Đề tài Công nghệ lên men - Scleroglucan

lên men cùng chất lượng sản phẩm thu được và thường cần một lượng rất lớn trong quá trình lên men. Tính chất: • Nhiệt độ đông đặc: 0oC • Nhiệt độ sôi: 100oC • Chỉ số khúc xạ (ở 20oC) so với không khí: 1,333 • Nhiệt nóng chảy: 6,012 KJ/mol • Nhiệt hóa hơi: 44,01 KJ/mol • Độ nhớt: 1,004 MPa.s • Nhiệt dung riêng ở áp suất 0,101 MPa của: o Nước đá (0oC): 1,039 J/kg.K o Nước (15oC): 4,185 J/kg.K o Hơi (100oC): 2,039 J/kg.K • Độ dẫn nhiệt của: o Nước đá (0oC): 2,34 W/m.K o Nước (45oC): 64,5 W/m.K o Hơi (100oC): 0,0231 W/m.K Những chỉ tiêu quan trong của nước cần quan tâm là chỉ tiêu hóa lý, chỉ tiêu cảm quan và chỉ tiêu vi sinh. 2.2.1. Chỉ tiêu hóa lý và cảm quan Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 8 Bảng 4: Các chỉ tiêu cảm quan và hóa lý của nước 2.2.2. Chỉ tiêu vi sinh vật Bảng 5: Chỉ tiêu vi sinh của nước uống (quy định số 80/778/EEC) Stt Chỉ tiêu Thể tích mẫu phân tích Mức khuyến cáo Mức cao nhất cho phép Phương pháp đổ hộp (sử dụng membrance vi lọc) Phương pháp MPN 1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí 1000 10 cfu (ở 37oC) 100 cfu (ở 27oC) 2 Coliforms tổng số 100 0 MPN < 1 3 Coliform phân 100 0 MPN < 1 4 Faecal streptococci 100 0 MPN < 1 5 Sulphite reducing clostridia 20 0 MPN < 1 Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 9 2.3. Phụ liệu: 2.3.1. Acid citric • Mô tả: Tinh thể không màu hay bột trắng, đối với acid citric hạng 1 cho phép có ánh vàng. Dung dịch acid citric trong nước cất nồng độ khối lượng khoảng 20g/dm3, phải trong suốt.Vị chua, không có vị lạ, không mùi. • Độ tinh sạch: > 99,5%. • Ẩm: < 0,5%. • Kim loại nặng: < 5ppm • Sắt: < 50ppm. • Oxalic: < 100ppm. • Chloride: < 50ppm. • Sulfate: <150ppm • Tạp chất cơ học: không cho phép. 2.3.2. Acid sulfuric H2SO4 Mô tả: là một acid mạnh, dạng lỏng, màu từ trắng sang vàng ngà cho đến vàng nâu. Tan vô hạn trong nước. • Độ tinh sạch: > 98% • Sắt: < 50ppm 2.3.3. NaOH Mô tả: dạng rắn hoặc tinh thể • Độ tinh sạch: > 99%. • Na2CO3: < 0,5%. • NaCl: < 0,05%. • Fe: < 6ppm. 2.3.4. Ammonium sulfate (NH4)2SO4 Mô tả: Tinh thể không màu hoặc trắng, bị phân hủy ở 280oC, 1 gram tinh thể hòa tan được trong 1,5 ml nước, không tan trong cồn, pH dung dịch 0,1M khoảng 4,5 ÷ 6. • Độ tinh sạch: > 99%. • Kim loại nặng: <10 mg/kg. • Hàm lượng tro: < 0,25%. • Selenium: < 0,003%. 2.3.5. Potassium chloride KCl Mô tả: Tinh thể không màu hoặc bột trắng, không mùi, vị mặn. Dung dịch trung tính, 1 gram tan đươc trong 2,8ml nước ở 25oC và khoảng 2ml nước sôi, không tan trong cồn. • Độ tinh sạch: >99%. • Kim loại nặng: < 5mg/kg. • Iodine và/hoặc bromide: pass test. • Natri: pass test. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 10 2.3.6. Ferrous sulfate FeSO4.7H2O Mô tả: Tinh thể xanh nhạt, không mùi, vị mặn. trong không khí ẩm, nó bị oxy hóa thành dạng ferric sulfate có màu vàng nâu. Dung dịch có tính acid, pH khoảng 3,7. 