Đề tài Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật

kị nước liên kết với lõi lipid. Trong quá trình này, màng uốn cong vào trong để tạo thành lỗ với đầu ưa nước đối mặt với trung tâm của lỗ. Mô hình “thùng-ván thùng” (Hình 3C), Peptide kháng khuẩn chèn vuông góc với bề mặt màng hình thành “ván thùng” trong “thùng” – có hình bó, với vùng ưa nước của Peptide kháng khuẩn lót bên trong thành lỗ và vùng kị nước tương tác với lớp kép lipid. Trái ngược với cơ chế “thùng-ván thùng” và cơ chế lỗ hình xuyến, mô hình thảm đề xuất rằng tập hợp các peptide kháng khuẩn gắn song song với lớp kép lipit, phủ ngoài giống như tấm thảm [43]. (Hình 3D). Ở nồng độ đủ cao, nó hoạt động như chất tẩy rửa, gây ra những bất ổn trên màng dẫn đến hình thành các lỗ trên màng. Tất cả các peptide kháng khuẩn đều phải tương tác với màng tế bào, một số peptide không gây tổn thương màng tế bào nhưng vẫn giết chết vi khuẩn thông qua ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic, tổng hợp protein, thành tế bào và hoạt động enzyme (Hình 3) [26]. Hình 3. Cơ chế hoạt động của peptide kháng khuẩn Màng vi khuẩn là lớp kép lipid vàng với peptide là các hình trụ, vùng ưa nước màu đỏ và vùng kị nước màu xanh. Cơ chế giải thích quá trình tương tác của peptide kháng khuẩn với màng tế bào vi khuẩn: (A) mô hình “tập hợp”; (B) mô hình “lỗ hình xuyến”; (C) mô hình “thùng-ván thùng” và (D) mô hình “thảm”. Cơ chế hoạt động của peptide không phá hủy màng: (E) ngăn cản quá trình tổng hợp mRNA; (F) ngăn cản quá trình tổng hợp protein; (G), (H): tác động vào hoạt động của enzyme; (I): ngăn cản quá trình hình thành các thành phần cấu trúc tế bào ví dụ như thành tế bào. Peptide kháng khuẩn buforin II ở ếch di chuyển qua màng vi khuẩn và gắn vào cả DNA và RNA trong tế bào chất vi khuẩn E.coli [26]. Tương tự peptide xoắn a như pleurocidin – một peptide kháng khuẩn có nguồn gốc từ cá, và dermaseptin từ da ếch gây ức chế tổng hợp DNA và RNA mà không gây mất ổn định màng tế bào E.coli (Hình 3E). Ức chế tổng hợp axit nucleic cũng được chứng minh ở các nhóm Peptide kháng khuẩn khác như defesin (cấu trúc gấp b) ở người, và indolicidin (cấu trúc mở rộng) ở bò [52]. Hơn nữa, một số eptide kháng khuẩn can thiệp vào quá trình tổng hợp protein (Hình 3F). Hoạt tính ức chế hoạt động của enzyme: pyrhocidin đi vào tế bào đích, liên kết với DNAK – một protein liên quan đến quá trình gấp protein. Cụ thể, peptide ức chế hoạt động ATPase của DNAK, ngăn chặn cuộn gấp protein dẫn đến tích tụ protein không biến đổi và tế bào chết (Hình 3G) [29], [42]. Peptide kháng khuẩn cũng ngăn cản quá trình hình thành các thành phần của tế bào như thành peptidoglycan (Hình 3I). Vi khuẩn tổng hợp nên các lantibiotic mersacidin ngăn cản quá trình chuyển glycoside của lipid II, bước cần thiết trong tổng hợp peptidoglycan [26]. Nisin, một lantibiotic khác, cũng liên kết với lipid II do đó ức chế tổng hợp thành tế bào. Ngăn cản tổng hợp peptidoglican cũng là đích tác động của vancomycin, nhưng nisin tương tác với các phân tử riêng biệt trong lipid II do đó chúng vẫn hoạt động chống lại vi khuẩn kháng vancomycin [15], [31]. Cơ chế hoạt động của từng peptide kháng