Đề tài Đánh giá chất lượng ký thuật vi thể trên tiêu bản nhuộm HEMA TOXYLIN - EOSIN ở một số cơ sở giải phẫu bệnh trên địa bàn Hà Nội

ĐẶT VẤN ĐỀ Cho tới nay chẩn đoán mô bệnh học vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc xác định bệnh. Trong khoảng hai thập niên trở lại đây, với sự phát triển nhanh của khoa học công nghệ trong lĩnh vực thăm dò chẩn đoán như nội soi, siêu âm, chụp cắt lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ, nuôi cấy tế bào, bảo quản và ghép mô…đã tạo điều kiện cho sinh thiết chẩn đoán mô bệnh học phát triển cả về số lượng lẫn quy mô. Trong đó, bộ ba chẩn đoán gồm siêu âm – nội soi – sinh thiết đã trở thành mũi nhọn quan trọng. Sự phát triển này đã ngày càng khẳng định vị thế của lĩnh vực chẩn đoán mô bệnh học, góp phần chẩn đoán sớm nhiều tổn thương và nó rất hữu ích cho chẩn đoán và điều trị cũng như phòng bệnh. Một xét nghiệm mô bệnh học thường được tiến hành theo một chuỗi kỹ thuật liên hoàn bao gồm: 1).Lấy bệnh phẩm, cắt lọc; 2).Cố định bệnh phẩm; 3).Gửi xét nghiệm; 4).Vùi bệnh phẩm; 5).Cắt mảnh và dán; 6).Nhuộm; 7).Đọc kết quả. Mỗi khâu đều có những yêu cầu riêng và liên quan rất mật thiết với nhau, ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả chẩn đoán mô bệnh học. Trong các khâu kể trên thì khâu đầu và cuối được thực hiện bởi các bác sĩ chuyên khoa, các khâu còn lại đều được thực hiện bởi các kỹ thuật viên giải phẫu bệnh làm việc trong labo. Tùy theo mục đích và yêu cầu của xét nghiệm mà việc xử lý kỹ thuật ở từng khâu có những điểm khác nhau và có những quy trình riêng. Kỹ thuật nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE) là kỹ thuật phổ biến nhất trong các kỹ thuật mô học cũng như mô bệnh học, vì hầu hết các chẩn đoán mô bệnh học đều chỉ cần và (hoặc) phải dựa vào kỹ thuật này. Vì vậy nó được gọi là kỹ thuật thường quy cho mọi loại xét nghiệm mô bệnh học trong labo giải phẫu bệnh. Hiện nay, xét nghiệm mô bệnh học ở các cơ sở y tế trung ương trung bình có tới gần 50% trường hợp sai sót các loại trong các khâu kỹ thuật và làm giảm chất lượng chẩn đoán, trong đó khoảng 10% xét nghiệm âm tính hoặc chẩn đoán sai vì lý do kỹ thuật (3). Xuất phát từ tính thực tiễn của kỹ thuật nhuộm HE nhằm đảm bảo chất lượng trong chẩn đoán mô bệnh học, là một sinh viên sắp tốt nghiệp, một Cử nhân Kỹ thuật Y học tương lai nên qua bài khóa luận này em mong muốn rằng: Thực hiện thành thạo một chuỗi kỹ thuật liên hoàn từ bệnh phẩm ra những tiêu bản nhuộm H - E. Bước đầu đánh giá chất lượng vi thể và một số yếu tố ảnh hưởng đến tiêu bản nhuộm H - E. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể: Là một bộ phận quan trọng của khoa học tổn thương, xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể có mục đích phát hiện và nghiên cứu những tính chất, đặc điểm của tổn thương thuộc phạm vi tổ chức và tế bào. Ở một chừng mực nhất định, nó cho phép tìm hiểu những nguyên nhân gây ra những tổn thương ấy, góp phần giải thích cơ chế sinh bệnh cũng như những quy luật phát sinh và phát triển của tổn thương. Trong bệnh học, đây là một loại xét nghiệm có tính chính xác cao và độ tin cậy khá lớn nếu