1 gram tan trong 1,5ml nước và trong 0,5ml nước nóng, không tan trong cồn. • Độ tinh sạch: > 99,5%. • Chì: <10mg/kg. • Thủy ngân: < 3mg/kg. 2.3.7. K2HPO4 Mô tả: Hạt không màu hoặc trắng, tan khi để trong không khí ẩm. 1 gram tan trong khoảng 3ml nước, không tan trong cồn. pH dung dịch 1% là khoảng 9. • Độ tinh sạch: > 98%. • Arsenic: < 3mg/kg. • Chì: < 5mg/kg. • Kiem loại nặng: < 0,0015%. • Flouride: < 10mg/kg. • Hàm lượng chất không tan: < 0,2%. 2.3.8. Sodium nitrate NaNO3 Mô tả: Tinh thể không màu, không mùi, hoặc bột tinh thể, tan trong không khí ẩm. Tan vô hạn trong nước, tan ít trong cồn. • Độ tinh sạch: > 99%. • Arsenic: < 3mg/kg. • Kim loại nặng: < 10mg/kg. • Chlorine: pass test (khoảng 0,2%). 2.3.9. Manganese Sulfate MgSO4·7H2O Mô tả: Tinh thể không màu, vị đắng. • Độ tinh sạch: > 99% MgSO4. • Fe: < 0,0015%. • Pb: < 0,0005%. • Cl: < 0,01%. • As: < 0,0004%. • pH: 6,5 2.3.10. Sucrose Mô tả: Dạng rắn màu trắng, không mùi, vị ngọt; tan tốt trong nước, trong formamide, trong dimethyl sulfoxidem, tan ít trong cồn. • Độ tinh sạch: > 99,8%. • Arsenic: < 1mg/kg. • Kim loại nặng: < 5mg/kg. • Lượng đường nghịch đảo: < 0,1%. • Lượng tro: < 0,15%. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 11 • Chì: < 0,5%. • Gốc quay cực: giữa +65,9o và +66,7o. 2.3.11. Ethanol Mô tả: dạng lỏng trong suốt, không lợn cợn. • Độ tinh sạch: > 95% thể tích. • Acetaldehyde: < 0,0003g/ 100ml. • Methanol: < 0,001g/ 100ml. • Acid acetic: < 0,001g/ 100 ml. • Kim loại nặng: < 1mg/l 2.3.12. Dịch chiết malt Tan tốt trong nước, pH dung dịch 3% là 4,8 ÷ 5.8. • Đường khử (maltose): ≥ 60%. • Tro: ≤ 4,5% • Chlorine: < 1% • Vi sinh vật hiếu khí: < 104 CFU/g • E.coli: không có trong 10g • Salmonella: không có trong 25g • Nấm men và nấm mốc: < 20 CFU/g 2.3.13. Dịch chiết nấm men Dịch chiết nấm men bao gồm nước, các chất trong tế bào nấm men tan trong nước như amino acid, peptide, carbonhydrate và muối. Dịch chiết nấm men được sản xuất thông qua thủy phân liên kết peptide bằng enzyme có sẵn trong nấm men hoặc enzyme bổ sung vào. Sản phẩm có thể ở dạng lỏng, paste, bột hoặc rắn. • Hàm lượng protein: > 42% • Tỷ số phần trăm nitơ α-amino/nitơ tổng: 15 ÷ 55% • Nitơ ammoni: < 2%, tính trên lượng muối khô • Glutamic acid: < 12% C5H9NO4 và < 28% tổng acid amin. • Kim loại nặng (as Pb): < 10 mg/kg • Phần không tan: < 2% • Chì: < 3mg/kg • Thủy ngân: < 3 mg/kg • Giới hạn vi sinh vật: vi sinh vật hiếu khí < 50000 CFU/ g Coliform < 10 CFU/g Nấm men và nấm mốc < 50 CFU/g Salmonella không có trong 25g 2.4. Vi sinh vật sử dụng Con giống thường dùng là nấm Sclerotium rolfsii MTCC 2156, được giữ trên môi trường đông khô và được hoạt hóa trên môi trường Czapek malt agar, nó được ủ ở 28oC trong 5 ngày. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 12 Hình 3: Hình thái sợi nấm S.rolfsii 2.4.1. Hình thái, sinh lý: S.rolfsii có khả năng thích nghi cao, có thể sinh trưởng trong khoảng pH rộng, nhưng tốt nhất là trong môi trường acid. Khoảng pH tối ưu để sợi nấm phát triển là 3 ÷ 5. quá trình sinh trưởng bị ức chế ở pH lớn hơn 7. Sợi nấm phát triển tốt nhất ở 25 ÷ 35oC, ở 10 hoặc 40oC sợi nấm ít hoặc không có, và sợi nấm chết ở 0oC. Sự hình thành hạch nấm cũng tốt nhất ở gần nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển sợi nấm, nhưng hạch nấm vẫn sống sót ở nhiệt độ thấp -10oC. Độ ẩm cần thiết cho sự phát triển của sợi nấm. Hạch nấm không phát triển được khi độ ẩm tương đối quá thấp so với điểm bão hòa. Tuy nhiên một số nghiên cứu lại cho rằng hạch nấm phát triển tốt nhất ở độ ẩm tương đối 25 ÷ 35%. Sợi nấm và hạch nấm phát triển nhanh chóng trong điều kiện ánh sáng liên tục, mặc dù nó vẫn xảy ra trong bóng tối nếu thỏa mãn những điều kiện khác. Những chủng S.rolfsii đã được nghiên cứu để sản xuất polysaccharide ngoại bào (EPS) là những chủng được tách ra từ những cây bị bệnh ở những khu vực khác nhau của Pakistan. Những chủng này được giữ lạnh ở 5oC và được cấy chuyền định kỳ hàng tháng để giữ được đặc tính của chúng. 2.4.2. Tiêu chuẩn chọn giống: • Không có khả năng sinh tổng hợp độc tố. • Có khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm chính cao. • Có khả năng thích nghi cao, bảo toàn hoạt tính. Tốc độ sinh trưởng càng nhanh càng tốt nhằm lấn át sự phát triển của những vi sinh vật nhiễm, rút ngắn thời gian lên men, cho hiệu quả kinh tế cao. • Điều kiện nuôi cấy đơn giản. Môi trường nuôi cấy rẻ tiền, dễ kiếm. Giống phải có khả năng sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền như các phụ phẩm, các nguyên liệu thô... 2.4.3. Nhu cầu dinh dưỡng của S.rolfsii Nguồn Carbon Glucose và sucrose là những nguồn carbon thường được sử dụng để sản xuất các polyme sinh học, mặc dù các nguồn carbon khác cũng có thể được sử dụng. Hầu như các nghiên cứu về Scleroglucan đều kết luận rằng: nồng độ của glucose hay sucrose là khoảng 30g/l đến 35g/l. Dưới những điều kiện trên, lượng sản phẩm Scleroglucan tối đa thu được là 8.5 ÷ 10g/l. Lượng sản phẩm này thì thấp hơn nhiều so với lượng xanthan cao nhất thu được là 27g/l. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 13 Nồng độ sucrose trên 45g/l thì sẽ có ảnh hưởng ức chế đến sự phát triển của Sclerotium glucanicum và xa hơn nữa là sẽ hạn chế lại quá trình tạo thành Scleroglucan. Ngược lại, Farine et al. đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ sucrose cao lên quá trình sản xuất Scleroglucan từ S.rolfsii và kết luận rằng: việc tăng thêm sucrose sẽ dẫn đến sự cải thiện rõ ràng việc tạo sản phẩm glucan. Trong khi chỉ 7g/l Scleroglucan được sản xuất bởi 30g/l đường sucrose. Nhưng khi thu được 1 lượng Scleroglucan gấp 3 lần (21g/l) thì lại cần tới 150g/l sucrose cung cấp cho canh trường. Mặc dù sự cải thiện này, lượng sucrose còn dư vào cuối quá trình lên men rất cao khoảng 100g/l. Vì vậy, do những đòi hỏi của lợi nhuận kinh tế, Survase et al. đã chứng minh lượng sản phẩm Scleroglucan cao nhất thu được là 16.5g/l với nồng độ sucrose là 80g/l. Nguồn Nitơ Nitơ chiếm 8 ÷ 14% hàm lượng chất khô của bacterium và nấm. Nó là thành phần của protein và enzyme, và nó cần thiết cho sự trao đổi chất của tế bào. Nó tồn tại rộng rãi dưới