khuẩn khác nhau tùy thuộc vào tế bào đích, nồng độ và tính chất vật lý của màng tương tác. Cũng có khả năng, trong trường hợp nhiễm trùng, peptide kháng khuẩn có thể sử dụng nhiều cơ chế ví dụ như gây bất ổn màng kết hợp với ức chế các quá trình bên trong tế bào. Tính phức tạp của cơ chế này cùng với tác động đa đích chính là nguyên nhân chủ yếu cho việc rất khó khăn để tạo đột biến kháng lại các peptide kháng khuẩn [26]. Peptide kháng khuẩn còn được chứng minh là có một số chức năng điều hòa miễn dịch, có thể tham gia vào việc khắc phục nhiễm trùng. Chẳng hạn hepcidine ở người có khả năng thay đổi biểu hiện gen của vật chủ, nó hoạt động như các chemokine và kích thích sản xuất chemokine, ức chế cảm ứng lipopolysaccharide để sản xuất cytokine gây viêm, do đó đẩy mạnh chữa lành vết thương và điều chỉnh các phản ứng của tế bào đáp ứng miễn dịch thích ứng. 1.2.4.2. Sự tác động chọn lọc của peptide kháng khuẩn Các peptide kháng khuẩn luôn ưu tiên tương tác với vi khuẩn hơn với tế bào động vật, nhờ đó chúng tiêu diệt các vi sinh vật mà không gây độc đáng kể đến tế bào chủ. Có nhiều yếu tố liên quan chặt chẽ đến tác động chọn lọc này, trong đó điện tích màng đóng góp nhiều nhất [21], [35]. Màng tế bào vi khuẩn rất giàu axit photpholipit, như photpho atidylglyceron và caridolipin, do đó nó tích điện âm và có ái lực mạnh với các điện tích dương của các peptide kháng khuẩn. Sự tương tác này chủ yếu là lực tương tác tĩnh điện [35]. Ngược lại, phần bên ngoài của màng tế bào động vật có vú bao gồm chủ yếu là các chất béo có đầu tích điện âm ẩn sâu vào bên trong lớp màng sinh chất [21]. Mặt khác, bề mặt ngoài màng được cấu tạo từ photpholipit trung tính, vì vậy sự tương tác kị nước giữa lớp này với mặt kị nước của các peptide kháng khuẩn đóng vai trò quan trọng trong sự kết hợp giữa peptide kháng khuẩn với màng tế bào. Tuy nhiên sự tương tác đó tương đối yếu so với tương tác tĩnh điện, do vậy các peptide kháng khuẩn sẽ ưu tiên tương tác với màng vi khuẩn (Hình 4) [54]. Hình 4. Cơ sở của chọn lọc phân tử tế bào của peptide kháng khuẩn [54] . Ngoài ra, cholesterol thường phân bố rộng ở màng tế bào động vật giúp màng ổn định, nhưng không có ở màng vi khuẩn. Sự có mặt của cholesterol cũng làm giảm hoạt động của các peptide kháng khuẩn [59]. Bên cạnh đó, khả năng bị các nhân tố lạ xuyên màng của tế bào vi khuẩn là dễ dàng hơn nhiều so với tế bào động vật bình thường, nên màng vi khuẩn dễ bị tấn công bởi các peptide kháng khuẩn tích điện dương [35]. Tương tự như vậy, tế bào động vật có khả năng điều hòa nồng độ ion làm giảm hoạt động của hầu hết các peptide kháng khuẩn trong khi vi khuẩn không có khả năng đó [59]. 1.2.5. Ứng dụng của peptide kháng khuẩn Các peptide kháng khuẩn có khả năng tiêu diệt vi khuẩn, nhưng hầu như không độc với tế bào động vật, nhờ đó có thể sử dụng trong liệu pháp chữa trị. Nhờ hoạt động kháng khuẩn cũng như hoạt động miễn dịch hiệu quả cao, các peptide kháng khuẩn được coi như nguồn “kháng sinh tự nhiên” của sinh giới cần được khai thác trong bối cảnh nguồn thuốc kháng sinh tự nhiên đang dần cạn kiệt [44]. Ngoài ra, gen mã cho peptide kháng khuẩn còn được ứng dụng như một