như kỹ thuật tiến hành đúng quy tắc và người đọc có những kinh nghiệm nhất định. Đã từ lâu, xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể đã trở thành người trợ thủ đắc lực cho nhà lâm sàng học và càng không thể thiếu được đối với nhà nghiên cứu y học. Trên thực tế, đối tượng xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể rất phong phú, phạm vi áp dụng ngày càng được mở rộng, ở các nước cũng như ở Việt Nam, đặc biệt trong lĩnh vực phát hiện bệnh. Ngày nay, hầu như mọi chuyên khoa lâm sàng và phần lớn những chuyên khoa cận lâm sàng đều có sử dụng những kết quả xét nghiệm giải phẫu bệnh vi thể vào công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học hoặc phục vụ bệnh nhân. 1.2. Tổng Quan về Hematoxylin – Eosin. Hematoxylin: là một phẩm nhuộm tự nhiên, chiết xuất bằng ete từ lõi cây Haematoxylon campechianum mọc trong vùng nhiệt đới Campeche ở Mexico. Bản thân Hematoxylin không có đặc tính nhuộm, mà nó phải trải qua quá trình oxy hóa để biến thành Hematein mới nhuộm được: đó là hiện tượng “Hematoxylin đã chín”. Sự oxy hóa này xảy ra do để dung dịch nhuộm từ 6 ngày đến 3 tuần để mở dưới ánh sáng mặt trời hoặc bằng các tác nhân gây oxy hóa như: iodat sodium, permanganat, potassium, oxytmereua. Trong quá trình chín Hematoxylin (C16H14O6) mất 2 nguyên tử H để trở thành Hematein (C16H12O6) có sự sắp xếp kiểu quinoit trong vòng dưới đây:

H×nh 1.C«ng thøc cña Hematoxylin  H×nh 2.C«ng thøc cña Hematin   Sự oxy hóa liên tục của Hematein sẽ có hình thành một hợp chất không màu, chính vì vậy mà một số người cho rằng quá trình oxy hóa chậm một cách tự nhiên tốt hơn là sự oxy hóa bằng chất hóa học. Phản ứng do chất hóa học sẽ gây nên sự oxy hóa Hematein tức khắc và quá trình oxy hóa cứ tiếp tục nên hình thành một hợp chất không màu, làm cho dung dịch nhuộm không lâu bền. Hematein bản thân ít ưa các tổ chức, vì vậy nên phải dùng một chất gắn màu thường là aluminium dưới thể alun (alun ammoniac, potassium hay sắt): chất sơn được hình thành có tích điện dương mạnh và như vậy giống như những phẩm nhuộm bazơ mạnh nên cố định trên các acid nucleic, đặc biệt acid nucleic của nhân. Các sự khác nhau về đặc tính nhuộm phụ thuộc vào cách pha chế dung dịch Hematoxylin và thành phần gắn màu. Bảng dưới đây nêu lên ái tính của Hematoxylin tùy theo chất gắn màu: Thành phần  Chất gắn màu (Kim loại)   Nhân Vỏ myelin Sợi chun Dây keo Sợi thần kinh đệm, sợi biểu mô Trục thần kinh Mucin Tơ huyết Mitochondri  Aluminium, sắt, tungsten Chromium, đồng, sắt Sắt, Iốt Molybden Tungsten Chì Aluminium Tungsten Sắt   Eosin: Thuốc nhuộm hay dùng để nhuộm bào tương là Eosin. Nó có đặc tính dễ tan trong nước và có màu huỳnh quang vàng - xanh lá cây nhạt. [2], [3]