dạng hợp chất vô cơ và hữu cơ, ví dụ như muối vô cơ +4NH và − 3NO , hay phức tạp hơn nữa là những sản phẩm tự nhiên như chiết nấm men, sản phẩm thủy phân của casein, sản phẩm thủy phân đậu nành và dung dịch nước chiết bắp có thể được sử dụng để đáp ứng yêu cầu của nhân tố này. Nói chung việc thêm nitơ sẽ làm tăng nồng độ sinh khối, nhưng làm giảm sự hình thành glucan. Hàm lượng nitơ cao tồn tại dưới dạng (NH4)2SO4 sẽ làm giảm lượng Scleroglucan. Vì vậy cung cấp nitơ dưới dạng nitrate thì tốt hơn là dưới dạng ammonium sulfate (ammonium sẽ gây ức chế sự tổng hợp enzyme). Hàm lượng tốt nhất của muối nitrate (NaNO3) là 2.25 g/l để thu được scleroglucan cao nhất. Các nguyên tố khác Phospho là một nhân tố quan trọng của quá trình trao đổi chất bậc hai. Phospho cũng điều chỉnh quá trình hấp thu lipit và cacbonhydrat của tế bào. Muối phosphat, như K2HPO4 hay KH2PO4 cũng được sử dụng như một dung dịch đệm pH trong canh trường lên men. Farina et al. chỉ ra rằng khi tổng hàm lượng phospho tăng từ 0.12 lên 0.28g/l, điều này cũng làm tăng lượng sản phẩm Scleroglucan (từ 4 lên 5g/l). Mặc dù không có sự giải thích rõ ràng, có thể hiểu rằng phospho có thể làm tăng khả năng hấp thụ glucose và tăng quá trình trao đổi chất. Kali là một cation vô cơ có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với tế bào; Kali cũng thường tồn tại dưới dạng muối (như K2HPO4, KH2PO4 hay K2SO4). Kali là một cofactor cho nhiều loại enzyme, cần cho quá trình chuyển hóa cacbohydrat và nhiều quá trình vận chuyển khác. Magie cũng cần cho nấm, chức năng của nó như là một cofactor của enzyme, và tồn tại trong vách tế bào và membranes. Magie được cung cấp dưới dạng MgSO4.7H2O. Pilz et al. đã nói rằng việc bổ sung thiamin và kẽm vào môi trường có thể được thay thế bởi nước chiết nấm men. Những kết quả của họ chỉ ra tầm quan trọng khi có mặt kẽm đối với vi sinh vật. S.rolfsii cần Zn2+ cho quá trình trao đổi chất bậc một và cho việc sản xuất Scleroglucan. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 14 3. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ 3.1. Quy trình Mật rĩ Xử lý nguyên liệu Chuẩn bị môi trường Lên men Trung hòa, pha loãng, gia nhiệt Cấy giống Đồng hóa Ly tâm Tinh sạch Sấy Giống Chất dinh dưỡng Chất chỉnh pH Sản phẩm Nghiền NaOH Nước cất Ethanol H2SO4 Nước cất Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 15 3.2. Giải thích quy trình 3.2.1. Xử lý mật rĩ Mục đích công nghệ • Chuẩn bị cho quá trình lên men: • Vô hoạt các chất ức chế vi sinh vật trong mật rĩ. • Tiêu diệt hoặc ức chế hệ vi sinh vật có trong mật rĩ. • Tách các cấu tử không hòa tan ra khỏi mật rĩ. Các biến đổi: • Vật lý: thể tích tăng do có sự pha loãng mật rĩ. Có sự thay đổi về gradient nhiệt độ. • Hóa học: pH của dung dịch giảm mạnh. • Hóa lý: có sự tách pha, các cấu tử không tan sẽ kết tủa. • Sinh vật: vi sinh vật bị ức chế và tiêu diệt. Phương pháp thực hiện: Hình 4: Thiết bị xử lý nhiệt mật rĩ. Cấu tạo: Thiết bị hình trụ, đáy côn, làm bằng thép không rỉ. Bên trong có hệ thống ống xoắn để gia nhiệt, bên ngoài có lớp vỏ áo để làm nguội. Động cơ gắn với cánh khuấy giúp cho quá trình đảo trộn nguyên liệu. Thực hiện: Cho mật rĩ vào thiết bị, bổ sung nước, bổ sung lượng H2SO4 cần thiết, bật cánh khuấy đồng thời gia nhiệt. Sau 45 ÷ 60 phút, làm nguội nguyên liệu để đưa qua thiết bị ly tâm tách cặn. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 16 Hình 5: Thiết bị ly tâm làm sạch mật rĩ. Cấu tạo: thiết bị có dạng hình trụ, bên trong có bố trí các thanh chặn. Khi động cơ truyền động cho rotor bên trong quay, dưới tác động của lực ly tâm các cấu tử không tan sẽ bị văng ra, giữ lại trên các thanh chặn. Thông số công nghệ: • Tỷ lệ nước : mật rĩ là 3 : 1. • Lượng H2SO4 bổ sung: 5% khối lượng mật rĩ. • pH: 2,8 ÷ 3. • Nhiệt độ : 90 ÷ 100oC. • Giữ ở nhiệt độ đó trong khoảng thời gian 45 ÷ 60 phút. • Tốc độ quay: 1500 rpm. 3.2.2. Chuẩn bị môi trường Mục đích công nghệ: Chuẩn bị: bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển và sinh tổng hợp sản phẩm của nấm mốc trong quá trình lên men. Thành phần hóa học của môi trường lên men: % khối lượng • Sucrose: 8% • Chất chiết nấm men: 0,1% • NaNO3: 0,3% • K2HPO4: 0,13% • NaCl: 0,05% • MgSO4: 0,025% • FeSO4: 0,005% • Acid citric: 0,07% Các biến đổi: • Hóa học: thành phần hóa học của các chất trong nguyên liệu thay đổi. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 17 • Hóa lý: sự hòa tan các chất rắn vào dung dịch. Phương pháp thực hiện: Sử dụng thiết bị phối trộn có cấu tạo gồm 1 thùng khuấy, bên trong có gắn 2 cánh khuấy mái chèo được đặt lệch tâm, thành thùng khuấy đặt các thanh chặn. Thiết bị này dùng cho chất lỏng có độ nhớt trung bình. Hình 6: Thiết bị phối trộn Thực hiện: các chất dinh dưỡng cần bổ sung được hòa tan trong nước vô khuẩn, sau đó dung dịch được bơm vào thiết bị phối trộn. Sau đó bổ sung NaOH để điều chỉnh về pH phù hợp cho sự phát triển của nấm mốc. Thông số công nghệ: • Tốc độ khuấy: 200 rpm • pH ra: 4,5 ± 0,2 3.2.3. Nhân giống Mục đích công nghệ Quá trình nhân giống tạo điều kiện cho nấm mốc tăng sinh khối để chuẩn bị cho quá trình lên men. Các biến đổi: • Vật lý: nhiệt độ của môi trường tăng một chút do quá trình hô hấp của nấm mốc. • Hóa học: thành phần chất dinh dưỡng trong môi trường sẽ giảm. • Hóa sinh: các phản ứng trao đổi chất của vi sinh vật. • Sinh học: trong quá trình nhân giống, nấm mốc sinh trưởng để tăng sinh khối. Phương pháp thực hiện: Giống cấy mua về ở dạng đông khô cần hoạt hóa. Môi trường sử dụng để hoạt hóa là Czapek malt agar. Thành phần Czapek malt agar: • Chất chiết malt: 40g/l • Sucrose: 30g/l • NaNO3: 2g/l Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 18 • KCl: 0,5g/l • MgSO4: 0,5g/l • FeSO4: 0,01g/l • K2HPO4: 1g/l • Agar: 20g/l • pH (25oC) = 6,8 ± 0,2 Nấm mốc sau khi hoạt hóa sẽ nhân giống trong môi trường lỏng PM20. Quá trình nhân giống được thực hiện trong bồn có cánh khuấy, có vỏ áo để giữ nhiệt. Thành phần hóa học của môi trường PM20: • Sucrose: 20g/l • NaNO3: 3g/l • K2HPO4.3H2O: 1,3g/l • Chất