nguồn nguyên liệu quan trọng để tạo nên các sinh vật chuyển gen có khả năng kháng lại mầm bệnh. Việc sử dụng thuốc trừ sâu và các tác nhân kháng khuẩn không còn là biện pháp tốt do giá thành cao và ảnh hưởng xấu tới môi trường cũng như sức khỏe con người. Việc tạo ra các giống cây trồng, vật nuôi chuyển gen kháng khuẩn phần nào sẽ giúp giải quyết được những vấn đề trên. Thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử, các nhà khoa học hy vọng rằng sẽ có thể cải biến các peptide kháng khuẩn thành những dạng mới có tính bền vững trong môi trường có nồng độ muối cao [12], [13]. 1.2.6. Peptide kháng khuẩn cecropin B Cecropin là một họ của peptide kháng khuẩn, được phân lập từ giai đoạn nhộng của loài sâu bướm khổng lồ Hylaphora cecropia trong nghiên cứu của Boman và cộng sự năm 1981 [13]. Cecropin dạng trưởng thành gồm 35-37 axit amin, tích điện dương và tác động lên cả vi khuẩn G(-) và G(+) [9]. Họ cecropin bao gồm ba nhóm chính là cecropin A, B, D [11]. Cecropin A là một peptide kháng khuẩn dạng thẳng, chứa 37 axit amin, có cấu trúc chủ yếu là xoắn a và gấp nếp b. Cecropin A tiêu diệt vi khuẩn chủ yếu bằng cách phá hủy màng tế bào, trục dọc của cấu trúc a và trục ngang của cấu trúc b định hướng song song với bề mặt màng, từ đó xâm nhập và phá vỡ màng tế bào vi khuẩn [48], [49]. Cecropin B là một peptide kháng khuẩn nhỏ gồm 35 axit amin, kháng lại cả vi khuẩn G(-) và G(+). Cấu trúc thứ cấp của cecropin B bao gồm một chuỗi xoắn tận cùng amino lưỡng tính liên kết với một chuỗi xoắn lớn tận cùng cacboxyl kị nước bởi vùng khớp nối [16]. Cecropin D chứa 36 axit amin và kỵ nước hơn so với cecropin A và B, nó xuất hiện sau cecropin A và B khi cơ thể bị nhiễm khuẩn. Cecropin D chống lại cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương, đặc biệt là Bacillus megaterium [47]. Hoạt tính của cecropin chủ yếu do cấu trúc của hai vùng NH2 và COOH quy định. Thay đổi cấu trúc của một trong hai vùng này có thể làm thay đổi đáng kể phổ hoạt động. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy cecropin được dùng như chỉ thị phân tử để phân biệt các loài vi khuẩn khác nhau [32]. Bên cạnh việc sử dụng trực tiếp như các chất có hoạt tính kháng khuẩn, cecropin biểu hiện trong một số động thực vật chuyển gen làm tăng khả năng chống chịu với vi sinh vật gây bệnh. Hoạt tính kháng khuẩn của chúng đối với vi khuẩn G(-) thường hiệu quả hơn so với vi khuẩn G(+). Một số loại cecropin còn có khả năng gây ảnh hưởng tới chu kì nhiễm bệnh của virus HIV bằng cách ức chế biểu hiện các gen của HIV–1, qua đó cản trở quá trình nhân lên của virus này [10]. Cecropin làm giảm số lượng tế bào vi khuẩn thông qua việc phân hủy màng tế bào chất. Chúng cũng phân hủy liposome tích điện âm và trung hòa điện nhưng không phân hủy liposome dương cũng như tế bào hồng cầu [56]. Hoạt tính kháng ung thư của cecropin đã được công bố từ những nghiên cứu của các nhà khoa học trường đại học Bradford (Hoa Kì) năm 1994. Những thử nghiệm in vitro cho thấy cecropin B có hoạt tính làm tan bào đối với các dòng tế bào ung thư vú và buồng trứng ở người. Kết quả nghiên cứu trong điều kiện in vivo cho thấy cecropin B giúp kéo dài thời gian sống sót của những con chuột bị ung thư cổ trướng ác tính. Báo cáo mới nhất năm 2008 được công bố cho thấy cecropin B có khả năng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư bàng quang, phá hủy cấu trúc màng tế bào và gây chết đối với các tế bào ung thư [22], [38]. 