Hình 3. Công thức của Eosin Với nguồn gốc và đặc tính đặc biệt như vậy nên kỹ thuật nhuộm Hematoxylin được tiến hành như sau: 1.3. Kỹ thuật cố định, pha, vùi bệnh phẩm, đúc bloc, cắt và dán mảnh, nhuộm tiêu bản H&E: 1.3.1. Kỹ thuật cố định Cố định là làm bất động những cấu trúc của tổ chức cũng như của tế bào nhưng vẫn tồn tại tới mức tối đa hình thái của chúng. Nói khác đi, cố định một tổ chức là giết chết những thành phần của tổ chức đó nhưng vẫn bảo quản chúng trong một tình trạng gần với lúc sống nhất. Trừ một số trường hợp cần nhuộm tươi hay cần nghiên cứu về men, nuôi cấy tế bào thì nói chung, mọi bệnh phẩm cần cố định ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể. Nếu như ta cố định bệnh phẩm không tốt thì sẽ làm giảm chất lượng xét nghiệm còn cố định hỏng thì không thể sửa chữa được. Bệnh phẩm sau khi lấy ra khỏi cơ thể sẽ gây ra thoái hóa, hoại tử giả tạo khi nhận định, các tế bào sẽ bị tiêu hủy bởi men nội bào, hình thái của chúng trở nên méo mó và sẽ sinh ra những hình ảnh giả tạo gây nhầm lẫn trong chuẩn đoán. Mặt khác, việc cố định chậm sẽ gây tiêu hủy các bào quan, không có lợi cho các nghiên cứu về men học đồng thời cũng không đảm bảo cho việc gắn màu tốt khi nhuộm. Một bệnh phẩm được cố định tốt phải đảm bảo những nguyên tắc sau: Mọi bệnh phẩm phải được cố định ngay sau khi lấy. Không được làm dập nát bệnh phẩm. Bệnh phẩm không cắt quá dày. Đủ lượng dung dịch cố định cần thiết. Thời gian cố định dung dịch thích hợp. Không để bệnh phẩm dính vào thành lọ. Chú ý những trường hợp cố định đặc biệt: Glycogen: cố định bằng dung dịch Grendre. Mỡ: cố định bằng dung dịch formol 10%, cắt lạnh và nhuộm Soudan. Một số dung dịch cố định thông dụng: Dung dịch formol đệm trung tính 10%: Formaldehyde 37% - 40% 100ml Nước cất 900ml Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) 4g Sodium phosphate dibasic anhydrous (NaH2PO4 khan) 6.5g Dung dịch formol 10%: Formandehyde 37% - 40% 100ml Nước cất hai lần 900ml Dung dịch cố định Bouin: Dung dịch nước bão hòa acid picic 75ml Formaldehyde 37% - 40% 20ml Acid acetic lạnh, nguyên chất 5ml Dung dịch Grende: Cồn 95% bão hòa acid picric 80ml Formandehyde 37% - 40% 15ml Acid acetic lạnh, nguyên chất 5ml 1.3.2. Pha Không được làm giập nát bệnh phẩm: khi pha không được dùng kẹp có mấu, lưỡi dao pha phải sắc, mỏng và dài, cắt một chiều không được ray đi ray lại trên một vị trí của bệnh phẩm và bệnh phẩm khi pha phải được đặt trên một miếng lie, gỗ hoặc plastic. Các mẫu bệnh phẩm dùng trong kỹ thuật mô học thường được cắt dày từ 3 - 5 mm. Với bệnh phẩm mềm (não,…) có thể cố định vài giờ cho cứng sau đó mới pha lại. Trong trường hợp chuyển đúc bằng máy, bệnh phẩm không được cắt dày hơn chiều cao của lòng khuôn nhựa. 1.3.3. Vùi bệnh phẩm Cấu trúc tế bào hoặc mô chỉ nhìn thấy được dưới kính hiển vi khi chúng được cắt thành những lát mỏng cỡ micromet để cho ánh sáng đi qua. Khi đó ta mới quan sát được chi tiết của tế bào, hình dạng hay cách sắp xếp của chúng. Cố định mới chỉ giết chết tế bào và giữ cho các thành phần của chúng được bất động ở trạng thái tĩnh. Nếu đem cắt ngay thành các lát cắt mỏng, mối liên quan giữa các tế bào cũng như cấu trúc mô bị biến đổi, thậm chí bị đảo lộn do tác động cơ học. Muốn vậy người ta phải tạo khuôn cho bệnh phẩm, nghĩa là phải làm cho một chất nào đó ngấm sâu vào tế bào hoặc mô mà khi cắt không làm biến dạng cấu trúc của chúng. Có nhiều chất được dùng cho phương pháp này nhưng chất hay được dùng hơn cả là parafin. Hiện có nhiều loại parafin với các điểm nóng chảy khác nhau