chiết ấm men: 1g/l • KCl: 0,5g/l • MgSO4.7H2O: 0,5g/l • FeSO4.7H2O: 0,05g/l • Acid citric: 0,7g/l • pH = 4,5 Thông số công nghệ: • Nhiệt độ: 28oC. • Thời gian hoạt hóa: 5 ngày. • Thời gian nhân giống: 2 ngày. • Tốc độ cánh khuấy trong quá trình nhân giống: 250 rpm. 3.2.4. Lên men Mục đích công nghệ: Nấm mốc phát triển tăng một phần sinh khối, đồng thời sinh tổng hợp scleroglucan cần thu nhận. Các biến đổi • Vật lý: quá trình lên men sinh nhiệt nên nhiệt độ của thùng lên men có tăng lên, cần có thiết bị điều chỉnh nhiệt độ để giữ ổn định nhiệt độ phù hợp với sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ngoài ra, quá trình sinh tổng hợp nên scleroglucan cũng tăng độ nhớt của dung dịch. • Hóa lý: pH của canh trường giảm do sự tổng hợp acid oxalic (sản phẩm không mong muốn của quá trình lên men). • Hóa học: nồng độ đường đơn trong dung dịch giảm, nồng độ sản phẩm tăng lên. • Hóa sinh: các phản ứng do enzyme xúc tác rất đa dạng, đó là các phản ứng trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. • Sinh học: sự sinh trưởng, phát triển và sự trao đổi chất của vi sinh vật trong dung dịch. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 19 Con đường sinh tổng hợp scleroglucan: Hình 7: Con đường sinh tổng hợp scleroglucan 1. Hexokinase 2. Phosphoglucomutase 3. UTP-glucose-1-phosphate-uridilyltransferase 4. (1→3)-beta-glucan-synthase 5. Glycosyltransferase/glucosidase Có rất ít thông tin về việc hình thành scleroglucan từ Sclerotium glucanicum và S.rolfsii, nhưng nói chung nó cũng tương tự các bước tổng hợp các glucan khác. Trước tiên glucose được chuyển vào trong tế bào thông qua hexokinase và được phosphoryl hóa bằng enzyme phosphoglucomutase (PGM) và phosphoglucoisomerase (PMI). Pyrophosphorylase xúc tác cho sự hình thành uridine diphosphate glucose (UDP-glucose), sau đó nó tương tác với chất mang lipid và bắt đầu quá trình polymer hóa. Con đường dự kiến trong sản xuất được mô tả như sơ đồ trên. Sự hình thành sản phẩm phụ: Oxalic acid là sản phẩm phụ chủ yếu trong sản xuất scleroglucan, đó là sản phẩm không mong muốn. Oxalic acid là một sản phẩm trao đổi chất của nấm, nó liên quan đến điều Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 20 kiện canh trường và nguồn dinh dưỡng. Lượng oxalic acid là khác nhau tùy vào chủng giống nấm, nguồn carbon và nitơ, pH ban đầu và cũng bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của chất đệm hay chất hóa học khác trong việc phát triển của canh trường. Những điều kiện tối ưu nhất cho sự hình thành oxalic acid bao gồm nồng độ carbohydrate cao và sự thoáng khí phù hợp, giới hạn của nguồn dinh dưởng vô cơ, pH cao. Maxwell và Bateman cho rằng enzyme glyoxalate dehydrogenase có liên quan đến sinh tổng hợp oxalate bởi S.rolfsii, và cho rằng pH của môi trường bên ngoài là nhân tố chính ảnh hưởng sự tích lũy oxalate. Thành phần của canh trường lên men cũng có ảnh hưởng mạnh mẽ đến việc hình thành oxalate. Việc bổ sung L-threonine vào môi trường sẽ làm giảm mức độ tiết oxalic