Đề tài Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào

bổ sung vào môi trường thích hợp với dòng tế bào ñược nghiên cứu. Protein: mặc dù protein là thành phần chính trong huyết thanh nhưng vai trò của một số loại protein vẫn còn chưa ñược chứng minh rõ ràng: một số loại protein có lẽ có vai trò chuyên chở các chất khoáng, acid béo, hormone hoặc bản thân chúng cũng là hormone. Các loại protein hữu dụng là albumin và globulin. Fibronectin (globulin không tan) ñiều khiển sự kết hợp α 2-macroglobulin hạn chế hoạt ñộng của trypsin. Fetuin trong huyết thanh bò làm tăng tính bám của tế bào và transferrin liên kết với sắt làm giảm ñộc tính của sắt ñể phù hợp với nhu cầu của tế bào. Có thể có những loại protein khác chưa biết ñược ñặc tính cũng cần thiết cho khả năng bám và tăng trưởng của tế bào. Polypeptide: những huyết thanh có dạng ñóng cục tự nhiên sẽ kích thích sự tăng sinh của tế bào nhiều hơn là những huyết thanh ở dạng khác. ðiều này xảy ra là do có sự phóng thích ra một loại polypeptide từ tiểu cầu trong quá trình trong quá trình ñóng cục của huyết thannh. Polypeptide này ñược gọi là yếu tố tăng trưởng của tiểu cầu. ðây là một nhóm các polypeptide gây ra hoạt ñộng phân chia tế bào và có lẽ là yếu tố tăng trưởng chính trong huyết thanh. Những yếu tố khác như yếu tố tăng trưởng trong nguyên bào sợi (fibroplast growth factor FGF), yếu tố tăng trưởng biểu bì tế bào (epidermal growth factor EGF), yếu tố tăng trưởng nội bì và hoạt ñộng kích thích sự nhân dòng (Multiplication-Stimulating Activity MSA) ñược cô lập từ mô hoặc tế bào phóng thích ra môi trường trong quá trình nuôi cấy với các mức ñộ chuyên biệt khác nhau và có lẽ chúng có mặt với một lượng nhỏ trong huyết thanh. Hormone: hormone có những ảnh hưởng khác nhau trên tế bào và thường khó có thể nhận ra ñược những tác ñộng chính của chúng. Insulin kích thích sự hấp thu glucose và Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 14 amino acid và có lẽ khả năng kích thích sự phân chia tế bào của nó ñã ảnh hưởng ñến thuộc tính này. Các hormone tăng trưởng có thể có mặt trong huyết thanh, ñặc biệt là huyết thanh bò và cùng với somatomedine ảnh hưởng lên sự phân bào. Hydrocortisone cũng có trong huyết thanh với hàm lượng thay ñổi, kích thích sự bám dính của tế bào; nhưng trong những ñiều kiện nhất ñịnh (khi có mật ñộ tế bào cao) thì cản sự phân bào và có thể cám ứng biệt hóa tế bào. Các thí nghiệm giàm hoặc bỏ hẳn huyết thanh trong môi trường nuôi cấy cho thấy các hormone cần thiết cho việc nuôi cấy có thể cũng có mặt trong thành phần của huyết thanh nên việc bổ sung huyết thanh vào môi trường nuôi cấy là cần thiết. Các chất biến dưỡng và các dưỡng chất: trong huyết thanh cũng có amino acid, glucose, ketoacid và một số các dưỡng chất, các chất biến dưỡng trung gian. Những chất này quan trọng trong môi trường ñơn giản nhưng ít quan trọng hơn trong các môi trường phức tạp, ñặc biệt là những môi trường có các chất bổ sung khác và các amino acid với nồng ñộ cao. Khoáng chất: các nguyên tố dạng vết như sắt, ñồng, kẽm có thể ñược