1.3. CHUYỂN GEN CECROPIN B VÀO TẾ BÀO VÀ CƠ THỂ ĐỘNG VẬT 1.3.1. Khái quát về kỹ thuật chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen khởi đầu được dùng để nghiên cứu các cơ chế phân tử của việc biểu hiện và điều hòa gen trong những nghiên cứu của Vaheri và Pagano năm 1965. Các tác giả này đã chuyển các phân tử ADN trần vào tế bào với mong muốn tìm hiểu ảnh hưởng của đoạn chuyển vào lên tế bào. Từ cột mốc này, các nhà khoa học đã phát triển nhiều hệ thống chuyển gen có hiệu quả. Chức năng của nhiều đoạn gen lần lượt được giải đáp nhờ kỹ thuật chuyển gen. Thêm vào đó, các vấn đề về điều hòa chức năng gen, điều hòa phiên mã và dịch mã, sự biểu hiện và vai trò các protein trong tế bào ngày càng được sáng tỏ. Sự ra đời và phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp đã tạo ra các vector biểu hiện cả trong tế bào nhân sơ và nhân chuẩn (vector con thoi). Nhờ đó, các vector được nhân dòng trong nhân sơ và biểu hiện ở nhiều loại tế bào nhân chuẩn khác nhau [5, 6]. Gần đây, kỹ thuật chuyển gen đã được ứng dụng trong liệu pháp gen chữa trị các bệnh di truyền, ung thư và các bệnh liên quan đến virus. Động vật chuyển gen là những sinh vật được thay đổi vật liệu di truyền một cách có chủ ý bằng công nghệ sinh học hiện đại. DNA ngoại lai được đưa vào động vật sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp, sau đó chúng đi vào dòng mầm và tạo ra cơ thể có nguyên liệu di truyền bị biến đổi. Khi di truyền học phân tử còn chưa phát triển, cách duy nhất để nghiên cứu hoạt động, chức năng của gen là thông qua việc quan sát các đặc điểm di truyền hoặc những đột biến biểu hiện thành kiểu hình. Những hiểu biết về sinh học phát triển và kỹ thuật di truyền cho phép nhanh chóng phát triển các phương pháp tạo động vật chuyển gen. Vi tiêm DNA ngoại lai là kỹ thuật tạo động vật chuyển gen đầu tiên đã được chứng minh thành công ở động vật có vú, được áp dụng ở chuột [19] và sau đó đến thỏ, cừu, lợn, chim và cá [55]. Hai kỹ thuật sau đó được phát triển là chuyển gen qua tinh trùng [33] và chuyển gen thông qua tế bào gốc [20]. Từ năm 1981, khi động vật chuyển gen đầu tiên được tạo ra [19], công nghệ tạo động vật chuyển gen và ứng dụng của nó ngày càng được phát triển rộng rãi. Chuyển gen ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và trong công nghiệp với các mục đích khác nhau. Nhờ công nghệ chuyển gen mà các nhà khoa học đã tạo ra những gia súc có năng suất và chất lượng cao. Ứng dụng quan trọng đối với vật nuôi chuyển gen là sản xuất protein dược liệu trong sữa. Gia cầm chuyển gen cung cấp trứng mang các protein tái tổ hợp. Chúng đang là niềm hy vọng cho con người trong công nghệ dược phẩm và thực phẩm. Công nghệ chuyển gen ở cá tạo nên những vật nuôi tăng trưởng nhanh, chống chịu tốt hoặc sử dụng trong việc xác định chất lượng môi trường nước [5], [8]. 