acid. Việc hình thành oxalate cũng phụ thuộc vào nguồn carbon tự nhiên dùng trong môi trường. Maxwell và Bateman cũng tìm ra rằng không có sự phát triển hay sự tích lũy oxalate xảy ra khi D-glucose, pyruvate, citrate, fumarate, glycolate, glyoxylate, L-aspatate, glycine hay glycerol được dùng như nguồn carbon duy nhất. Nhiều nhà nghiên cứu xem xét cơ chế sinh tổng hơp oxalate bởi vi sinh vật. Họ kết luận rằng sinh tổng hợp oxalate có thể xảy ra theo một số con đường khác nhau như phân tách bằng thủy phân oxaloacetate thành oxalate và acetate hay oxi hóa glyoxalate thành oxalate. Con đường hình thành oxalate được thể hiện ở sơ đồ sau. Hình 8: Quá trình dị hóa glucose và hình thành oxalate. Sự hình thành oxalate trong suốt quá trình lên men gây ra hai khó khăn. Thứ nhất, nó làm giảm nguồn carbon dẫn đến sự hình thành exopolysaccharide cũng giảm. Thứ hai, tách oxalate ra khỏi sản phẩm là cần thiết. Herve đã nghiên cứu những phương pháp để làm giảm Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 21 sự hình thành oxalate và tìm ra được: việc điều chỉnh pH ban đầu và điều khiển sự bổ sung NH4Cl trong suốt quá trình lên men có thể làm giảm sự hình thành oxalic acid mà không làm giảm sản lượng glucan. pH thấp sẽ làm hoạt hóa quá trình decacboxyl oxalate thành formate và CO2. Schilling et al. đề xuất pH thấp làm giảm sinh tổng hợp enzyme, và từ đó đã đưa ra mức pH = 2 để làm giảm thiểu nguồn carbon mất cho việc tạo thành oxalate. Những tác giả đó cũng phát hiện rằng việc giới hạn lượng oxy để làm giảm sản phẩm oxalate, vì sự sinh tổng hợp enzyme glycolateoxidase sẽ bị ức chế trong điều kiện kỵ khí và đề nghị rằng nếu hạn chế cung cấp oxy từ ban đầu có thế có lợi cho sản xuất glucan. Các yếu tố ảnh hưởng: Vi sinh vật phản ứng nhanh chóng với sự thay đổi của môi trường bằng nhiều cách khác nhau như là tăng hoặc giảm sinh tổng hợp protein, thay đổi hình thái tế bào, hay ức chế hay kích hoạt enzyme. Trong bình lên men, những thông số môi trường chình cần quan tâm là pH, nhiệt độ, oxy hòa tan, và tốc độ khuấy. Nhiệt độ: Nhiệt độ bên trong của vi sinh vật phải bằng với nhiệt độ của môi trường. Như những phản ứng hóa học khác, hoạt động của vi sinh vật rất nhạy cảm với nhiệt độ của môi trường. Nhiệt độ là thông số quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng cũng như quá trình sản xuất polysaccharide. Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho quá trình tổng hợp polysaccharide ngoại bào (20 ÷ 37oC) và nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh trưởng (28oC) là rất khác nhau. Dưới 28oC, sự hình thành acid oxalic sẽ tăng cường và có ảnh hưởng xấu tới sự tổng hợp scleroglucan. pH: pH hưởng đáng kể tới sinh lý vi sinh vật vì nó ảnh hưởng tới khả năng hòa tan và hấp thu, hoạt tính enzyme, hình dạng màng tế bào và các phản ứng oxy hóa khử. pH môi trường có ảnh hưởng sâu sắc tới cả tốc độ sản xuất và sự tổng hợp polysaccharide. Cũng như nhiệt độ, pH thích hợp cho sản xuất polysaccharide có thể khác với sinh