cung cấp bởi huyết thanh và chúng liên kết với các protein của huyết thanh. Các yếu tố kìm hãm: huyết thanh có thể có chứa các cơ chất có tác dụng kìm hãm sự tăng sinh của tế bào. Một số chất có thể ñược tạo ra trong quá trình chuẩn bị môi trường như ñộc tố của các loại vi khuẩn nhiễm vào môi trường trước khi qua lọc vô trùng, các phân ñoạn của γ – globulin có thể chứa các loại kháng sinh gây trợ ngại cho việc nuôi cấy. Hơi nóng có thể làm phân hủy một vài phức chất trong huyết thanh và làm giảm tính ñộc của immunoglobulin mà không gây hại ñến các yếu tố tăng trưởng là polypeptide, hơi nóng có thể phân hủy một số chất dễ bị biến tính bởi nhiệt và thành phần của huyết thanh sẽ không còn giống trước khi xử lý. 4.1.2.3 Ảnh hưởng cuả oxygen, carbon dioxide dạng khí và nhiệt ñộ trong quá trình nuôi cấy. a. Oxygen Tùy theo mục ñích sử dụng mà nhu cầu O2 của mẫu cấy thay ñổi: ñó là sự khác nhau giữa cơ quan và môi trường nuôi cấy. Trong khi O2 không khí hoặc một lượng O2 thấp hơn nồng ñộ O2 không khí phù hợp hơn với hầu hết các tế bào nuôi cấy thì có vài loại cơ quan, ví dụ như phôi của các giai ñoạn sau (phôi mới hình thành hoặc phôi trưởng thành) lại cần ñến 95% O2 ở dạng khí. Hầu hết các tế bào tách rời nhau cần lượng O2 thấp hơn và sẽ tăng trưởng tốt hơn khi lượng O2 thấp hơn O2 không khí. Sự có mặt selenium làm giảm bớt lượng O2 hòa tan trong môi trường. Vai trò của O2 hòa tan ngày càng giữ vai trò quan trong và phải cung cấp O2 trong suốt giai ñoạn nuôi mẫu. ðộ sâu của môi trường có thể ảnh hưởng ñến sự khuếch tán của O2 vào ñến mẫu nuôi cấy, vì vậy người ta khuyên rằng nên ñổ môi trường vào bình nuôi cấy dày khoảng 2 – 5 mm (0,2 – 0,5 ml/cm2) trong bình nuôi cấy. b. Carbon Dioxide (CO2) CO2 có vai trò phức tạp hơn O2 vì có sự tương quan giữa mọi hoạt ñộng của nó, ví dụ CO2 hòa tan, pH và nồng ñộ . Khó có thể xác ñịnh ñược tác dụng chính của nó. Áp lực Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 15 của CO2 không khí sẽ ñiều hòa trực tiếp nồng ñộ CO2 hòa tan trong môi trường tương tự như vai trò của nhiệt ñộ. Sự hòa tan CO2 trong nước sẽ tạo ra acid: (1) có ñộ hòa tan thấp và không kết hợp với các cation hiện diện trong môi trường. Nó có khuynh hướng tái hợp ñể tạo ra acid. Kết quả cuối cùng của sự tăng CO2 không khí là sự giảm pH môi trường. Ảnh hưởng này có thể giải quyết bằng cách tăng nồng ñộ bicarbonate trong môi trường nuôi cấy: (2) Sự tăng nồng ñộ bicarbonate sẽ ñẩy phương trình (1) lệch sang trái và sự cân bằng chỉ ñạt ñược khi pH = 4. Nếu sử dụng một chất kiềm khác như NaOH thay cho NaHCO3 thì kết quả cuối cùng cũng tương tự: (3) Mỗi môi trường ñòi hỏi một nồng ñộ và áp lực CO2 ñể ñạt ñược pH và áp suất thẩm thấu chính xác. Tuy nhiên, vẫn có những thay ñổi tối thiểu xảy ra trong các phương pháp chuẩn bị môi trường khác nhau. Tóm lại, khi tế bào ñược nuôi cấy với mật ñộ trong bình có nắp cho phép không khí lưu thông thì cẩn phải ñược nuôi trong ñiều kiện có CO2 không khí, nồng ñộ của CO2 phải cân bằng với nồng ñộ bicarbonate sodium trong môi trường. Khi mật ñộ tế bào nuôi