA: Methyl bis acrylamide TEMED: N, N, N, N – Tetram ethyl ethylene diamine Bảng 17 cho thấy rằng việc cố ñịnh tế bào bị ảnh hưởng bởi thành phần của hệ gel. 6 thành phần khác nhau của acrylamide ñược sử dụng ñể ñạt ñược hiệu suất cố ñịnh tế bào cao nhất. Tế bào ướt ñược sử dụng trong tất cả 6 thành phần. Hiệu suất 90% cố ñịnh tế bào (cao nhất) ñạt ñược khi có 15% gel acrylamide với 0,4% các chất có liên kết ngang. Những nồng ñộ khác nhau của TEMED và kali persulfate ñược sử dụng trong nghiên cứu này. Martin và Perlman (1976) ñã công bố rằng nhữn thành phần khác nhau cho việc cố ñịnh tế bào Gluconobacter melanogenus IFO 3293. Họ ñã thêm vào dung dịch 5% 3- dimethylamino propionitrile ñể làm tăng khả năng cố ñịnh của gel. Nồng ñộ tương ñối của tế bào, acrylamide và MBA trong dung dịch polymer hóa có thể Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 71 ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme của tế bào ñược cố ñịnh. Hầu hết các nhà nghiên cứu sử dụng acrylamide 15% (w/v) và MBA 0,4-0,8%. Nhiệt ñộ mà tại ñó quá trình polymer hóa diễn ra cũng có thể ảnh hưởng ñến hoạt tính của tế bào ñã ñược cố ñịnh. Quá trình cố ñịnh L.mesenteroides PCSIR-4 ñược thực hiện ở 20oC cho kết quả không có sự mất mát quan trọng của tế bào. Ở 45oC, tế bào mất nhiều hoạt tính chỉ trong vòng 2 phút. Shimizu et al (1975) công bố rằng khả năng của Brevibacterium ammoniagenes ñã ñược cố ñịnh ñể sản xuất coenzyme A giảm khi tăng nhiệt ñộ polymer hóa chỉ còn 85% ở 20oC và 75% ở 37oC. Bảng 18: Sự sản xuất dextran bởi vi khuẩn L.mesenteroides PCSIR-4 ñã ñược cố ñịnh ở những nhiệt ñộ khác nhau, sử dụng 10% sucrose Hiệu suất chuyển hóa No Thời gian ủ (h) Thời gian hoàn tất 26oC 35oC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 5.82 5.20 3.10 2.90 2.70 2.70 2.60 2.55 1.10 0.72 3.50 2.30 2.10 2.00 1.90 1.80 1.50 1.20 - - Những dữ liệu ở trên cho thấy rằng hiệu suất chuyển hóa sucrose thành dextran ở 26oC cao hơn ở 35oC. Tế bào có khả năng sống cao và có khả năng sản xuất dextran trong một khoảng thời gian trên 480h. Nhưng hiệu quả của dextran thành phẩm giảm dần theo thời gian. Ở 26oC, sản phẩm dextran gấp 1.6 lần so với ở 35oC trong 48h ñầu và tăng lên 2.2 lần trong 48h tiếp theo. Hoạt tính của tế bào cố ñịnh giảm khoảng 50% sau 1 tuần ở 26oC. Những kêt quả tương tự ñược công bố từ trước cho thấy rằng hoạt tính của nấm (mycellia) cố ñịnh trong gel cũng giảm 50% sau 1 tuần bảo quản ở 4oC. Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 72 Bảng 19: Sản phẩm dextran sản xuất từ L.mesenteroides PCSIR-4 ở những nhiệt ñộ khác nhau, sử dụng 20% sucrose Hiệu suất chuyển hóa No Thời gian ủ (h) Thời gian hoàn tất 26oC 30oC 1 2 3 4 5 6 7 8 48 48 48 48 48 48 48 48 48 96 144 192 240 288 336 384 5.53 2.50 2.26 2.15 1.80 1.55 1.45 1.20 6.22 3.40 2.71 2.50 2.14 2.10 1.60 1.45 Nồng ñộ cơ chất cũng ñóng một vai trò quan trọng ñến việc sản xuất dextran bằng tế bào cố ñịnh. Nồng ñộ cơ chất cao gây ra sự ức chế ở mức cơ chất, ñiều này ñược quan sát rằng nồng ñộ cơ chất ban ñầu càng cao thì sản lượng dextran thu ñược trên 1 ñơn vị thể tích càng cao. Nhưng hiệu suất chuyển hóa sucrose thành dextran lại giảm khi tăng nồng ñộ sucrose ban ñầu. Sucrose cũng ñược sử dụng ñể sản xuất dextran bằng việc cố ñịnh loài Rhizopus trên chất mang giống như vi sợi cellulose. Bảng 20: Sản xuất dextran bằng L.mesenteroides PCSIR-4 cố ñịnh và tự do, sử dụng 10% sucrose Hiệu suất chuyển hóa No Thời