Đề tài Đánh giá khả năng tạo CHHBMSH do các chủng vi khuẩn phân lập từ mùn khoan dầu khí Vũng Tàu và ảnh hưởng của chúng lên khả năng phân huỷ dầu

bằng dầu và nước (hydrophilic-lipophilic balance) phụ thuộc vào chiều dài của mạch cacbon. [36] Chúng do một số vi khuẩn và một số nấm men sản xuất. 3.2.3. Phospholipid Do một số vi khuẩn và nấm men sản xuất, nó là thành phần chính của màng vi sinh, khi vi sinh vật được nuôi trên các cơ chất là ankan thì hàm lượng phospholipid tăng mạnh. Chủng Acinetobater sp., Thiobacillus thioxydans, Athrobacter AK-19, Pseudomonas, Aeruginosa 44T1, Aspergillus spp. có khả năng sản xuất phospholipid. 3.2.4. Các lipid trung tính 3.2.5. Các lipopetid và các lipoprotein Các chất vừa có đặc tính kháng sinh vừa có hoạt tính bề mặt như gramicidin S do Bacillus brevis, polimicin do Brevibacterium polymixa tổnghợp.[28] Các lipid chứa ornithine do Peudomonas rubescen, Thiobacillus thioxydans, các lipid chứa lysin do Agrobacterium tumefaciens IFO tạo ra. Loài Seratia marcescens sản xuất ra một loại aminolipid có hoạt tính bề mặt. Chủng Bacllus subtilis ATCC21332 đã xác định có khả năng tạo ra một loại lipopeptid có hoạt tính cao. 3.2.6. Polymer Hầu hết các CHHBMSH thuộc nhóm polymer là hỗn hợp của polysacarit với protein, chúng là những chất có hoạt tính bề mặt có khối lượng rất lớn và cấu trúc phức tạp. Các chất tốt nhất là emulsan, liposan, manoprotein và một số phức hợp của polysacarit-protein khác. Emulsan do Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 tạo ra, đơn phân của nó chứa một trisacarit liên kết với hai axit béo, nó có khả năng nhũ hoá cao các hydrocacbon trong nước thậm chí với nồng độ rất thấp [10]. Liposan tạo ra từ Candida lipolytica, là một chất nhũ hoá ngoại bào, hoà tan trong nước, trong cấu trúc của nó chứa 17% protein và 73% hydrocacbon, các hydrocacbon trong liposan gồm có glucose, galactose, galactosamin, axit galactorunic [12]. Manoprotein do Sacharomyces cerevisiae tạo ra chứa 44% manose và 17% protein. Candida tropicalis đã sản xuất ra một loại phức hợp manan-axit béo trên môi trường chứa ankan [25]. P. aeruginosa P-20 tạo ra một peptidoglycolipid chứa 52 axit amin, 11 axit béo, 1 đường [16]. Cyanobacterium phormidium J-1 tạo các chất CHHBM là biofloculan và emulcyan [16]. 3.2.7. Các CHHBMSH đặc biệt Một số loài tạo ra các túi ngoại bào có tác dụng cắt hydrocacbon thành từng phần nhỏ, đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển các hydrocacbon vào trong tế bào. Các túi do chủng Acinetobacter HO1-N có đường kính 20-50 nm chứa protein, phospholipid và lipopolysaccharid, chứa 5 phần phopholipid, khoảng 350 phần polysaccharid [26]. Hầu hết các vi khuẩn phân huỷ hydrocacbon và gây độc có chứa các CHHBMSH là các thành trên bề mặt tế bào, chúng bao gồm các cấu trúc như là M protein. 