cấy thấp (trong quá trình nhân dòng) thì cần phải ñưa CO2 dạng khí quá nắp bình trong hầu hết các thí nghiệm. Khi mật ñộ tế bào cao thì thao tác này không cần thiết nhưng cần phải nuôi tế bào trong các dĩa ñể mở dễ trao ñổi khí. Trong trường hợp tế bào tạo ra nhiều acid và CO2 nội sinh thì cần phải nới lỏng nắp bình ñể CO2 thoát ra ngoài. Trong những trường hợp này cần phải bổ sung dung dịch ñệm HEPES (20mM) vào môi trường ñể ổn ñịnh pH. c. Nhiệt ñộ nuôi cấy Nhiệt ñộ nuôi cấy thích hợp của tế bào phụ thuộc vào: Thân nhiệt của loài ñộng vật cần thu tế bào ñể nuôi cấy. Tế bào ñó thuộc vùng nhiệt ñộ nào trên cơ thể (ví dụ nhiệt ñộ ở da thấp hơn nhiệt ñộ bên trong cơ thể) Có sự kết hợp của một yếu tố an toàn cho phép những sai sót tối thiểu có thể xảy ra trong quá trình nuôi cấy. Nhu vậy nhiệt ñộ cần thiết ñể nuôi cấy hầu hết tế bào người và ñộng vật máu nóng là 36,5oC, gần với thân nhiệt, nhưng ñể an toàn nên nuôi cấy nhiệt ñộ thấp hơn một chút ít. ðối với các loài chim, vì thân nhiệt của chúng cao nên tế bào của chúng tăng trưởng tốt nhất ở nhiệt ñộ 38,5oC nhưng chúng vẫn có thể tăng trưởng ở nhiệt ñộ 36,5oC. Ở nhiệt ñộ này, sự tăng trưởng của tế bào chậm hơn. Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào ñộng vật có thể chịu ñược sự giảm nhiệt ñộ, chúng có thể sống vài ngày ở nhiệt ñộ 4oC và có thể chịu ñược sự ñông lạnh ở –196oC, nhưng chúng không thể chịu ñược nhiệt ñộ tăng cao hơn mức bình thường khoảng 2oC (chúng chỉ có thể chịu ñựng ñược nhiệt ñộ 39,5oC trong vài giờ) và sẽ chết rất nhanh khi nhiệt ñộ tăng lên 40oC hoặc trên nữa. Tế bào biểu bì của ñộng vật ñẳng nhiệt có thể tăng trưởng tốt hơn ở 33oC. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 16 ðối với ñộng vật không xương sống, phạm vi nhiệt ñộ có lẽ hẹp hơn. ðối với những ñộng vật có thân nhiệt thay ñổi, tế bào của chúng có thể chịu ñược một biên ñộ cao nhưng tốt hơn nên nuôi chúng ở một nhiệt ñộ trung bình trong biên ñộ nhiệt ñó. Nhiệt ñộ nuôi nên ñược giữ ổn ñịnh, sự chênh lệch nhiệt ñộ có thể xảy ra tối ña là ± 0,5oC. Tế bào có thể tăng trưởng hoàn toàn bình thường ở trong khoảng nhiệt ñộ 33 ÷ 39oC nhưng tốc ñộ tăng trưởng và khả năng biến dưỡng trong tế bào sẽ thay ñổi tùy theo nhiệt ñộ. Bình nuôi cấy ñược giữ trong tủ ấm, phải ñảm bảo nhiệt ñộ ñều và ổn ñịnh ở mọi nơi trong tủ ấm. Bể ñiều nhiệt cũng có thể ñược sử dụng ñể giữ mẫu nhưng mẫu cũng sẽ dễ bị nhiễm hơn là khi ñược nuôi trong tủ ấm vì bình thường nuôi cấy phải giữa ngập trong nước. Do ñó bể ñiều nhiệt ít ñược sử dụng. Phải sử dụng tủ ấm có không khí ñối lưu cho mục ñích này. 4.1.3 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Thiết bị Khử trùng Cách bố trí Rửa các dụng cụ thủy tinh An toàn phòng thí nghiệm 4.2 Các bước thực hiện nuôi cấy tế bào ñộng vật 4.2.1 Chuẩn bị tế bào ðể có thể nuôi cấy tế bào cô lập, việc trước tiên là phải tách tế bào ra khỏi mô. Tế bào ñược tách ra khỏi mô bằng phương pháp cơ học hay bằng phương pháp enzyme và trở thành huyền phù tế bào. Các tế bào sau ñó sẽ bám vào bề mặt cơ chất ñể sống và tăng sinh. Enzyme