nhưng loại thích hợp nhất dùng trong kỹ thuật mô học là parafin có nhiệt độ nóng chảy từ 56 - 58oC. Nếu dùng nhiệt độ nóng chảy của parafin cao hơn bắt buộc người ta phải chỉnh nhiệt độ của tủ parafin lên nữa, hậu quả làm cho bệnh phẩm chín, khó cắt và bắt mầu tồi. Ngoài ra, parafin còn được pha thêm một số chất phụ gia để làm tăng chất lượng của nó như: histoplas, paraplas… Song parafin không tan trong nước (bệnh phẩm lại có nhiều nước) và cồn nên bệnh phẩm phải được khử nước bằng cồn có nồng độ thấp (80o) đến cao (cồn tuyệt đối) rồi khử cồn bằng xylen. Tuy nhiên, với những máy chuyển bệnh phẩm vừa lắc, vừa ly tâm thì việc loại hết nước, cồn và xylen trong bệnh phẩm thường đạt kết quả tốt khi bệnh phẩm được chuyển qua từ 2 - 3 lần parafin. Việc tẩm parafin cho bệnh phẩm còn được đặt trong các bình hút chân không (có trong máy chuyển) càng làm cho parafin ngấm vào bệnh phẩm nhanh và tốt hơn. Do các cơ sở giải phẫu bệnh chưa có đủ máy chuyển nên chúng tôi giới thiệu cả hai quy trình vùi bệnh phẩm bằng tay và bằng máy chuyển: 1.3.4. Quy trình chuyển tay: Áp dụng cho các bệnh phẩm có chiều dày dưới 2 mm Cồn 90o - 15 phút Cồn 95o - 15 phút Cồn 100o I - 15 phút Cồn 100o II - 15 phút Cồn 100o III - 15 phút Xylen I - 15 phút Xylen II - 30 phút Xylen III - 30 phút Parafin I - 30 phút Parafin II - 1 giờ Parafin III - 1 giờ Áp dụng cho bệnh phẩm có chiều dày từ 5 mm đến dưới 8 mm Cồn 80o - 2 giờ Cồn 90o - 6 giờ Cồn 95o - 8 giờ Cồn 100o I - 4 giờ Cồn 100o II - 6 giờ Cồn 100o III - 8 giờ Xylen I - 4 giờ Xylen II - 8 giờ Xylen III - 10 giờ Parafin I - 4 giờ Parafin II - 6 giờ Parafin III - 10 giờ 1.3.5. Quy trình chuyển máy: Áp dụng cho các mảnh sinh thiết và các mảnh mô nhỏ Thời gian cố định tối thiểu là 3 giờ. Rửa nhẹ trong nước chảy. Cồn 80o - 10 phút. Cồn 95o x 3 lần x 15 - 20 phút Cồn 100o x 3 lần x 15 phút/ lần Cồn 100o/ xylen tỉ lệ 1:1 - 15 phút Xylen x 2 lần x 15 phút/ lần Parafin x 3 lần x 15 lần/ phút Parafin hút chân không từ 15 - 20 phút. Nếu không có hút chân không thì ở (7) tăng thêm mỗi lần 5 phút. Đúc bloc Áp dụng cho các mô thông thường Cồn 80o - 1 giờ Cồn 95o x 3 lần x 1 giờ/ lần Cồn 100o x 3 lần x 1 giờ/ lần Xylen x 3 lần x 1 giờ/ lần Parafin x 3 lần x 1 giờ/ lần Parafin hút chân không 1 giờ Đúc bloc 1.3.6. Đúc bloc Bệnh phẩm sau khi qua quá trình đúc bloc đạt yêu cầu thì có thể giữ vô thời hạn. Muốn đúc bloc phải làm cho parafin ở xung quanh cũng như ở bên trong bệnh phẩm đặc lại một cách thuần nhất. Để đạt được điều này, người ta dùng những khuôn bằng kim loại để trao đổi nhiệt diễn ra nhanh chóng và nước lạnh có đá. Đúc bệnh phẩm phải thao tác sao cho nhiệt độ của parafin và bệnh phẩm không chênh lệch nhiều. Nếu parafin hay bệnh phẩm nguội quá sẽ tạo ra một viền trắng xung quanh bệnh phẩm, khi bloc nguội hay cắt bệnh phẩm có thể bật bloc. Trên thực tế người ta đổ vào khuôn hay thanh chắn kim loại parafin lỏng đã lọc từ trước, nhúng ngay bệnh phẩm vào parafin đang lỏng này. Dùng kẹp hơ nóng để định hướng bệnh phẩm theo ý muốn (rất cần phải lưu ý khâu này, nếu đặt bệnh phẩm không đúng mặt thì sẽ không chuẩn đoán được). Người ta chọn mặt phẳng