3.3. Khái quát quá trình tạo CHHBMSH của vi sinh vật Để có thể biết rõ được cơ chế rõ ràng quá trình tạo chất hoạt động bề mặt sinh học ta phải theo dõi được sản phẩm của từng giai đoạn trao đổi chất của vi sinh vật. Nhưng trong phạm vi của bản khoá luận này chỉ xin được mô tả một cách sơ lược về quá trình tạo ra chất hoạt động bề mặt sinh học của vi sinh vật. Nhìn chung, mỗi một loài vi sinh vật có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học lại có một cơ chế chuyển hoá riêng. Bởi vậy nếu nói một cách cụ thể thì phạm vi sẽ là quá rộng. Ta sẽ xét cơ chế của quá trình tạo chất hoạt động bề mặt sinh học của vi khuẩn hiếu khí. Với loại vi khuẩn hiếu khí, con đường chung là trình tự oxy hoá các hydrocacbon thành rượu, sau đó đến andehit, các axit béo, rồi đến axetyl-CoA hoặc axit pyruvic. Từ đây tiếp tục con đường chuyển hoá trong chuỗi hô hấp của vi sinh vật (chu trình TCA), tạo ra các axit sản phẩm có nhóm chức ưa nước (nhóm OH hoặc C=O). Các sản phẩm của chu trình TCA sau đó kết hợp với các thành phần của dầu thô tạo lên sản phẩm là các axit amin hoặc các lipid chung tính gồm có một đầu ưa nước (OH hoặc C=O) và một đầu ưa dầu (-CH2). Chính các cấu tử này là các chất hoạt động bề mặt sinh học. 3.4. Cỏc vi sinh vật cú khả năng tạo CHHBMSH Trong tự nhiờn cú rất nhiều cỏc vi sinh vật cú khả năng tạo CHHBMSH. Sự tạo thành CHHBMSH và chức năng của cỏc chất này thường cú liờn quan tới sự phõn huỷ cỏc hydrocacbon. Vỡ vậy, cỏc chất này chủ yếu là do cỏc vi sinh vật cú khả năng sử dụng hydrocacbon sinh ra. Tuy nhiờn, một số vi sinh vật khỏc lại sử dụng cỏc nguồn cơ chất là cỏc hợp chất hữu cơ tan trong nước (glucoz, glycerol, etanol…) cũng cú khả năng sinh ra CHHBMSH. Một số vi sinh vật dường như tạo ra chất này nhằm thớch nghi với cỏc điều kiện mụi trường sống đặc biệt của chỳng, chẳng hạn như: trong cỏc bể chứa dầu, trong đất, trong đại dương… Người ta đó phõn lập được chủng Pseudomonas aeruginosa trong nước bơm ộp vào giếng khoan dầu thụ ở Venuezuela [19]. Chủng này cú khả năng thớch nghi với cỏc điều kiện khắc nghiệt trong bể chứa dầu và hơn nữa, cỏc CHHBMSH (rhamnolipit) do chủng này sinh ra lại khụng bị cỏc điều kiện đặc biệt trong giếng khoan (pH, nhiệt độ, độ mặn, Ca2+ và Mg2+) làm mất hoạt tớnh. Chủng Bacillus SP018 cú khả năng tạo CHHBMSH ngay trong điều kiện kị khớ ở 500C và chịu được nồng độ NaCl đến 10%. Chủng Bacillus AB-2 và Y12-B được phõn lập từ cỏt nhiễm dầu cú khả năng sinh trưởng trong mụi trường cú chứa hydrocacbon ở nhiệt độ 500C. Từ cỏc mẫu đất nhiễm dầu đó phõn lập được một số chủng vi sinh vật khỏc như Rhodococcus, Bacillus pumilus [27], Arthrobacter sp. MIS 38 [33]. Từ cỏc vựng ụ nhiễm nhiờn liệu đó phõn lập được cỏc chủng như Ochrobacchum anthropii, hay từ cỏc vựng biển bị tràn dầu phõn lập được Pseudomonas aeruginosa. Cỏc chủng này khụng những cú khả năng phõn huỷ dầu mà cũn cú khả năng tạo CHHBMSH cao. Jeneman và cộng sự đó phõn lập được chủng Bacillus licheniformis JF-2 trong một giếng khoan dầu ở vựng Carter, Oklahoma. Chủng này cú khả năng phỏt triển trong mụi trường kị khớ và làm giảm sức căng bề mặt của mụi trường cũn 30mN/m. Chủng này cũng cú thể sinh trưởng trong mụi trường cú nồng độ NaCl lờn tới 10%, nhiệt độ nuụi cấy là 500C và pH dao động trong khoảng từ 4,6 đến 9,0. Hơn thế nữa, chỳng khụng bị ức chế bởi sự cú mặt của dầu thụ. Vỡ vậy, chủng này cú tiềm năng để sử dụng trong phương phỏp tăng cường thu hồi dầu nhờ vi sinh vật. Người ta ước tớnh, trong cỏc giếng dầu ở Mỹ, khoảng 50-70% cỏc