thường ñược sử dụng ñể tách tế bào là trypsin, collagenase, elastase, hyaluronidase, Dnase,pronase, dispase hoặc là hỗn hợp các enzyme. Trypsin và pronase có thể tách rời tế bào hoàn toàn nhưng có thể gây tổn thương cho tế bào. Collagenase và dispase không tách tế bào ñược hoàn toàn nhưng không gây tổn thương ñến tế bào. Hyaluronidase có thể ñược sử dụng phối hợp với collagenase và Dnase ñể phân tán DNA và phóng thích từ những tế bào bị vỡ vì nó có khuynh hướng kích thích tế bào kết cụm lại với nhau và làm suy yếu quá trình phân giải protein. Mặc dù mỗi loại mô có thể có những ñòi hỏi ñiều kiện nuôi cấy khác nhau nhưng những yêu cầu thông thường của tế bào trong quá trình nuôi cấy sơ khởi thường giống nhau: • Chất béo và mô bị hoại tử thường bị bỏ ñi trong quá trình giải phẫu mô. • Mô nên ñược cắt ra trong tình trạng ít bị tổn hại nhất. • Enzyme sử dụng trong quá trình tách tế bào nên ñược loải bỏ bằng cách ly tâm sau khi ñã tách xong tế bào. • Mật ñộ tế bào trong môi trường nuôi cấy ñầu tiên thường cao hơn nhiều so với những lần cấy chuyền kế tiếp, bởi vì khả năng phân chia của tế bào vừa mới tách khỏi mô rất thấp trong môi trường nuôi cấy sơ khởi. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 17 • Môi trường giàu chất dinh dưỡng như F10, F12 của Ham thường ñược sử dụng hơn là môi trường cơ bản như môi trường EME của Eagle, và nếu tế bào có nhu cầu về huyết thanh thì huyết thanh phôi bò cần cho sự sống của tế bào hơn là huyết thanh ngựa. • Các cụm tế bào phôi cô lập thường dễ tạo ra nhiều tế bào sống và tăng sinh nhanh chóng trong môi trường khởi ñầu hơn là tế bào trưởng thành. 4.2.2 Cấy chuyền lớp mỏng các dòng tế bào tăng trưởng liên tục Tùy vào từng loại tế bào mà phải xây dựng môi trường cấy chuyền phù hợp. Kết quả chỉ ñạt ñược bằng thực nghiệm. 4.2.3 ðếm số tế bào có sử dụng thuốc nhuộm – Phương pháp sử dụng buồng ñếm Việc ñếm số tế bào ñược thực hiện trong một thể tích nhỏ huyền phù tế bào dưới kính hiển vi. Buồng ñếm là một lame kính ñể quan sát dưới kính hiển vi, ñược chia thành 9 ô vuông lớn cách nhau bằng 3 ñường gạch. Mỗi ô vuông lớn có diện tích 1mm2. ðộ sâu của lame kính ở vị trí chia ô là 0,1mm; như vậy tổng số thể tích của chất lỏng trong mỗi ô vuông lớn là . Tế bào có thể ñược ñếm bằng máy ñếm tế bào ñiện tử. Dung dịch: tryptophan xanh 0,4% trong HBSS: trữ ở 4oC. Các bước tiến hành:
ðậy lên trên buồng ñếm bằng một kính ñậy mẫu và ấn nhẹ ñến khi có thể thấy rõ ñược vòng Newton. Cho một giọt huyền phù tế bào (thường pha loãng với tỉ lệ 1:5 có nghĩa là cho 0,2ml tế bào vào cùng với 0,3ml HBSS và 0,5ml trypan xanh 0,4%) ở cạnh (bìa) của kính ñậy mẫu.
ðặt buồng ñếm vào bàn ñể mẫu của kính hiển vi soi ngược và ñếm tất cả các tế bào bị nhuộm màu xanh trong bốn ô vuông lớn ở mỗi góc của vùng trung tâm (S1 ñến S4) và cả ô vuông trung tâm S5. ðếm các tế bào nằm ở cạnh bên phải và cạnh trên nhưng không ñếm tế bào ở cạnh trái và cạnh dưới. Các tế bào chết bắt màu và có màu xanh. Hệ thống nuôi cấy tốt là hệ thống nuôi cấy có hơn 90% tế bào sống. 4.2.4 Cấy chuyền các dòng tế bào liên tục trong dịch huyền phù tế bào Các tế bào tăng trưởng liên tục trong môi trường nuôi cấy ñược cấy chuyền bằng cách pha loãng. Lấy ví dụ ñối với tế bào bạch cầu Molt-4 của người, ñó là một dòng tế bào tăng trưởng liên tục có thể nhân giống vô hạn ñịnh trong dịch huyền phù. Dung dịch nuôi cấy: giống dung dịch dùng cho cấy chuyền lớp mỏng. Các bước tiến hành