gian ủ (h) Thời gian hoàn tất Tế bào tự do Tế bào cố ñịnh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 8.00 6.00 2.10 - - - - - - - 5.82 5.20 3.10 2.90 2.70 2.70 2.60 2.55 2.50 2.40 Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 73 Bảng 20 cho thấy hiệu suất chuyển hóa sucrose thành dextran cao ñược thấy ở tế bào tự do. Tế bào tự do tiếp tục sản xuất dextran trên 96h nhưng sau ñó hiệu suất chuyển hóa lại giảm thấp hơn so với tế bào cố ñịnh. Tế bào tự do mất hoạt tính và dừng quá trình sản xuất dextran sau 144h, trong khi tế bào cố ñịnh vẫn hoạt ñộng mạnh và có thể sàn xuất dextran trong thời gian trên 480h. Hiệu suất chuyển hóa thấp của tế bào cố ñịnh ñược giải thích là vì tế bào ở trạng thái cố ñịnh không có khả năng di chuyển và phân chia trong khi tế bào tự do có thể dễ dàng di chuyển và phức hợp enzyme – cơ chất có thể dễ dàng hình thành. Trong tế bào cố ñịnh, sản phẩm hình thành ñược giữ lại trong những lỗ của gel và không cho phép cơ chất mới tiến vào từ bên ngoài tế bào và phản ứng với những enzyme nội bào ñể sản xuất dextran. Tuy nhiên, có thể dễ dàng thấy rằng tế bào ở trạng thái cố ñịnh bền hơn ở dạng tự do và sản xuất dextran liên tục trong một thời gian dài. Sản phẩm dextran có phân tử lượng thấp từ những tế bào cố ñịnh là do sự tổn thương một phần của enzyme nội bào bởi vì việc tiêp xúc với các chất có khả năng polymer hóa. ðiều này cũng ñúng trong trường hợp cố ñịnh tế bào Pseudomonas putida ñể sản xuất L-citruline. Một lý do khác có thể xảy ra là những phần nhỏ enzyme chìm ñược ñặt trên hoặc gần bề mặt có hoạt tính enzyme. Chỉ có tế bào ñược ñặt trong những lớp không dày hơn 0.35mm có thể sử dụng ñược cơ chất và khi ñộ dày của hệ gel tăng lên thì quá trình hình thành sản phầm giảm xuống. b. Cố ñịnh tế bào trên calcium alginate: Khả năng của dung dịch natri alginate ñể hình thành những viên hoặc hạt bền vững khi cho vào dung dịch calcium cloride bởi vì sự hình thành của những hạt gel calcium alginate không tan ñược sử dụng ñể cố ñịnh tế bào thực vật và vi sinh vật, enzyme và những cơ quan dưới mức tế bào. Ảnh hưởng của kích thước hạt calcium alginate lên việc cố ñịnh tế bào: Kích thước của các hạt cũng ñóng vai trò quan trọng trong việc cố ñịnh tế bào. Sự khuếch tán nội tại có thể trở thành một bước giới hạn trong cả chất xúc tác sinh học, ñặc biệt khi hoạt tính xác ñịnh hoặc khi sản xuất các oligosaccharide có khả năng khuếch tán thấp. Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 74 Hình 28: Ảnh hưởng của kích thước hạt ñến việc cố ñịnh tế bào Hình 28 cho thấy rằng sự cố ñịnh tế bào ñạt cực ñại khi ñường kính của hạt ñạt 0.6mm và khi ñường kính tăng dần thì tỉ lệ hiệu suất cố ñịnh giảm dân. Những kết quả tương tự cũng ñược công bố bởi Quirasco et al (1995) người ñã khám phá ra rằng sau khi kích thước của các chất xúc tác sinh học ñạt tối ưu, khả năng cố ñịnh giảm khi tăng ñường kính các hạt gel. Dưới ñường kính tối ưu,tỉ lệ phản ứng không ñược kiểm soát bởi sự khuếch tán bên trong tế bào. Ảnh hưởng của nồng ñộ sucrose lên việc sản xuất dextran bằng cố ñịnh tế bào: Ảnh hưởng của nồng ñộ sucrose ñược nghiên cứu khi ñường kính hạt gel là 0.6mm. Kết quả trong Hình 29 cho thấy rằng phản ứng dưới sự kiểm soát ñộng học chỉ khi có nồng ñộ cơ chất trên 10%. ðiều này cũng ñược công bố sớm hơn rằng, việc tăng nồng ñộ sucrose lên 0.1% ñể làm giảm hoạt tính từ 1 xuống 4. Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 75 Hình 29: Ảnh hưởng của nồng ñộ cơ chất ñến việc sản xuất dextran bằng tế bào cố ñịnh Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến việc sản xuất dextran bằng tế bào cố ñịnh: Dextran sản xuất bởi L.mesenteroides PCSIR-4 ñã ñược cố ñịnh bị ảnh hưởng bởi nhiệt ñộ. Sự sản xuất dextran tăng lên khi nhiệt ñộ tăng và ở 30oC sự sản xuất dextran ñạt cực ñại. Khi nhiệt ñộ tăng lên 50oC thì khả năng sản xuất giảm 25%. ðiều này cũng thấy ở Gluconobacter melanoganas. Sự sản xuất sorbosone ñạt cực ñại ở 50oC. và khi nhiệt ñộ tăng lên 60oC thì sự sản xuất bị giàm ñi. Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 76 Hình 30: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên sản xuất dextran từ tế bào tự do và cố ñịnh Hình 30 chỉ ra rằng khả năng sản xuất dextran bởi L.mesenteroides PCSIR-4 tự do cao hơn bởi tế bào cố ñịnh nhưng nhiệt ñộ tối ña cho sản xuất dextran của 2 phương pháp là giống nhau. B. Cố ñịnh enzyme: Enzyme dextransucrase sẽ polymer hóa các gốc glucosyl của sucrose ñể hình thành nên dextran, nhánh α-1,2 hoặc α-1,3 hoặc a-1,4 ñược tạo thành phụ thuộc vào enzyme sản xuất. Dextransucrase từ L.mesenteroides NRRL B- 512F là một enzyme khử sucrose chứa những liên kết ñồng hóa trị bao gồm 95% là liên kết α-1,6 trên mạch chính và 5% liên kết α-1,3 trên mạch nhánh. Sự phát triển của việc tổng hợp các oligosaccharide trong công nghiệp, việc cố ñịnh enzyme dextrasucrase sẽ làm bền các enzyme này và ñồng thời phân loại các xúc tác sinh học từ hỗn hợp phản ứng. Một vài phương pháp ñể cố ñịnh dextransucrase ñã ñược nghiên cứu. Chang et al (1981) ñã sử dụng các hạt phenoxyaceltyl cellulose ñể cố ñịnh enzyme dextransucrase từ L.mesenteroides. Monsan và Lopez (1980) ñã cố ñịnh ñược enzyme này từ L.mesenteroides NRRL B-512F trên chất mang silic amino xốp (Spherosil) ñược kích hoạt cùng với glutaraldehyde. Alcade et al (1999) ñã cố ñịnh ñược enzyme dextransucrase từ L.mesenteroides NRRL B-512F trên 2 chất mang. Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 77 L.mesenteroides PCSIR-4 sẽ sản xuất 2 loại enzyme, nội bào và ngoại bào. Enzyme dextransucrase nội bào ñược sử dụng ñể sản xuất dextran bằng cách cố ñịnh cả tế bào vi sinh vật. Chất lượng của dextran sản xuất theo phương pháp trên rất thấp bởi vì enzyme này không có khả năng hình thành phức hợp enzyme – cơ chất. Do ñó dextransucrase ngoại bào ñược sử dụng ñể sản xuất các loại dextran quan trọng trong công nghiệp với khối lượng phân tử ña dạng. Dextran một phần ñược tinh sạch bằng 36% ethanol lạnh cùng với sự thêm vào của CaCl2 như là chất làm bền. Sau quá trình tinh sạch dextransucrase sẽ ñược cố ñịnh trên các hạt alginate. Thông thường các hạt alginate ñược sử dụng ñể cố ñịnh một phần hoặc cả tế bào bởi vì protein hình cầu quá nhỏ so với kích thước các lỗ xốp của alginate. Tuy nhiên trong trường hợp vủa dextransucrase, các lớp dextran sẽ bao bọc lấy bề mặt protein ngăn cản sự rò rỉ của enzyme bởi các lỗ xốp của alginate. Ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính của enzyme dextransucrase cố ñịnh: Thời gian của phản ứng tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất luôn luôn là một thông số quan trọng ñể cực ñại hóa hoạt tính enzyme. Những enzyme hòa tan khi ñược ủ với cơ chất trong 15 phút bởi ñiều kiện chuẩn ñạt ñược hoạt tính enzyme tối ña và sẽ giảm dần theo thời gian. Hình 31: Ảnh hưởng của thời gian ủ lên hoạt tínhdextransucrase cố ñịnh và dextransucrase tan Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 78 Hình 31 cho thấy sự so sánh của enzyme cố ñịnh so với các enzyme tan. Hoạt tính của enzyme cố ñịnh ñạt cực ñại ở 60 phút. Do ñó có thể giả ñịnh rằng cơ chất mất thời gian lâu hơn ñể tiến vào bên trong hạt chất mang và phản ứng với enzyme. Kích thước của hạt chất mang là một nhân tố quan trọng trong công nghệ cố ñịnh enzyme. Trước ñó nhiều nhà khoa học ñã cho rằng ñường kính của hạt chứa dextransucrase từ L.mesenteroides B-1299 không nên vượt quá 2mm ñể khuếch tán dễ dàng hơn trong ñiều kiện cơ chất bão hòa. Remaud – Sincon et al (2001) cho rằng trong phương pháp cố ñịnh dextransucrase, sự tắt nghẽn xảy ra bên trong các hạt gel là do ngưỡng hoạt ñộng của hoạt tính các hạt gel. Ảnh hưởng của nồng ñộ cơ chất lên hoạt tính của enzyme dextransucrase cố ñịnh: Nồng ñộ cơ chất tối ña cho dextransucrase cố ñịnh và dextransucrase tan ñược chỉ ra trong Hình 32. Hình 32: Ảnh hưởng của nồng ñộ cơ chất lên hoạt tính dextransucrase từ enzyme tan và enzyme cố ñịnh Những nồng ñộ khác nhau của sucrose ñược sử dụng cho thấy rằng nồng ñộ cực ñại của cơ chất trong trường hợp enzyme cố ñịnh sẽ cao hơn enzyme tan. Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 79 Hoạt tính tăng dần khi nồng ñộ cơ chất sucrose là 125mg/ml và ñạt cực ñại ở 200mg/ml. Sau khi ñạt cực ñại sự ức chế cơ chất xảy ra và gây ra sự khác biệt nhỏ về sự cố ñịnh enzyme invertase trong cả 2 trường hợp. Enzyme tan sẽ bị ức chế bởi nồng ñộ sucrose lớn hơn 10%, ngược lại ñối với enzyme cố ñịnh thì hoạt tính của nó sẽ ñược giữ lại hoàn toàn khi nồng ñộ sucrose lớn hơn 20%. Kobayashi và Matsuda (1975) cho rằng nồng ñộ cơ chất khoảng 125mg/ml là cực ñại ñối với enzyme tan. Trước ñó nhiều nhà khoa học cho rằng nồng ñộ sucrose 10% là phù hợp cho sự sản xuất cực ñại glucooligosaccharide bởi dextransucrase cố ñịnh. Dextransucrase cố ñịnh từ L.mesenteroides NRRL B- 512F ñòi hỏi nồng ñộ ñường rất cao trong thiết bị phản ứng tầng sôi. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme dextransucrase cố ñịnh: Enzyme cố ñịnh và enzyme tan ñược thí nghiệm ở nhiều giá trị pH khác nhau. Người ta thấy rằng hoạt tính enzyme cực ñại là ở pH 5.0 ở cả 2 trường hợp (Hình 33). Hình 33: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme dectransucrase cố ñịnh Kaboli và Reilly (1980) cũng cho rằng hoạt tính enzyme sextransucrase ñạt cực ñại ở pH 5.2 và enzyme tan cũng tương tự. Trong trường hợp cố ñịnh Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 80 enzyme invertase của lòng trắng trứng có một sự thay ñổi về pH theo hướng giảm trong trường hợp enzyme cố ñịnh. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên hoạt tính enzyme dextransucrase cố ñịnh: Hình 34: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên hoạt tính dextransucrase tan và cố ñịnh Hình 34 cho thấy hoạt tính enzyme dextransucrase cố ñịnh ñạt cực ñại ở 35oC giống như là enzyme tan. Trong khoảng nhiệt ñộ 20 – 30oC hoạt tính enzyme tăng dần và ñạt cực ñại ở 35oC rồi giảm xuống. Sự khác nhau giữa enzyme tan và enzyme cố ñịnh là enzyme tan có hoạt tính cao hơn. Khi dextransucrase ñược cố ñịnh trên silica xốp, enzyme cố ñịnh và enzyme tan ñều cho hoạt tính tối ña ở cùng một nhiệt ñộ là 30oC nhưng hoạt tính của enzyme tan lại cao hơn enzyme cố ñịnh. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên tính bền của enzyme dextransucrase cố ñịnh: Công nghệ lên men Sản xuất Dextran 8