vi sinh vật cú thể sinh trưởng được ở pH từ 4-8, nhiệt độ dưới 750C, nồng độ NaCl khoảng 10% và cú thể sinh trưởng được cả trong điều kiện kị khớ hoặc vi hiếu khớ [19]. CHHBMSH do vi sinh vật sinh ra cú thể là chất ngoại bào hay chớnh bản thõn tế bào, trong một số trường hợp cỏc chất này cú tớnh khỏng sinh, do đú chỳng cú thể phõn huỷ màng tế bào của một số vi sinh vật cạnh tranh nguồn cacbon với chỳng. Cooper phỏt hiện chủng Clostridium pasteurianum sinh một loại mỡ chung tớnh ngoại bào, chất này cú thể làm giảm sức căng bề mặt của mụi trường từ 72mN/m xuống cũn 55mN/m. Yakimov và cộng sự [38] đó phõn lập được chủng Bacillus licheniformis BAS50, chủng này cú thể sinh trưởng kị khớ trờn mụi trường cú bổ sung đường glucoz và 0.1% NaCl và sinh CHHBMSH cú tờn là lichenysin. Kinsinger và cộng sự [21] đó phỏt hiện một chủng Bacillus subtilis cú khả năng sinh CHHBMSH ngoại bào cú bản chất là surfactin, chất này cú khả năng khỏng vi nấm. Cỏc loài vi sinh vật khỏc nhau cú thể tạo ra cỏc loại CHHBMSH cú bản chất hoỏ học và trọng lượng phõn tử khỏc nhau. Người ta đó tỏch chiết và mụ tả được bản chất hoỏ học của một số CHHBMSH do một số chủng vi sinh vật tạo ra. Banat đó tổng kết được một số vi sinh vật cú khả năng sinh CHHBMSH và bản chất hoỏ học của từng chất do từng chủng sinh ra trong bảng sau: Tên vi sinh vật Tên CHHBMSH được tạo thành Arthrobacter RAG-1 Heteropolysaccarit Arthrobacter MIS38 Lipopeptit Arthrobacter Trechaloz, xaccaroz, fructoz Bacillus licheniformis JF-2 Lipopeptit Bacillus subtilis Surfactin Bacillus pumilus A1 Surfactin Bacillus sp. AB-2 Rhamnolipit Bacillus sp. C-14 Hiđrocacbon-lipit - protein Candida antarctica Mannosylethritol lipit Candida bombicola Sophoroz lipit Candida tropicalis Mannan Candida lipolytica Y-917 Sophoroz lipit Clostridium pasteuriannum Lipit chung tính Corynebacterium hiđrocarbolastus Protein-lipit-cacbohiđrat Corynebacterium insidiosum Photpholipit Corynebacterium lepus Axit béo Chủng MM1 Glucoz, lipit, và axit hiđroxidecanoic Nocardia erythropolis Mỡ chung tính Ochrobacchum anthropii Protein Penicillum spiculisporum Axit spiculosporic Pseudomonas aeruginosa Rhamnolipit Pseudomonas fluorescens Lipopeptit Phaffia rhodozyma Cacbohiđrat-lipit 3.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sản xuất CHHBMSH a. Nguồn cacbon Chất HHBMSH được sản xuất bởi nhiều các sinh vật khác nhau và chúng cũng có những cấu trúc rất khác nhau, tuy nhiên có một số các hiện tượng chung liên quan tới việc tổng hợp chúng: Thứ nhất là việc sản xuất CHHBMSH có thể do các hydrocacbon hoặc các cơ chất không tan trong nước. Hiện tượng này được nhắc đến bởi nhiều tác giả với nhiều CHBMSH [30,16]. Hiện tượng dễ thấy khác là sự kìm hãm tổng hợp CHHBMSM bởi gluco và một số các chất trao đổi khác [16]. Trong trường hợp của Athrobacter paraffineus I, CHHBMSH không được tạo ra khi thay thế hexan bằng gluco [22]. Một chủng thuộc loài Pseudomonas aeruginosa đã sản xuất ra một chất giống protein trên nguồn hydrocacbon nhưng không tạo ra trên gluco, glycerol, axit palmitic [22]. Loài Torulopsis petrophilum không tạo ra bất cứ một glucolipid nào khi nuôi trên môi trường đồng