Lấy bình nuôi cấy mô có chứa tế bào Molt-4 ra khỏi tủ ấm CO2 37 o, ñộ ẩm 5%. ðóng nắp và lắc nhẹ. ðốt nắp bình nuôi cấy trước khi mở và lấy một phần nhỏ huyền phù tế Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 18 bào cho vào một ống hình nón bằng nhựa. Pha loãng nếu cần thiết và ñếm bằng buồng ñếm.
Lấy một phần nhỏ huyền phù tế bào và pha loãng với môi trường DMEM hoàn chỉnh ñể ñạt ñến mật ñộ tế bào thích hợp ( ). Mở lỏng nắp ra và ñặt bình thẳng ñứng trong tủ ấm CO2. Quan sát thường xuyên, lắc nhẹ và thêm môi trường cần thiết. 4.2.5 Bảo quản và lưu trữ tế bào sống Vì không thể duy trì ñược các dòng tế bào trong quá trình nuôi cấy vô hạn ñịnh và vì chúng có thể thay ñổi các ñặc tính trong suốt quá trình nuôi cấy, do ñó cần phải lưu trữ tế bào ñang ở các giai ñoạn tăng trưởng khác nhau ñể sử dụng trong tương lai. Phương pháp bảo quản ở nhiệt ñộ thấp rất ñơn giản và không ñòi hỏi các thiết bị mắc tiền. Gồm các bước chính như sau: • Bảo quản ở nhiệt ñộ thấp. • ðưa mẫu ra khỏi ñiều kiện tồn trữ. • Gửi và nhận tế bào nuôi cấy. 5. Tách tế bào bằng phương pháp sữ dụng máy ly tâm 5.1 Giới thiệu Sự phân tách tế bào nhờ máy ly tâm là phương pháp mà các quần thể tế bào khác nhau nằm lẫn với nhau sẽ ñược chia thành hai nhóm ñối lập ñể dễ dàng tách chúng ra thành những quần thể nhỏ hơn dựa vào kích thước của tế bào. Phương pháp này ñã ñược sử dụng thành công ñể tách nhiều loại tế bào khác nhau từ huyền phù tế bào và các hệ thống nuôi cấy phụ thuộc vào cơ chất, hoặc ñể phóng thích trực tiếp các quần thể tế bào cố ñịnh trong các mô hoặc trong các dịch cơ thể. Phương pháp ly tâm ñược chứng minh là có hiệu quả ñể tách tế bào dựa vào những khác biệt rất nhỏ về kích thước tế bào và số lượng tế bào mà không thể thực hiện bằng các phương pháp khác. Hơn nữa, phương pháp tách tế bào nhờ ly tâm có thể thực hiện nhanh chóng, chỉ cần ít thời gian (20 – 120 phút) ñể có ñược kết quả, và quá trình này xảy ra trong môi trường bổ sung các chất ñặc biệt ñể ảnh hưởng ñến áp suất thẩm thấu hoặc ñộ nhớt của môi trường. Vì vậy, nếu như có một sự thay ñổi rất nhỏ làm ảnh hưởng ñến sinh lý của tế bào thì sự tách tế bào này có thể ảnh hưởng rất nhanh chóng. Trong hầu hết các trường hợp, có một vài ảnh hưởng tác ñộng lên tế bào trong suốt quá trình phân chia nhưng những tác ñộng này không ảnh hưởng ñến sự sống cũng như những phản ứng của tế bào. So sánh với các phương pháp tách tế bào khác nhu: phân loại tế bào nhờ sự phát huỳnh quang hoặc tác tế bào nhờ vào trọng lượng của tế bào thì phương pháp ly tâm là phương pháp ñơn giản và nhanh nhất. Phương pháp ly tâm có thể khắc phục một số hạn chế như số lượng tế bào trong quần thể cần tách mà yếu tố này