cắt là mặt đáy. Với các bệnh phẩm quá nhỏ, có thể dùng kính lúp để nhặt và đặt bệnh phẩm hoặc nhuộm bệnh phẩm với Eosin 1% cho dễ nhận. 1.3.7. Kỹ thuật cắt và dán mảnh Nếu bệnh phẩm đã được xử lý tốt ở các khâu: cố định, pha và vùi thì sẽ tạo điều kiện cho việc cắt mảnh được dễ dàng hơn. Trước khi cắt thì máy cắt cần được kiểm tra cả ốc vít và tra dầu bôi trơn. Nhiệt độ trong phòng cắt không quá 25oC và tốt hơn là cắt trong phòng có điều hòa. Nếu không có điều kiện thì bloc phải được ngâm và nước đá để đảm bảo đủ độ cứng mới cắt mảnh được. Độ nghiêng của lưỡi dao đặt và máy cắt thích hợp là 45o. Chất lượng của mảnh cắt còn phụ thuộc vào nhiệt độ dàn tiêu bản (nóng không quá 50oC). Như vậy một tiêu bản cắt được coi là đạt yêu cầu nếu: Mỏng đều. Không xước, gấp hoặc rách. Còn nguyên khuôn parafin quanh bệnh phẩm. Vị trí của mảnh cắt đặt ở 2/3 của lam từ dưới lên (1/3 của lam từ trên xuống để ghi mã số bệnh nhân, phía 2/3 dùng để dán nhãn sau khi nhuộm) lúc này bệnh phẩm nằm ở chính giữa lam kính. Sau khi cắt có nhiều chất dùng để dán mảnh cắt lên lam kính: albumin, silan, keo casein… trong đó dung dịch albumin 1 - 2% được dùng cho phương pháp nhuộm thông thường là phổ biến nhất. 1.3.8 Phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (H&E) 1.3.8.1 Thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm nhân hematoxylin: Hematoxylin là một loại thuốc nhuộm tự nhiên, nó được biết đến từ năm 1863. Bản thân Hematoxylin không có đặc tính nhuộm mà phải trải qua quá trình oxy hóa mất 2 nguyên tử hydro để trở thành Hematein. Pha dung dịch Hematoxylin nhanh: Cho phần A và phần B vào một bình chứa hơn 1 lít. Thêm 1 lít nước cất 2 lần hoặc nước đã được ion hóa. Không dùng nước máy. Lắc hoặc khuấy dung dịch vài phút cho đến khi tan hoàn toàn. Để yên ít nhất 1 giờ. Kết quả nhuộm tốt nhất sau 12 giờ. Lọc trước khi dùng. Có kết tủa và váng trên bề mặt là bình thường đối với thuốc nhuộm này. Thời gian nhuộm có thể thay đổi từ 4 - 8 phút. Nếu dùng để nhuộm tế bào có thể pha thành 1.5 - 2 lít. Thuốc nhuộm bào tương: Eosin Với Eosin bán cùng Hematoxylin được pha như sau: Một lọ Eosin hòa tan trong 1 lít nước cất 2 lần. Lắc cho tan hết. Lọc trước khi nhuộm. 1.3.8.2 Nguyên tắc: Đây là phương pháp nhuộm phối hợp thông dụng nhất bằng cách nhuộm kế tiếp một phẩm nhuộm nhân “bazơ” - hematin và một phẩm nhuộm bào tương “acid” - eosin. Việc nhuộm nhân được nhuộm “tăng dần”người ta dùng lại khi những cấu trúc của nhân rõ nét nhất. Ngược lại việc nhuộm bào tương“giảm dần” bằng cách nhuộm sẫm lên rồi loại phẩm thừa bằng cồn có nồng độ thấp. 1.3.8.3. Phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (Hematoxylin Instant). Tiêu bản tẩy nến 3 lần Xylen x 2 lần/ phút. Chuyển vào cồn 100o, cồn 90o, cồn 80o x 2 phút mỗi bể. Rửa nước chảy 5 phút. Nhuộm nhân trong dung dịch Hematoxylin nhanh từ 5 - 7 phút. Rửa nước chảy 5 phút. Biệt hóa trong cồn acid (acid HCL 0.5% trong cồn 70o) vài giây. Rửa nước chảy ít nhất 5 phút (kiểm tra dưới kính hiển vi xem nhân nhuộm đã được chưa. Nếu nhạt quá thì nhuộm thêm, ngược lại nếu sẫm quá thì tẩy tiếp trong cồn acid và rửa nước chảy tiếp 5 phút). Làm xanh bằng dung dịch lithi carbonat hoặc natri carbonat bão hòa. Rửa nước chảy 5 phút. Nhuộm bào tương trong Eosin từ 3 - 5 phút. Rửa qua nước. Loại phẩm thừa trong cồn 95o vài giây. Tẩy nước bằng cồn tuyệt đối. Làm trong bằng Xylen. Gắn lamelle bằng Baume Canada. 