pha chứa bất cứ nguồn cacbon hoà tan trong nước nào. Đối với chủng P. aeruginosa khác khi nuôi trên môi trường chứa glycerol nếu thêm gluco, acetat, succinat, citrat thì sản lượng rhamnolipid giảm mạnh. Nhiều loài vi sinh vật đã được biết là sẽ tổng hợp nhiều loại CHHBM khác nhau khi nuôi trên vài nguồn cacbon [32]. Có nhiều ví dụ về việc sản xuất CHHBMSH trên các nguồn cacbon hoà tan trong nước như ở Pseudomonas sp. đã sản xuất CHHBMSH trên các nguồn cacbon hoà tan trong nước như glycerol, gluco, manitol, ethanol [30]. Nhiều tác giả đã chứng minh rằng sản lượng CHHBMSH tạo ra ít khi nuôi vi sinh vật trên các nguồn cacbon nào đó trong môi trường, chỉ khi nào nguồn cacbon này hết, khi đưa vào nguồn cacbon không hoà tan trong nước sẽ thúc đẩy tạo CHHBMSH [8]. Việc tạo glucolipid bởi Torulospos bombiloca được kích thích khi thêm dầu ăn vào trong môi trường nuôi cấy chứa 10% D – gluco [16]. Davis cùng các cộng sự đã chứng minh khi thêm ethyl este của một loại axit béo vào môi trường chứa gluco thì sản lượng sopholipid ở chủng C. bombicola CBS6009 tăng. Khi sản xuất glucolipid ở chủng T. apicola TMET73747, Stuwer cùng các cộng sự đã thu được sản lượng lên tới 90g/l trên môi trường chứa gluco và dầu hướng dương [16]. b. Nguồn nitơ Nguồn nitơ là một yếu tố quan trọng điều khiển sinh tổng hợp CHHBMSH. Nguồn nitơ NH4 thích hợp hơn nguồn NO3 cho việc tạo CHHBMSH ở chủng Athrobacter paraffineus ATCC 19558, nguồn ure cũng làm tăng sản lượng CHHBMSH. Nguồn NO3 tạo ra sản lượng lớn CHHBMSH ở P. aeruginosa và Rhodoccocus sp. [16]. Sản lượng CHHBM tăng ở A. paraffineus khi thêm các axit amin như: axit glutaric, axit asparagin, hay glycin vào môi trường. Cấu trúc của surfactin cũng bị ảnh hưởng bởi nồng độ L- aa tạo ra surfactin Val-7 hay Leu-7 [16]. Với chủng B. lichenniformis BAS50 sản lượng lichennysin A tăng gấp hai đến bốn lần khi thêm L-glutaric và L-asparagin vào môi trường. Robert cùng các cộng sự đã chứng minh rằng NO3 là nguồn nitơ tốt nhất cho việc sản xuất CHHBMSH ở chủng Pseudomonas 44TL và Rhodococus ST-5 sinh trưởng trên dầu ôliu và paraffin. Sản lượng CHHBM cũng tăng bằng việc giới hạn nguồn nitơ; P. aeruginosa, Norcardia, C. tropicalis đã tăng sản lượng CHHBM cùng với hoạt động tổng hợp glutamic khi chuyển sang giai đoạn sinh trưởng chậm lại, lúc mà môi trường hết nguồn nitơ. Syldatle cùng các cộng sự đã chứng minh rằng việc giới hạn nguồn nitơ không chỉ làm tăng sản lượng CHHBMSH mà còn làm thay đổi thành phần của CHHBMSH. Guerra-Santos cùng các cộng sự chỉ ra rằng việc tạo rhamnolipit là cực đại khi tỉ lệ C: N là 16:1 đến 18:1, không tạo ra khi tỉ lệ này là 11:1. [20] c. Các yếu tố khác Một sự thay đổi trong môi trường nuôi cấy cũng làm tăng sản lượng CHHBMSH. Kiểu loại, sản lượng và hoạt tính CHHBMSH cũng bị ảnh hưởng không chỉ bởi các nguồn cacbon khác nhau mà còn bởi nồng độ, nguồn nitơ, photpho, các ion Mg, Fe trong môi trường, điều kiện nuôi cấy, pH, nhiệt độ, tốc độ lắc và tỉ lệ pha loãng các chất trong môi trường [21]. Trong một số trường hợp, khi thêm các ion đa hoá trị vào môi trường ảnh hưởng dương tính tới sản lượng CHHBM. Một số các chất như etabutol, penicillin, cloramphenicol, EDTA