có thể có ảnh hưởng rất lớn ñến phương pháp tách tế bào nhờ sự phát huỳnh quang, hoặc yếu tố thời gian trong phương pháp tách tế bào nhờ sự kết tủa theo trọng lượng tế bào cũng như các vấn ñề có liên quan ñến stress thẩm thấu trong môi trường ly tâm. 5.2 Sự phát triển phương pháp tách tế bào nhờ máy ly tâm Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 19 Phương pháp tách tế bào nhờ ly tâm ñược phát triển bởi Lindahl (1948) ñể tách các tế bào và các phân ñoạn của tế bào (Lindahl và Nyberg, 1955; Lindahl, 1986) dựa vào sử khởi ñầu của Lindbergh vào năm 1932. Phương pháp ly tâm ngược dòng ñược các nhà nghiên cứu sử dụng ñể tách các dạng tế bào khác nhau, nhưng nói chung, những phương pháp này khó thực hiện cho ñến khi Beckman Instrument giới thiệu một thiết bị phân tách tế bào bằng cách ly tâm vào năm 1973. Khi thiết bị này ñược ñưa ra thị trường thì nó sử dụng ñể tách nhiều loại tế bào như: vi khuẩn, nấm men và tế bào ñộng vật có vú ñang ở trong các hệ thống nuôi cấy hoặc giải phóng tế bào từ các mô hoặc khối u. Hơn nữa, phương pháp này cũng ñược dùng ñể tách các tế bào ñang ở các pha khác nhau trong chu trình tế bào dựa vào những chênh lệch rất nhỏ về kích thước của những tế bào ñang tăng trưởng giữa hai lần phân chia. Trong hầu hết các trường hợp, sự tách tế bào thành công là do các tế bào có thể hoàn toàn tách rời nhau ra ñể tạo thành huyền phù tế bào ñơn. Nếu không tách ñược các tế bào ñơn thì sẽ không thể tiến hành ñược các thí nghiệm như mong muốn. 5.3 Lý thuyết cơ bản của sự tách tế bào Các tế bào ñược tách rời nhau bằng phương pháp ly tâm trong quá trình mà trước ñây người ta thường gọi là phép ly tâm ngược dòng. Quá trình này dựa trên hai lực ñối lập nhau: dòng chảy của môi trường và gia tốc góc của lực hướng tâm ñược áp dụng. Tất cả các tế bào trong dịch huyền phù ñược bơm với một áp lực nhẹ vào trong phòng phân tách ñến ñầu ngoài cùng của phòng (tại ñó bán kính quay ñạt ñến giá trị cực ñại rmax) và bắt ñầu tụ lại trong phòng này. Khi tế bào vào ñầy phòng rồi thì ống mang tế bào quay ngược lại làm chúng thay ñổi hướng: từ hướng trôi ra ngoài về phía ngoại vi của bộ phận quay trở thành hướng ñi vào trung tâm của bộ phân quay. Khi ñổi hướng thì các tế bào ñi vào trong một phòng có dạng hình nón nằm nghiêng. Khi các tế bào ñi vào trong phòng thì khoảng cách mà tế bào phải băng qua tăng lên ñột ngột làm giảm tốc ñộ di chuyển vào trong của tế bào khi tốc ñộ trôi của môi trường không thay ñổi. Vì vậy. lúc này tế bào bắt ñầu giảm tốc ñộ. Ở một số thời ñiểm nào ñó, tùy vào kích thước của tế bào, tốc ñộ trôi của môi trường, ñộ nhớt của môi trường và lực hướng tâm mà tế bào sẽ ngừng di chuyển vào trong, và ñược giữ lại trong phòng khi tốc ñộ trôi ñược cân bằng bởi lực ly tâm bên ngoài (lực ly tâm phụ thuộc vào momen góc của phần quay của rotor). Quần thể tế bào lúc này ñã ñạt ñến trạng thái cân bằng và vị trí của chúng vẫn không thay ñổi mặc dù tế bào có khuynh hướng tự sắp xếp dưới sự tổ hợp của các lực ñối lập với những mẫu nhỏ nhất nằm gần trục quay của rotor. Bây giờ có hai