1.3.8.4. Kết quả: Nhân tế bào từ xanh - xanh đen Bào tương từ hồng đến đỏ. Hồng cầu màu đỏ. Ch­¬ng 2 ®èi t­îng vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu Đối tượng nghiên cứu Mẫu xét nghiệm: tiêu bản nhuộm H - E Mỗi cơ sở 200 – 500 tiêu bản. Xử lý các mẫu xét nghiệm Tất cả các tiêu bản đều đã được xử lý theo quy trình chung bao gồm: pha bệnh phẩm, cố định, chuyển, đúc, cắt mảnh, nhuộm H - E. Pha bệnh phẩm: được thực hiện tại phòng pha do Bác sĩ chuyên khoa thực hiện. Các mẫu được cố định lại, chuyển và đúc thành khối nến trên máy chuyển đúc Microm Khối nến được đúc trong cassette PVC tiêu chuẩn Cắt mảnh độ dày 3m, nhuộm và dán lamell để tạo thành tiêu bản hoàn thiện. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang có phân tích kết hợp hồi cứu. Nơi thực hiện đề tài Labo Bộ môn giải phẫu bệnh, 13 Lê Thánh Tông, Hoàn Kiếm, Hà Nội: Là nơi phát triển các kỹ năng và thành thạo một chuỗi quy trình chuyển, đúc, cắt, nhuộm từ bệnh phẩm ra những tiêu bản nhuộm HE Labo Giải phẫu bệnh viện Lao Phổi Trung Ương, 463 Hoàng Hoa Thám, Ba Đình, Hà Nội. Labo Giải phẫu bệnh Bệnh viện K2, Làng Tựu, xã Tam Hiệp, Thanh trì, Hà Nội. Labo Giải phẫu bệnh Bệnh viện 108, Số 1 Trần Hưng Đạo, Hai Bà Trưng, Hà Nội. Phương tiện nghiên cứu: Kính hiển vi quang học Quy trình nghiên cứu Làm thuần thục kỹ thuật tại bộ môn. Đến các cơ sở Quan sát, ghi chép Theo dõi quy trình kỹ thuật vi thể nhuộm H – E do kỹ thuật viên tại cơ sở tiến hành. Phát hiện các lỗi hay gặp ở các cơ sở Đối chiếu lỗi với quy trình làm để phát hiện ra lỗi xảy ra ở khâu nào. Đối chiếu tiêu bản có lỗi với tiêu bản cùng lô thực hiện để phát hiện nguyên nhân gây ra lỗi. Nhận định kết quả Các tiêu bản được nhận định trên kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại khác nhau: X10; X40 Chất lượng tiêu bản được đánh giá theo ba mức độ: Không đạt yêu cầu: không chẩn đoán được hoặc tiêu bản quá xấu do các lỗi như: mảnh cắt quá dày, rách nát hoặc nhăn nhúm, nhuộm quá đậm hoặc quá nhạt màu, nhân tế bào bị chợt, tế bào nát… Đạt yêu cầu: Có thể nhận định được kết quả mặc dù còn có một số lỗi kỹ thuật như: bị xước, nhăn, bẩn, có phần bị bong… nhưng vẫn còn nguyên vẹn cấu trúc và màu sắc rõ ràng tương phản. Tốt: Tiêu bản cắt mỏng đều, không gấp, không rách xước, màu của nhân và bào tương rõ nét, tương phản… CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Bảng kết quả STT  Cơ sở nghiên cứu  Chất lượng tiêu bản  Tổng  Ghi chú     Không đạt  Đạt  Tốt     1  Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện Lao phổi Trung Ương  9  146  57  212     Tỷ lệ %  4,2%  68,9%  26,9%     2  Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện K2  83  371  14  468     Tỷ lệ %  17,7%  79,3%  3%     3  Labo Giải phẫu bệnh của Bộ môn Giải phẫu bệnh.  3  164  81  248     Tỷ lệ %  1,2%  66,1%  32,7%     4  Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện 108  7  236  85  328     Tỷ lệ %  2,1%  72%  25,9%     3.2 Đánh giá kết quảvà một số hình ảnh minh họa Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện Lao phổi Trung Ương: - Các tiêu bản không đạt: 9/212, chiếm 4,2%; tiêu bản đạt: 146/212, chiếm 68,9%; tiêu bản tốt: 57/212, chiếm 26,9%. Đa số các tiêu bản không đạt có hiện tượng “Chợt nhân” (chiếm 3,3% tổng số tiêu bản) ngoài ra một số tiêu bản rách, nhăn nhúm, mất mô. - Đối chiếu với các mẫu tương tự, cùng lô xét nghiệm cho thấy lý do chính thuộc về lỗi cố định bệnh phẩm: Các phòng khoa đều được nhận hóa chất cố định. Tuy nhiên, do không chú ý hoặc(và) không để ý đến những ảnh hưởng của việc cố định bệnh phẩm đến chất lượng xét nghiệm giải phẫu bệnh nên để hóa chất quá lâu, bảo quản không tốt làm chất lượng hóa chất cố định bị giảm. Đối với bệnh phẩm lớn thường không cố định vẫn chuyển đến Labo xét nghiệm. Đối với bệnh phẩm sinh thiết, có trường hợp không dùng hóa chất cố định mà dùng nước muối sinh lý hoặc nước cất. Điều đó đã ảnh hưởng rất nhiều đến cấu trúc mô, tế bào bị nát, nhân bắt màu rất kém. - Các tiêu bản đạt: 146/212, chiếm 68,9 %. Phần lớn cắt tương đối mỏng, nhuộm màu đẹp, sự tương phản giữa nhân và bào tương rõ ràng. Tuy nhiên tiêu bản vẫn chưa thật đều và đôi chỗ bị xước, nhăn nhúm. Một số hình ảnh
Hình 3.2.1.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; chợt nhân
Hình 3.2.2.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; chợt nhân
Hình 3.2.3.Tiêu bản nhuôm H – E X 40; có nấm trên tiêu bản
Hình 3.2.4.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị bong
Hình 3.2.5.Tiêu bản nhiệm H – E X 40; tiêu bản bị cặn bẩn, đen Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện K2 - Tổng số tiêu bản không đạt là: 83/468, chiếm 17,7%; tiêu bản đạt: 371/468, chiếm 79,3%; tiêu bản tốt: 14/468, chiếm 3%. Đa số các tiêu bản không đạt đều do cắt dầy, không đều, xước rách nhiều, bắt màu đậm, tế bào có hiện tượng nát nhiều (chiếm 72% tổng số tiêu bản). - Đối chiếu với các mẫu tương tự, cùng lô xét nghiệm cho thấy lý do chính thuộc về lỗi tuân thủ các tiêu chuẩn trong xét nghiệm nhuôn tiêu bản H – E: Thời gian cố định bệnh phẩm không đảm bảo, phần lớn tại cơ sở là bệnh phẩm mổ, kích thước lớn, sau khi mổ xong không cố định ngay mà để rất lâu sau đó mới pha và cố định dẫn đến bệnh phẩm bị hoại tử, dùng bếp điện đun Parafin, đun đi đun lại nhiều lần làm parafin trở lên rất cứng dẫn đến khi cắt mảnh tế bào sẽ bị nát, thao tác đúc dùng thìa múc parafin, không chú ý áp sát mặt phẳng bệnh phẩm vào khuôn đúc làm bệnh phẩm sâu, lệch trong parafin dẫn đến khi cắt không lấy được mặt phẳng cần thiết, nhiều khi phá làm mất mô, cắt tiết kiệm dao nên nhiều khi dao bị mẻ gây xước mảnh cắt. - Các tiêu bản đạt yêu cầu: 371/468, chiếm 79,3%. Tuy nhiên, nhiều tiêu bản ở một số vùng nhỏ vẫn có hiện tượng xước, rách hoặc mất mô. Một số hình ảnh
Hình 3.2.6.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tế bào bị nát
Hình 3.2.7.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tế bào nát, chợt nhân
Hình 3.2.8.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; có nếp gấp