1.3.2. Những ứng dụng chuyển gen cecropin Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen Cecropin B vào thực vật cũng như động vật để tạo ra cơ thể chuyển gen với đặc tính kháng khuẩn. Bệnh do vi khuẩn gây nên đã gây thiệt hại lớn trong nông nghiệp, đặc biệt là ở một số loại cây trồng quan trọng như lúa, rau và trái cây. Các nhà khoa học trên thế giới đã và đang cố gắng chuyển gen cecropin vào các cây trồng này để kiểm soát các tác nhân gây bệnh cây trồng [40]. Gen cecropin đã được chuyển vào cây lúa để kiểm soát bệnh bạc lá ở cây lúa. Ở cây thuốc lá, gen cecropin được chuyển vào để kháng vi khuẩn Pseudomonas syringane pv. tabaci gây bệnh đốm lá. Đối với động vật, nghiên cứu chuyển gen cecropin đã được tiến hành trên một số đối tượng. Trong đó đạt được nhiều thành tựu đáng kể nhất là nghiên cứu chuyển gen cecropin ở một số loài cá. Đặc biệt ở cá ngựa vằn, gen cecropin B được chuyển vào đã tăng khả năng đề kháng với các bệnh do vi khuẩn gây nên [46]. 1.4. GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN BÀO SỢI CHUỘT ĐƯỢC DÙNG ĐỂ CHUYỂN GEN CECROPIN B 1.4.1. Nguồn gốc và đặc điểm nguyên bào sợi Ở giai đoạn phát triển phôi sớm, các tế bào gốc trung mô tách ra khỏi trung bì, phân bố rộng rãi ở ngoại bì và nội bì và biệt hóa thành các dạng tế bào của mô liên kết trong đó có nguyên bào sợi [57]. Nguyên bào sợi có tế bào chất phân nhánh bao quanh một nhân hình elip gồm một hoặc hai hạch nhân. Nguyên bào sợi hoạt động có mạng lưới nội chất có hạt hoạt động mạnh (Hình 5). Trong khi đó, các nguyên bào không hoạt động có kích thước nhỏ so với nguyên bào sợi hoạt động [57]. Hình 5. Cấu trúc của nguyên bào sợi hoạt động [57] Hình thái nguyên bào sợi thay đổi tùy theo vị trí và hoạt động của chúng. Trong một số điều kiện thích hợp, các tế bào biểu mô có thể trở thành các nguyên bào sợi, gọi là sự chuyển trạng thái biểu mô–trung mô. Ngược lại, trong một số trường hợp, nguyên bào sợi có thể chuyển thành tế bào biểu mô gọi là sự chuyển trạng thái trung mô – biểu mô. Quá trình này được phát hiện trong nhiều giai đoạn phát triển phôi như trong sự phát triển tế bào thần kinh [57]. Trong cơ thể, nguyên bào sợi có chức năng tổng hợp collagen, sợi lưới elastin, laminin, decorin, fibronectin, glycosaminoglycan và glycoprotein của chất nền ngoại bào. Chúng tổng hợp các protein đệm tạo nên sự bền vững và toàn vẹn của mô khi vết thương đã liền. Ðồng thời nguyên bào sợi là nguồn cung cấp quan trọng một số yếu tố tăng trưởng kích thích liền vết thương như TGF–β (Transforming Growth Factor–β), PDGF (Platelet–Derived Growth Factor), KGF (Keratinocyte growth factor) [23]. 1.4.2. Ứng dụng của nguyên bào sợi nuôi cấy Nguyên bào sợi có vai trò quan trọng trong sự hình thành và tồn tại của mô liên kết, hỗ trợ sự phát triển của các loại tế bào khác và tham gia vào quá trình hàn gắn vết thương. Do vậy, tế bào này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu. Trong nghiên cứu cơ bản, nguyên bào sợi là loại tế bào dễ phân lập và nuôi cấy. Chúng được sử dụng để nghiên cứu chức năng của gen, sự điều hòa biểu hiện gen, đột biến, tìm hiểu vai trò các phân tử trong các con đường hóa sinh Khi nuôi cấy in vitro, nguyên bào sợi vẫn giữ khả năng