sự lựa chọn ñể ñiều khiển có liên quan ñến sự phân ñoạn của tế bào: tốc ñộ của rotor có thể tiếp tục giảm xuống hoặc tốc ñộ trôi có thể tiếp tục tăng lên. Trong thực tế, sự chọn lựa thứ hai thực tế hơn vì bơm có thể ñược ñiều chỉnh chính xác và dễ dàn hơn so với việc ñiều chỉnh rotor. Trong trường hợp khác có thể ñiều chỉnh cho các quần thể tế bào nhỏ nhất ñang ở trong trạng thái cân bằng có thể di chuyển vào trong phòng cho ñến khi nó ñụng phải phần thu hẹp lại của phòng, tại ñó, tốc ñộ trôi tăng lên do diện tích tế bào phải vượt qua giảm xuống ñột ngột. Vì vậy bằng cách ñiều chỉnh cho tốc ñộ trôi của tế bào tăng lên một ít (ñộ gia tăng tốc ñộ trôi tùy thuộc vào kinh nghiệm của người thực hiện) thì tế bào có thể ñược tách ra từ quần thể. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 20 Các ñặc ñiểm của sự phân tách thực tế phụ thuộc vào hình dạng và kích thước của tế bào trong quần thể. ðể trypsin hóa những tế bào có trọng lượng không lớn hơn nhiều so với dung dịch ñệm mà nó ñang ñược giữ ở trong ñó, hình dạng của tế bào nói chung là hình cầu nếu như tế bào không bị một lực nào ñó tác ñộng lên làm cho nó bị biến ñổi. Như vậy, thường tế bào có kích thước biểu kiến dễ ñược phân tách. Sự phân tách tế bào bằng phương pháp ly tâm thường khó có thể phân biệt các phân ñoạn nhỏ do có sự khác nhau rất nhỏ về kích thước tế bào. Sự phân tách thành công dựa trên sự khác biệt rất nhỏ của bán kính tế bào (khoảng 3 – 5%) giữa những phân ñoạn liên tục nhau mà có thể phân biệt ñược rõ ràng bằng phương pháp ly tâm. 5.4 Ví dụ Phần lý thuyết trên ñã ñược ứng dụng ñể tách nhiều loại tế bào khác nhau như: các tế bào máu và các tế bào hồng cầu, sự phân ñoạn nhỏ của các bạch cầu ñơn nhân và các quần thể bạch cầu lympho, và tách các tế bào ñang ñược nuôi cấy dựa vào các pha của chu trình tế bào hoặc sự khác nhau về kích thước trong một quần thể gồm nhiều loại tế bào. Một trong những ứng dụng thường ñược tiến hành là tách một loại tế bào từ một quần thể các tế bào ñược phóng thích ra khỏi mô nhờ tác dụng của enzyme. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 21 Khung, chất dinh dưỡng Khung Phân lập tế bào Nhân số lượng Nuôi cấy Tách khung Thu nhận sản phẩm Cơ thịt Thịt nuôi cấy PHẦN II: CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY THỊT TỪ TẾ BÀO (IN VITRO – CULTURED MEAT PRODUCTION) 1. Phương pháp nuôi cấy 1.1 Cơ sở khoa học IMPS ở quy mô phòng thí nghiệm ñược ñề xuất bởi nhiều nhà nghiên cứu mà cơ sở của nó là sự phát triển của mô tế bào trên một bộ khung hay chất mang “scaffold” trong một môi trường thích hợp ñược ñặt trong một thiết bị nuôi cấy ñược thiết kế ñặc biệt. Van Eelen at al., 1999 ñã ñề xuất sự phát triển của tế bào cơ trên lưới collagen trong khi Edelman et al., 2005 ñề xuất IMPS mà tế bào cơ ñược phát triển trên hạt collagen. Cũng theo Van Eelen at al., 1999 thì việc sử dụng bộ khung hay chất mang chỉ có thể tạo ra sản phẩm có bề dày 100 – 200 µm do sự hạn chế về mặt không gian. Kết quả ñó cũng chỉ ra rằng, sản phẩm thu ñược từ phương pháp này thiếu hẳn cấu trúc của