cũng ảnh hưởng tới việc tạo thành CHHBM. Đó là do các yếu tố này ảnh hưởng tới độ hoà tan của các nguồn cacbon. [35] Một số trường hợp quá trình tổng hợp CHHBM lại bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, pH thông qua sự tác động của các yếu tố này tới hoạt động sinh trưởng của tế bào. pH đóng vai trò quan trọng trong việc tạo rhamnolipit ở Pseudomonas sp., CHHBMSH tạo ra cực đại ở pH = 6 đến 6,5 và giảm mạnh khi pH =7 [19]. Khả năng tạo cellobioselipit ở Ustilago maydis [18] và tạo sophorolipit ở Torulospos bombicola bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi yếu tố pH [13]. Trong trường hợp chủng Athrobacter paraffineus ATCC19558, Rhodotorula erythropolis, Pseudomonas sp. DSM2874 nhiệt độ lại đóng vai trò quan trọng. Loài Bacillus chịu nhiệt cao chỉ tạo CHHBM khi nhiệt độ trên 40oC. Tốc độ lắc cũng ảnh hưởng tới sản lượng CHHBM, ở chủng Norcardia erythropolis, sản lượng CHHBM giảm khi tăng tốc độ lắc do nó tác động tới hoạt động phân chia tế bào, còn ở nấm men sản lượng lại tăng khi tốc độ lắc và mức độ kị khí tăng [29]. Nồng độ muối cũng ảnh hưởng nhiều tới quá trình sản xuất CHHBM do ảnh hưởng tới hoạt động của tế bào. Đa số các trường hợp khi nồng độ muối tăng thì khả năng tạo CHHBM giảm. Tuy nhiên trong một số trường hợp sản lượng CHHHBM không bị ảnh hưởng khi nồng độ muối lên tới 10% mặc dù nồng độ mixen tối thiểu giảm nhẹ [6]. 3.6. Một số ứng dụng của CHHBMSH * Ưu điểm của CHHBMSH so với CHHBMHH CHHBMSH tạo ra từ con đường lên men sinh học, cấu tạo của chúng rất khác so với các CHHBMHH, tuy nhiên chúng cũng gồm hai đầu kị nước và ưa nước và hoạt tính của chúng cũng không kém CHHBMHH. Nhưng CHHBMSH lại có những ưu điểm mà CHHBMHH không thể sánh kịp, quyết định khả năng ứng dụng của nó trong rất nhiều ngành công nghiệp, và đang có xu hướng thay thế dần các CHHBMHH. Đó là các đặc điểm: - Dễ phân huỷ sinh học: CHHBMHH khi bổ sung vào trong mỏ khó bị phân huỷ trong điều kiện vỉa, gây ô nhiễm môi trường dầu khí do lẫn các cấu tử không mong muốn làm giảm chất lượng dầu. CHHBMSH tạo ra từ nguồn vi sinh vật nên độ tinh khiết cao, hoạt tính của chúng lại không kém các CHHBMHH. Ví dụ điển hình cho trường hợp này là ảnh hưởng của CHHBMSH và CHHBMHH lên sự phân huỷ các hợp chất hydrocacbon thơm mạch vòng được nghiên cứu bởi Marar và Rockne: khi thêm một số CHHBMHH vào có thể kìm hãm sự phân huỷ các hợp chất thơm do có ảnh hưởng gây độc, kích thích vi sinh vật phân huỷ CHHBMHH hay cô lập các hydrocacbon trong mạch micxen CHHBM, còn CHHBMSH cho thấy có những ảnh hưởng tốt như CHHBMHH nhưng chúng có thể bị phân huỷ, không độc và nhiều CHHBMSH không tạo cấu trúc micxen do đó rất thuận lợi cho việc kết hợp các hợp chất thơm với vi khuẩn [34]. - Các chất HHBMSH có thể sản xuất từ các nguồn vật liệu rẻ tiền, sẵn có, với số lượng lớn. Nguồn cacbon có thể là các hydrocacbon, lipit, các nguồn cơ chất phế thải của các ngành công nghiệp khác như rỉ đường, dầu cặn... do đó nó mang lại hiệu quả kinh tế cao mà lại xử lí được ô nhiễm do các phế thải này gây ra với môi trường [31]. - Việc sản xuất CHHBMSH đơn giản hơn nhiều CHHBMHH. Chúng được tạo ra bằng con đường