Hình 3.2.9.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị xước và bong Labo Giải phẫu bệnh Trường Đại Học Y Hà Nội: - Các tiêu bản không đạt là: 3/248, chiếm 1,2%; tiêu bản đạt: 164/248, chiếm 66,1%; tiêu bản tốt: 81/248, chiếm 32,7%. Đa số các tiêu bản không đạt thuộc về các lỗi như: mảnh cắt dày, xước, mảnh cắt bị bong, mất mô, tiêu bản còn cặn bẩn, cấu trúc mô bị giãn, không có sự tương phản rõ nhân bào tương nhưng vẫn nhận được cấu trúc mô và một số các tổn thương. - Đối chiếu với các mẫu cùng lô xét nghiệm cho thấy lý do chính thuộc về lỗi thao tác kỹ thuật: cắt dày, cắt vào những vùng dao bị mẻ gây xước, đặt bàn hơ lâu gây giãn. Có những mẫu do khâu cố định kém từ tại cơ sở làm thủ thuật, mổ dẫn đến ở Labo dù kỹ thuật rất tốt nhưng tiêu bản vẫn bắt màu kém và cấu trúc mô không rõ ràng. - Các tiêu bản đạt là: 164/248; chiếm 66,1%. Đại đa số các tiêu bản đạt yêu cầu đều thấy rõ nhân màu xanh – đen, tương phản khá rõ nét trên nền bào tương màu hồng đỏ, cấu trúc mô cũng như các tổn thương đều nhận rõ. Tuy nhiên, vẫn có những tiêu bản có một số vị trí bị nhăn, xước. Một số hình ảnh
Hình 3.2.10.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị nhăn
Hình 3.2.11.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị gấp, bong
Hình 3.2.12.Tiêu bản H – E X 40; tiêu bản cắt thiếu mô
Hình 3.2.13.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị xước Labo Xét nghiệm Giải phẫu Bệnh – Bệnh viện 108: - Các tiêu bản không đạt: 7/328, chiếm 2,1%; tiêu bản đạt: 236/328, chiếm 72%; tiêu bản tốt: 85/328, chiếm 25,9%. Phần lớn các tiêu bản không đạt thuộc về các lỗi như: mảnh cắt dày, xước, không có sự tương phản rõ nhân bào tương nhưng vẫn nhận được cấu trúc mô và một số các tổn thương. - Đối chiếu với các tiêu bản cùng lô xét nghiệm cho thấy lý do chính thuộc về lỗi thao tác kỹ thuật, cắt tiết kiệm dao. Một số trường hợp có hiện tượng bong do dán không dùng Albumin. - Các tiêu bản đạt: 236/328, chiếm 72%. Phần lớn cắt tương đối mỏng, nhuộm màu đẹp, sự tương phản giữa nhân và bào tương rõ ràng, tuy vẫn chưa thật đều và vẫn có đôi chỗ bị xước, nhăn nhúm. Một số hình ảnh
Hình 3.2.14.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị xước
Hình 3.2.15.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị bong, gấp
Hình 3.2.16.Tiêu bản nhuộm H – E X 40; tiêu bản bị xước, rách, gấp, bong Ch­¬ng 4 Bµn luËn Sự liên quan mật thiết trong một chuỗi kỹ thuật liên hoàn từ việc lấy bệnh phẩm, pha bệnh phẩm, cố định, chuyển, đúc đến cắt mảnh và nhuộm HE để ra một tiêu bản mô bệnh học Lấy bệnh phẩm Các bệnh phẩm làm xét nghiệm mô bệnh học bao gồm nhiều loại, từ các bệnh phẩm lớn như bệnh phẩm sau mổ, bệnh phẩm tử thiết, bệnh phẩm sinh thiết bằng phẫu thuật hay tiểu phẫu đến các bệnh phẩm nhỏ hơn như sinh thiết bằng kim sinh thiết, các sinh thiết bấm qua nội soi…Các bệnh phẩm lớn thường được pha bởi các bác sĩ giải phẫu bệnh học, số còn lại đều được lấy bởi các bác sĩ thuộc nhiều chuyên khoa như tiêu hóa (sinh thiết dạ dày, đại trực tràng, sinh thiết gan…); hô hấp (sinh thiết phổi chọc kim xuyên thành ngực); sản – phụ (chất nạo tử cung)…