trưởng. Trong trường hợp sản xuất xanthan, Moraine và Rogovin nhận thấy pH môi trường ảnh hưởng tới sản xuất polysaccharide nhiều hơn sinh trưởng tế bào. Kang và Cottrell thì nói rằng việc tổng hợp polymer sinh học từ các loại nấm có thể tối ưu trong khoảng pH là 4,0 ÷ 5,5. dựa vào những nhận định này, những nhà nghiên cứu đã phát triển quá trình lên men 2 giai đoạn, giai đoạn đầu tạo điều kiện tối ưu cho sinh trưởng và giai đoạn sau là tạo điều kiện để tổng hợp polysaccharide. Lacroix et la tiến hành lên men lấy pullulan, 1 glucan khác từ nấm, thì trong giai đoạn đầu, pH 2,0 cho sinh khối nấm men và tốc độ sinh trưởng cao nhất. khi lượng sinh khối đã đủ lớn thì điều chỉnh pH về 5,5 để thu sản phẩm pullulan lớn nhất. Cũng bằng cách tương tự, Wang và Mcneil đã chứng minh rằng lượng scleroglucan nhiều hơn theo con đường 2 giai đoạn. ở giai đoạn đầu tiên, pH được điều khiển ở 3,5 để tăng sinh trưởng, sau đó được điều chỉnh về pH = 4,5 để tăng cường tổng hợp polysaccharide. Sự tăng tổng hợp polysaccharide đạt được dưới những điều kiện này được kết hợp với việc hình thành phụ phẩm giảm 10%. Điều này cho thấy rằng, khi pH cao hơn so với khi tăng trưởng, carbon tới để tổng hợp polymer tăng. Trong một số nghiên cứu, để đơn giản hóa quá trình và giảm giá thành, pH không được điều khiển sau điều chỉnh ban đầu, mà lượng scleroglucan sản phẩm là tương đối thấp. Để giữ được pH tối ưu cho sản xuất polysaccharide, điều chỉnh pH trong quá Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 22 trình lên men là cần thiết, đặc biệt là đối với S.rolfsii phản ứng khác nhau khi một giai đoạn bất kỳ bị biến đổi phụ thuộc vào việc nuôi trong bình lắc hay trong bình phản ứng có khấy đảo. Oxy hòa tan: Oxy giữ vai trò trọng yếu trong đời sống của vi sinh vật hiếu khí bằng cách kích thích hay kiềm hãm những hệ enzyme của trao đổi chất bậc một hay bậc hai, và kích hoạt những phản ứng oxy hóa khi sử dụng chất dinh dưỡng và sinh năng lượng. Nó cũng ảnh hưởng tiêu cực tới trao đổi chất tế bào như sinh ra các gốc peroxide hay superoxide. Nghiên cứu ảnh hưởng của oxy hòa tan lên việc tổng hợp polymer sinh học trên S.glucanicum và S.rolfsii chỉ ra rằng khi lượng oxy đột ngột tăng cao, nó giảm sự hình thành glucan. Tuy nhiên trong sản xuất một số polysaccharide nhu pullulan và gellan, oxy vừa kích thích vừa cần cho sự sống để tổng hợp polymer. Ngược lại, canh trường nuôi Sclerotium lại phản ứng với lượng oxy hạn chế được cung cấp như việc hạn chế sinh trưởng và đặc biệt kích thích sự hình thành glucan. Đây là điều không được trông đợi ở vi sinh vật hiếu khí, nhưng có thể giảm lượng oxy hòa tan ảnh hưởng đến hình thái của nấm mốc và cấu trúc của dịch lên men, cái mà sẽ ảnh hưởng đến sự tăng trưởng tế bào và trao đổi chất. Nguyên nhân khác, hô hấp được tăng cường ở mức oxy hòa tan cao, do đó sẽ chuyển đổi nhiều carbon thành carbon dioxide và giảm cung cấp cho tổng hợp scleroglucan. Wang và McNeil đề nghị kích thích việc tổng hợp glucan trong điều kiện oxy hòa tan thấp có thể