lên men nhờ vi sinh vật cho nên thiết bị đơn giản, đỡ tốn kém mà lại không sử dụng các hoá chất độc hại như sản xuất CHHBMHH. Do không độc, dễ dàng bị phân huỷ, giá thành sản xuất rẻ nên chúng được ứng dụng trong xử lí môi trường mà CHHBMHH không thể xử lí triệt để: xử lí dầu tràn, tăng cường khả năng phân huỷ các hợp chất độc hại cho môi trường, chuyển chúng thành các yếu tố tích cực cho môi trường như sản xuất phân bón từ mùn khoan phế thải, các hợp chất thơm. Với những đặc tính không độc hại, dễ bị phân huỷ, dễ tiêu hoá mà CHHBMSH được sử dụng trong các ngành công nghiệp đặc biệt khác như mĩ phẩm, dược phẩm, thực phẩm mà CHHBMHH khó có thể bì kịp. * Một số ứng dụng của CHHBMSH CHHBMSH là một nhóm đa cấu trúc, chúng có những đặc tính hơn hẳn các CHHBMHH như đã nói ở trên cho nên chúng được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Công nghiệp dầu mỏ là một ngành ứng dụng rộng rãi các chất hoạt hoá bề mặt trong khai thác cũng như là xử lí môi trường, CHHBMSH đã tỏ ra có ưu thế và tiềm năng trong ngành công nghiệp này. Sau đây chúng tôi xin trình bày một số các ứng dụng quan trọng của nó. a. Nâng cao hiệu suất khai thác dầu (MEOR) Đây là một ứng dụng quan trọng nhất của nó trong ngành công nghiệp dầu mỏ. Cơ chế của phương pháp MEOR bao gồm: Tạo axit hoà tan phần đá bao bọc dầu, tăng độ rỗng và tính thấm của vỉa, tạo khí, do đó làm giảm độ nhớt của dầu và tăng áp suất vỉa. Tạo các axit hữu cơ hay các chất HHBM, biopolyme làm giảm sức căng bề mặt giữa dầu và nước dẫn đến làm tăng độ linh động của dầu. CHHBMSH có thể được sản xuất từ ngoài (ex situ) rồi bổ sung vào trong mỏ hay tạo ra ngay trong mỏ (in situ). Trong cả hai trường hợp, CHHBMSH đều làm tăng lượng dầu khai thác từ mỏ lên tới 60 đến 70% mà bằng phương pháp bơm ép thông thường chỉ khai thác được khoảng 30% nguồn dầu trong mỏ. Sự có mặt của CHHBM làm giảm sức căng bề mặt giữa vùng dầu nước do đó kích thích dòng dầu chảy. Để sản xuất CHHBM từ ngoài, CHHBM được tiến hành lên men, thu CHHBM hay đơn giản là cô đặc dịch nuôi cấy và sau đó là bơm xuống giếng. Quá trình sản xuất ex situ phải được tiến hành với số lượng lớn, dưới điều kiện tối ưu, cung cấp đầy đủ không khí cho quá trình lên men. Quá trình này có thể sử dụng các cơ chất rẻ tiền như các phế thải của các ngành công nghiệp nên vừa hạ giá thành sản phẩm vừa giảm ô nhiễm cho môi trường [31]. Một áp dụng hợp lí và hấp dẫn hơn là sản xuất CHHBMSH ngay trong mỏ (in situ) bằng cách cung cấp chất dinh dưỡng cho quần thể vi sinh vật nội tại trong mỏ hay nuôi giống từ bên ngoài trộn cùng với môi trường dinh dưỡng rồi bơm vào trong giếng. Tuy nhiên khi sản xuất theo cách thức này thường gặp những khó khăn nhất định ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi sinh vật thậm chí kìm hãm sinh trưởng và sinh tổng hợp CHHBM như: nhiệt độ mỏ quá cao, áp suất lớn, pH, độ mặn và kim loại nặng, khó khăn lớn nhất là thiếu oxy và việc luân chuyển chất dinh dưỡng trong mỏ. Do đó, để phương pháp MEOR này thành công thì phải lựa chọn được các chủng có khả năng chịu đựng được các điều kiện khó khăn trong mỏ. Phương pháp MEOR đã được nhiều nước áp dụng thành công. Clark cùng các