cơ thịt tự nhiên và vì thế khó có thể ñưa ngay vào quy trình sản xuất (Edelman et al.,2005). ðể tạo ra sản phẩm thịt với cấu trúc ba chiều, Van Eelen et al., 1999 ñã ñề nghị việc phủ nhiều bề mặt cắt nhau trong môi trường mô tế bào. Huyết thanh O2, chất mang Hình 1: Sơ ñồ khối quy trình nuôi cấy thịt Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 22 Hình 2: biểu ñồ quy trình nuôi cấy thịt liên tục 1.2 Tế bào và phương pháp phân lập tế bào 1.2.1 Sự hình thành mô cơ tự nhiên Trong suốt quá trình phát triển của phôi, sự hình thành cơ (xem hình 1a) bắt ñầu từ sự tăng lên về số lượng của những tế bào cơ có nhân ñơn myoblast (Benjaminsom et al., 2002). Sau ñó thì những tế bào cơ này tập hợp lại với nhau ñể hình thành nên ống tế bào ña nhân “myotube”; những ống tế bào ña nhân này sẽ tiếp tục phát triển ñể hình thành nên sợi cơ. Một ñặc ñiểm quan trọng là sợi cơ này không có sự tăng lên về số lượng. Sau khi ñược sinh ra, sự tăng lên về số lượng và nhân của mỗi sợi cơ cũng ñược giữ ở mức cố ñịnh, trừ khi những sợi cơ này cần ñược sửa chữa do tổn thương hay cần thay mới do lão hóa. Khi ñó, những tế bào myosatellite sẽ ñảm nhận việc tạo ra những sợi cơ mới hay góp phần làm tăng số lượng nhân của sợi cơ có sẵn (xem hình 3b) nhằm phục hồi kích thước của sợi cơ ban ñầu sau khi bị tổn thương. Tế bào nhân ñơn myosatellite nằm bên cạnh màng cơ, những tế bào này thường không hoạt ñộng và không phân chia. Khi bị kích thích bởi lực nén mạnh hay vết thương thì những tế bào myosatellite sẽ phân chia thành tế bào myosatellite mới và tế bào cơ myoblast mà từ tế bào myoblast có thể tăng lên về số lượng ñể hình thành nên những sợi cơ mới hay bổ sung vào sợi cơ hiện tại (Benjaminsom et al., 2002). Chính vì thế mà tế bào myosatellite còn ñược gọi là tế bào biến ñổi, tức là có khả năng phát triển thành một tế bào cơ mới. Tuy nhiên, những tế bào myosatellite chiếm tỉ lệ rất nhỏ (khoảng 1 – 5%) trên tổng số tế bào của mô cơ và tỉ lệ này còn phụ thuộc nhiều vào thành phần sợi cơ và tuổi cơ (Allen, 1997). Khi cơ bị lão hóa hay già ñi thì khả năng sinh sản cũng như số lượng của tế bào myosatellite cũng giảm ñi nhanh chóng. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 23 Hình 3: Sự hình thành sợi cơ tự nhiên 1.2.2 Những loại tế bào có thể sử dụng ñể nuôi cấy 1.2.2.1 Tế bào ñã ñược ñề xuất và nghiên cứu Van Eelen et at, 1999 và Edelman el at, 2005 ñã nghiên cứu hệ thống nuôi cấy thịt từ tế bào phôi (embryonic stem cell (ES)) và từ tế bào myosatellite. Theo lí thuyết, sau khi tế bào ES ñược nuôi cấy thì nó sẽ sinh sản lên nhanh chóng và không giới hạn số lần nhân ñôi, ñiều ñó có thể hạn chế ñược việc phân lập và nuôi cấy tế bào từ phôi nhiều lần. Tuy nhiên, những nổ lực trong hai thập kỉ qua vẫn chưa ñạt ñược nhiều thành công do những khó khăn trong việc nhận biết, phân lập và ñiều khiển quá trình biến ñổi tế bào (ñặc biệt là từ tế bào phôi thành tế bào cơ, chính vì thế mà tế bào phôi cũng ñược xem là một trong những loại tế bào biến ñổi) .(Keefer, 2007). ðối với tế bào myosatellite, mặc dù nó có nhược ñiể