tiết ra các nhân tố sinh trưởng, đồng thời có độ bám dính tốt nên nguyên bào sợi nguyên phát được sử dụng làm lớp tế bào nuôi trong nuôi cấy tế bào gốc. Trong những năm gần đây, nguyên bào sợi là loại tế bào được sử dụng trong nhân bản vô tính và trong giải biệt hóa tế bào. Nguyên bào sợi “bất tử” có sự đồng nhất về hình thái và tính chất, tăng sinh mạnh mà không gặp phải giới hạn về già hóa nên được ứng dụng trong nghiên cứu thử nghiệm chuyển gen [28]. Trong nghiên cứu ứng dụng, với vai trò to lớn trong quá trình hàn gắn vết thương, các nguyên bào sợi được ứng dụng để cấy ghép tự thân cho các bệnh nhân bị tổn thương về da như bỏng, viêm loét do bệnh đái tháo đường. Các nguyên bào sợi và các tế bào sừng thu nhận từ mẫu da sinh thiết của bệnh nhân được nuôi cấy in vitro, sau đó chúng được cấy ghép trở lại cho người bệnh. Điều này sẽ tránh khỏi những vấn đề về thải loại miễn dịch [27], [53]. 1.5. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT GÂY BỆNH * Escherichia coli: Trực khuẩn, G(-), phát triển tốt ở 300C, sống ở đường ruột của động vật máu nóng. Đa số chúng vô hại, sống ký sinh trong ruột người khỏe mạnh có vai trò trong việc tiêu hóa thức ăn, sản xuất vitamin K và B. Một số chủng sinh độc tố mạnh gây ra các bệnh như: viêm màng phổi, viềm màng não, tiêu chảy, viêm bang quang, gây ngộ độc thực phẩm... E. coli có thể kháng lại nhiều loại thuốc kháng sinh, vì vậy khi điều trị các bệnh do E. coli cần lựa chọn các kháng sinh thích hợp với từng loại bệnh do chúng gây ra. * Shigella flexneri: Trực khuẩn, G(-), kỵ khí tùy tiện, không có khả năng di chuyển, không tạo bào tử, thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột, gây bệnh ở người và linh trưởng. S.flexneri xâm nhập vào hệ tiêu hóa và gây bệnh lỵ, bệnh viêm dạ dày và viêm ruột cấp. Một số chủng tiết ra độc tố. Đây là loại có sức chịu đựng kém, chúng nhạy cảm với môi trường khô lạnh nhưng lại có sức đề kháng tốt với môi trường muối mật. * Salmonella typhi: Trực khuẩn có hình que ngắn, hai đầu tròn, G(-), hiếu khí không bắt buộc, có khả năng di động, thuộc họ Enterbacteriacea. Chúng phát triển tốt ở 37oC, lên men và sinh hơi glucose, maint, sorbitol, không lên men lactose, saccarose. Chúng gây bệnh thương hàn, ngộ độc thức ăn. * Klebsiella. sp: Trực khuẩn, G(-), không di động, hiếu khí tùy tiện, gây bệnh viêm phổi ở người. Một số vi khuẩn loại này có thể sinh ngoại độc tố gây độc cho phổi. Ngoại độc tố này cấu tạo bởi 65% polysaccharide, 30% liposaccharide và 5% lipid. * Bacillus subtilis: Là vi khuẩn G(+), sinh bào tử, hiếu khí. Là vi khuẩn gặp phổ biến trong môi trường đất, thường không gây bệnh cho người. Đôi khi chúng sinh ra ngoại độc tố subtilisin gây độc cho thức ăn. Mặc dù subtilisin có độc tính thấp nhưng trong thành phần protein của nó có khả năng gây dị ứng đối với những người tiếp xúc trong thời gian dài gây những bệnh như viêm da, viêm đường hô hấp. * Vibrio cholerae: Vi khuẩn hình que hơi cong, G(-), hiếu khí, không sinh bào tử, có một roi ở đầu và có khả năng di động rất mạnh. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của chúng ở 37oC. Chúng phát triển tốt trong môi trường kiềm (pH 8.5 – 9.5), dễ bị tiêu diệt trong môi trường acid, có khả năng chịu muối cao. Chúng gây tiêu chảy và là nguyên nhân gây bệnh dịch tả. * Moraxella catarrhalis: là vi khuẩn G(-), hiếu khí. Chúng được biết đến với việc gây ra viêm tai giữa, viêm phế quản, viêm xoang và viêm thanh quản. M. catarrhalis có thể được điều trị bằng thuốc kháng sinh, nhưng nó thường đề kháng với penicilline, ampicillin và amoxyclline. Chương II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Chủng giống Các chủng vi sinh vật dùng để thử nghiệm được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh vật (P109 T2), Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Gồm có các chủng vi khuẩn: Escherichia coli Shigella flexneri Salmonella typhi Klebsiella. sp Bacillus subtilis Vibrio cholerae Moraxella catarrhalis 2.1.2. Hóa chất và dụng cụ 2.1.2.1. Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong đề tài được liệt kê ở Error! Not a valid bookmark self-reference. Bảng 1: Các hóa chất được sử dụng trong đề tài Tên hóa chất Hãng sản xuất Nước sản xuất Ampicillin Sigma Mỹ Puromycin Sigma Mỹ Trypsin Sigma Mỹ Phosphate buffered saline (PBS) Gibco Mỹ Fetal bovine serum (FBS) Gibco Mỹ Opti–MEM® Gibco Mỹ Agarose Sigma Mỹ Cao nấm men Bio–rad Mỹ Peptide cecropin B Sigma Mỹ 2.1.2.2. Môi trường và dung dịch + Môi trường LB: Tryptone: 10 gram Cao nấm men: 5 gram NaCl: 10 gram H2O: 1 lít PH: 7.0 + Môi trường thạch thường: Nước mắm: 20 ml Pepton: 5 gram Agar: 16 gram H2O: 1 lít pH: 6.8 – 7.0 + Môi trường nuôi nguyên bào sợi chuột chuyển gen cecropin B: OptiMEM 5% FBS (v/v) 2.1.2.3. Dụng cụ và vật tư Dụng cụ và vật tư cần thiết để làm các thí nghiệm trong đề tài được liệt kê ở Bảng 2. Bảng 2: Dụng cụ và vật tư tiêu hao được sử dụng trong đề tài Tên dụng cụ Hãng sản xuất Nước sản xuất Ống Falcon 15, 50ml Corning Mỹ Pipet thủy tinh 2, 5, 10ml Trung Quốc Giấy paraffin Mỹ Đĩa petri thủy tinh Trung Quốc Ống eppendorf Corning Mỹ Buồng đếm hồng cầu Thomas Đức Đầu tip 10, 200, 1000µl Corning Mỹ Chai nuôi tế bào T25 Corning Mỹ Bình nón Mỹ Pipet điện Brand Đức Chai thủy tinh 50, 100, 250, 1000ml Schott Đức Micropipet 10, 100, 200, 1000µl Gilson Pháp Đèn cồn, bình tam giác Trung Quốc Bông, giấy thấm Việt Nam 2.1.2.4. Thiết bị Các thiết bị nghiên cứu cần thiết cho đề tài được liệt kê ở Bảng 3. Bảng 3: Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất Kính hiển vi soi ngược Carl Zeiss Đức Buồng cấy vô trùng Microflow Anh Tủ nuôi cấy tế bào động vật Sanyo Nhật Bản Tủ ấm nuôi vi khuẩn Mỹ Tủ lạnh Revco Mỹ Tủ sấy Binder Đức Máy ly tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen Đức Máy lắc vi khuẩn Sartorius Mỹ Tủ ấm CO2 Sanyo Nhật Bản Nồi khử trùng Vietronics Việt Nam Lò vi sóng Panasonic Nhật Bản 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và cấy chuyển nguyên bào sợi chuột Quy trình thí nghiệm được tóm tắt ở sơ đồ sau: Chuột mang thai 12 – 14 ngày Phân lập nguyên bào sợi Chuyển gen cecropin B vào nguyên bào sợi Nuôi nguyên bào sợi chuyển gen Thay môi trường Bổ sung môi trường mới, cấy chuyển Thu môi trường cũ để thử nghiệm HTKK Nguyên bào sợi phân lập từ thai chuột được nuôi trong chai nuôi cấy T25 có môi trường