cộng sự đã xác định có khoảng 27% mỏ dầu ở Mĩ thích hợp cho vi sinh vật phát triển và ứng dụng phương pháp MEOR. Phương pháp MEOR cũng đã được thông báo thành công trong nhiều nghiên cứu ở Nga, Cộng hoà Séc, Rumani, Mĩ, Hungary, Balan, Hà Lan, Nam Tư. Nước ta hiện đã ứng dụng phương pháp này, năm 1998 Lại Thuý Hiền cùng các cộng sự đã thử nghiệm phương pháp MEOR trên hiện trường khu vực mỏ dầu Bạch Hổ- Vũng Tàu và thu được kết quả tốt, số lượng vi khuẩn khử sunphat giảm đi, năng suất khai thác dầu tăng lên có giếng tăng tới 200%. b. Phân huỷ các hydrocacbon Một ứng dụng quan trọng khác của CHHBMSH đó là trong xử lí môi trường ô nhiễm hydrocacbon. - Phân huỷ các hydrocacbon trong đất: Các nghiên cứu về quá trình phân huỷ hydrocacbon trong đất đã được thông báo rộng dãi. Khả năng phân huỷ phụ thuộc vào sự có mặt của các vi sinh vật phân huỷ, thành phần hydrocacbon, O2, nhiệt độ, pH, nước, các chất dinh dưỡng và trạng thái vật lí của các hydrocacbon. Khi thêm CHHBM sinh học hay tổng hợp vào trong môi trường sẽ làm tăng tính lưu biến và độ hoà tan của các hydrocacbon, điều này rất cần cho quá trình phân huỷ. Các thử nghiệm khi bổ sung CHHBMSH để phân huỷ các hydrocacbon đã đem lại nhiều thành công: Lindley và Heydeman nuôi nấm Cladosporium resinae trên hỗn hợp ankan, chủng này có khả năng sản xuất ra một loại CHHBM gồm các axit béo, phospholipid, nhưng chủ yếu là axit dodecacnoic và phosphatidylcloline. Khi bổ sung phosphatidylcloline vào môi trường nuôi cấy chứa hỗn hợp các ankan này đã làm tăng tốc độ phân huỷ ankan lên 30%. Foght cùng các cộng sự đã chứng minh chất emulsan kích thích quá trình phân huỷ của dịch chứa đơn chủng vi khuẩn nhưng lại kìm hãm khi môi trường chứa hỗn hợp các chủng vi khuẩn. Oberbremer và Muller-Harting sử dụng quần thể vi sinh đất để đánh giá khả năng phân huỷ dầu thô, trong đó naphthalen bị phân huỷ đầu tiên, các thành phần khác chỉ bị phân huỷ khi các CHHBM được tạo ra làm giảm sức căng bề mặt giữa dầu và nước. Khi thêm CHHBM như một số sophorolipit vào môi trường chứa hỗn hợp các hydrocacbon thì sẽ làm tăng phân huỷ cả số loại lẫn số lượng các hydrocacbon. Một vài chủng vi khuẩn kị khí cũng sản xuất CHHBMSH nhưng khả năng làm giảm sức căng bề mặt không bằng các vi khuẩn hiếu khí. Bergetal đã sử dụng CHHBMSH do chủng P. aeruginosa UG2 làm tăng độ hoà tan của hexachlorobiphenyl lên 31% gấp 3 lần khi sử dụng CHHBM hoá học là 9,3%. Khi cả hai chất này cùng sử dụng thì hiệu quả hoà tan tăng lên 41,5%. Chủng Pseudomonas cepacia AC1100 tạo ra một loại chất nhũ hoá có khả năng tạo thể huyền phù với 2,4,5-T và cũng nhũ hoá một số các clorophenol, do đó CHHBM này được sử dụng để tăng cường khả năng phân huỷ của các chất hữu cơ chứa clo [30]. - Phân huỷ các hydrocacbon trong môi trường nước: Khi dầu bị tràn ở môi trường nước, các thành phần HRCB nhẹ bay hơi còn các HRCB không phân cực thì không hoà tan trong nước. Do có độ hoà tan thấp (<1ppm) và tỉ trọng nhỏ hơn nước nên hầu hết các thành phần HRCB tồn tại trên bề mặt nước. Các vi sinh vật có khả năng phân huỷ HRCB đã được phân lập trong môi trường nước, các vi sinh vật này bị kích thích hoạt động nhũ hoá khi môi trường nhiễm dầu. Chakrabartu đã thông báo rằng chất nhũ hoá do P. aeruginosa SB30 làm tăng khả năng thu gom dầu, rất có ích để xử lí các bờ biển bị nhiễm dầu. CHHBM từ vi khuẩn còn được ứng dụng để làm sạch các thùng, kho chứa dầu và nhiều ứng dụng khác. CHHBM emulsan do chủng Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 sinh ra sử dụng trong công nghiệp dầu khí làm giảm cặn dầu trong thùng chứa, giảm độ nhớt của dầu nặng, tạo chất nhũ hoá phục vụ nhiều lĩnh vực khác [30]. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. VẬT LIỆU 1.1. Nguyên liệu Mùn khoan lấy từ mỏ Bạch Hổ –Vũng Tàu. Các chủng vi khuẩn nhận từ phòng vi sinh vật dầu mỏ. 1.2. Hoá chất và môi trường nuôi cấy 1.2.1. Môi trường hiếu khí tổng số 1% (g/l) Thạch KH2PO4 NaCl KCl MgCl2 NH4 NO3 Glucoza Pepton Cao thịt Cao men Nước máy pH 20 1 10 0,25 1,2 2 1 5 3 0,2 1 lít 7-7,2 Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Trung Quốc Nga Đức Đức 1.2.2. Môi trường khoáng Gost cho vi khuẩn (g/l): Na2HPO4 KH2 PO4 KNO3 MgSO4 Nước máy 0,7 0,3 3 0,4 1 lít pH và nồng độ NaCl chỉnh theo từng thí nghiệm. Các loại dầu: DO, saralin, dầu thô, parafin, dầu oliu. Các môi trường được khử trùng riêng với các loại dầu ở 1 atm trong thời gian 30 phút. 1.3. Thiết bị và máy móc Kính hiển vi quang học Laborval 4 (Đức) Cân phân tích Sartorius (Đức) Máy bay hơi chân không SpeedVac (Đức) Máy li tâm Sorwal (Đức) Máy lắc Beckman (Đức) Tủ sấy (Việt Nam) Bốc cấy (Việt Nam) Các vật dụng khác của phòng vi sinh vật dầu mỏ. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Giữ giống và nhân giống * Giữ giống: các chủng sau khi lựa chọn được giữ giống trên môi trường khoáng Gost bổ sung dầu DO, giữ trong glycerin với tỉ lệ 1:1, và trên môi trường hiếu khí thạch nghiêng. Nhân giống: chủng được nhân giống trên môi trường hiếu khí thạch nghiêng, rồi từ đó được cấy sang môi trường Gost có bổ xung 5% dầu DO để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.2. Tuyển chọn các chủng có khả năng sử dụng dầu mạnh Các chủng sau khi phân lập từ mùn khoan dầu khí được nhân giống và và cấy chuyền ra các ống thạch nghiêng. Tiến hành nuôi lắc từng chủng trên môi trường Gost 1% NaCl chứa 5% dầu DO, pH =7,5; tốc độ lắc v =200vòng/phút với tỉ lệ 1% giống, theo dõi trong một tuần. Quan sát sự thay đổi độ đục, trạng thái của dầu trong môi trường, kết luận chủng có khả năng sử dụng dầu hay không. Nếu môi trường có độ đục cao, dầu bị nhũ hoá thì chứng tỏ chủng có khả năng sử dụng dầu mạnh. 2.3. Quan sát hình thái 2.3.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc: cấy ria các chủng trên môi trường hiếu khí, ủ ở điều kiện 30o C sau 24h đem quan sát. 2.3.2. Quan sát hình thái tế bào: sau24h nuôi cấy, tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi quang học. * Xác định Gram: nhuộm Gram và thử lại bằng phương pháp KOH để làm tăng độ chính xác: lấy một ít sinh khối tế bào lên phiến kính, nhỏ một giọt dung dịch KOH 3% lên sinh khối tế bào, dùng que cấy đánh tan tế bào. Nếu dịch tạo nhớt thì kết luận vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm, nếu không tạo nhớt chứng tỏ vi khuẩn là Gram dương * Xác định khả năng chuyển động: làm ti