nuôi cấy thích hợp với nguyên bào sợi. Mật độ tế bào ban đầu khoảng 4x103 tế bào/cm2. Chai nuôi được để trong vào tủ ấm 370 C, độ ẩm 95% và 5% CO2. Các tế bào tăng sinh và đạt mật độ trên 90% bề mặt chai cần phải được cấy chuyển sang chai mới. Các bước được tiến hành như sau: Loại bỏ môi trường nuôi cấy, rửa tế bào 3 lần bằng dung dịch PBS. Đưa 0,5 ml dung dịch trypsin/EDTA vào chai nuôi cấy và để ở 370C. Khi tế bào tách hoàn toàn khỏi bề mặt chai, bất hoạt trypsin bằng 2,5 ml môi trường nuôi cấy có FBS. Thu dung dịch có chứa tế bào và chia đề vào 3 chai nuôi cấy mới. Thêm 2ml môi trường vào mỗi chai. Nuôi cấy ở 370C và 5% CO2 và thay môi trường sau 24 giờ. 2.2.2. Phương pháp thu môi trường nuôi nguyên bào sợi chuột đã được chuyển gen cecropin B: Nguyên bào sợi được phân lập từ thai chuột và nuôi cấy in vitro. Sau khi chuyển nhiễm vector pT2/BH–CVpf–SB11 mang gen cecropin B, nguyên bào sợi này sẽ được nuôi trong chai nuôi cấy tế bào T25 với môi trường nuôi nguyên bào sợi. Sau 5 ngày, 13 ngày và 21 ngày sẽ tiến hành thu môi trường nuôi cấy để kiểm tra hoạt tính của cecropin có trong môi trường. Sau 5 ngày nuôi cấy, tiến hành thay môi trường lần 1. Dùng pipetman hút 2,5 ml môi trường từ chai nuôi cấy ra. Bổ sung 2,5 ml môi trường mới vào chai nuôi cấy. Môi trường cũ vừa được hút ra từ chai nuôi cấy được thu vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, quấn paraffin rồi cất giữ ở 2 – 8oC. Môi trường thu nhận làn này ký hiệu là môi trường nuôi cấy F1. Sau 13 ngày, tiến hành thay môi trường lần 2. Phương pháp làm tương tự như thay môi trường lần 1. Môi trường thu nhận lần này ký hiệu là môi trường nuôi cấy F2. Sau 21 ngày, tiến hành thay môi trường lần 3. Môi trường thu nhận làn này ký hiệu là môi trường nuôi cấy F3. 2.2.3. Phương pháp cô đặc môi trường nuôi nguyên bào sợi chuột đã được chuyển gen cecropin B Ống eppendorf chứa 1ml môi trường được chuyển vào bình kín vô trùng và nối với máy hút chân không qua ống nhựa chịu áp lực. Toàn bộ bình được đặt trong hộp chứa nước đá để giữ lạnh môi trường. Bật máy hút để làm khô toàn bộ nước trong ống eppendorf. Thêm 100µl nước cất vô trùng vào mỗi ống. Dung dịch thu được có độ đậm đặc gấp 10 lần so với môi trường nuôi cấy mới thu và được dùng cho các thử nghiệm trên vi khuẩn. 2.2.4. Phương pháp nhân nuôi và cất giữ vi khuẩn - Chuẩn bị: Môi trường LB lỏng Ồng penicilline vô trùng Các chủng VSV Các chủng VSV dùng để thử nghiệm gồm có: Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhi, Klebsiella. sp, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Moraxella catarrhalis - Tiến hành thí nghiệm: Khử trùng box thí nghiệm Dùng pipetman hút môi trường LB lỏng vào các ống penicilline, 5ml LB/ống. Dùng que cấy vi khuẩn để lấy vi khuẩn kiểm định từ ống giống. Cho que cấy đã lấy vi khuẩn từ ống giống vào trong môi trường LB, khuấy đều đến khi vi khuẩn vừ que cấy tan hết vào môi trường. Đậy nút bông và quấn giấy bạc cho ống nuôi vi khuẩn. Nuôi vi khuẩn ở máy lắc, 150 vòng/phút trong vòng 14 – 24h. Kiểm tra sự sinh trưởng và mật độ vi khuẩn. Khi vi khuẩn đạt tới mức sinh trưởng tối ưu, cất ống nuôi vi khuẩn vào tủ mát, ở nhiệt độ 2 – 80C