Đề tài Động học Enzyme dị thể

chúng được minh hoạ trong hình 2 [Segel, 1975]. Koshland cho rằng protein là các phân tử linh động, hình dạng của chúng thay đổi khi gắn với phối tử. Do vậy, khi enzyme oligomer gắn với một phối tử sẽ gây ra chuyển tiếp hình dạng của chính nó để dễ hoặc khó gắn hơn với các phối tử khác (cùng hoặc khác loại). Hình 3 thể hiện các đặc trưng quan trọng của mô hình này với enzyme dimer. Chú ý rằng trong trường hợp này không cần duy trì tính đối xứng, hai phần đưới đơn vị có thể có hình dạng khác nhau. Nếu các tương tác dưới đơn vị kết hợp chặt chẽ, sau khi S gắn với một dưới đơn vị có thể làm dưới đơn vị khác có ái lực thấp hoặc cao hơn với S (hoặc một số phối tử khác). Cơ chế được đưa ra là biến đổi hình dạng gây ra bởi phối tử của một phần dưới đơn vị có thể chuyển tiếp hiệu ứng của nó tới các phần dưới đơn vị bên cạnh bằng những tương tác thay thế và các sắp xếp của các gốc axit amin tại nơi tiếp giáp của các dưới đơn vị. Phụ thuộc vào ái lực tương đối của hình dạng thích ứng với dưới đơn vị bên cạnh, hiệu quả tổng thể của phối tử gắn tiếp theo có thể là âm, dương hoặc trung tính (hình 3) [Garrett & Grisham, 2003]. ►Hình 3: Mô hình SI với enzyme dị không gian. (a) Cơ chất S gắn vào làm biến đổi hình dạng của dưới đơn vị mà nó gắn. (b) Nếu các tương tác dưới đơn vị kết hợp chặt chẽ, khi S gắn với một dưới đơn vị có thể làm dưới đơn vị khác biến đổi hình dạng để có ái lực lớn hơn (đẳng hướng dương) hoặc nhỏ hơn (đẳng hướng âm) với S. Nói cách khác, biến đổi hình dạng gây ra bởi phối tử trong một dưới đơn vị có thể ảnh hưởng đến dưới đơn vị kề bên. Các hiệu ứng này có thể được chuyển tiếp giữa các miền peptide cạnh nhau bằng cách thay đổi sự sắp xếp của các gốc axit amin không liên kết [Theo Garrett & Grisham, 2003]. ◄Hình 2: Sơ đồ cân bằng khi enzyme holodimer gắn với cơ chất, ở đó cơ chất gắn được trợ giúp bởi sự chuyển vị hình dạng của phần dưới đơn vị nơi nó gắn, theo mô hình Koshland và cộng sự (1966) [Theo Copeland, 2000]. S S S S KS KS aKS aKS +S +S +S +S Nguyễn Xuân Hưng 2005 8 Hằng số kết hợp của cơ chất đầu tiên là KS. Tuy nhiên, khi một trong các vị trí gắn cơ chất bị chiếm giữ, hằng số phân ly của vị trí thứ hai bị biến đổi a lần (với tính hợp tác dương, a < 1). Phương trình vận tốc tổng thể của enzyme này là [Copeland, 2000]: 2 S 2 S 2 S 2 S max ]S[]S[21 ]S[]S[ aKK aKK V v ++ ÷÷ ø ö çç è æ + = 2.1.2 Enzyme tetramer Mở rộng mô hình với enzyme tetramer (hình 4). Trong trường hợp này phân tử cơ chất đầu tiên gắn vào làm biến đổi hằng số phân ly của toàn bộ ba vị trí gắn khác a lần. Nếu phân tử cơ chất thứ hai tiếp tục gắn vào, hai vị trí gắn còn trống sẽ có hằng số phân ly biến đổi tiếp b lần trở thành abKS. Tương tự, khi trung tâm hoạt động thứ ba bị cơ chất chiếm giữ, vị trí còn lại sẽ bị biến đổi tiếp c lần và hằng số phân ly sẽ là abcKS [Copeland, 2000]. ▲Hình 4: Sơ đồ tương tác thứ tự của cơ chất với enzyme điều hoà bốn phần dưới đơn vị. Một phân tử cơ chất gắn với trung tâm hoạt động sẽ làm thay đổi ái lực của các vị trí khác. ki là hằng số phân ly vi mô của các vị trí thứ i tương ứng [Theo Marangoni, 2003]. Đường cong v - [S] có hình sigmoid (hình 1). Theo lý thuyết, enzyme điều hoà tetramer có bốn trung tâm hoạt động, phương trình tốc độ phản ứng và cân bằng khối của enzyme là [Marangoni, 2003]: ]ES[4]ES[3]ES[2]ES[ 4cat3cat2cat1cat kkkkv +++= ]ES[]ES[]ES[]ES[E][]E[ 4321 ++++=T Thừa số yếu tố tương tác Để thuận tiên, khi nghiên cứu enzyme điều hoà người ta cố gắng quy tất cả các hằng số phân ly khi có cơ chất gắn vào (k1, k2, k3, k4) về hằng số phân ly vi mô nội tại k. Hằng số phân ly nội tại của phức ES là k1, trong trường hợp này k1 = k. Khi cơ chất gắn với trung tâm hoạt động đầu tiên, hằng số phân ly nội tại của vị trí gắn cơ chất thứ hai (ES2) sẽ biến đổi a lần: k2 = ak Khi cơ chất thứ hai gắn, hằng số phân ly nội tại của vị trí gắn cơ chất thứ ba sẽ biến đổi b lần: k3 = abk (2) (3) (4) (5) (6) S S S S S S S S S S k1 k3 k4 k4 Nguyễn Xuân Hưng 2005 9 Khi phân tử cơ chất thứ ba gắn vào, hằng số phân ly nội tại của vị trí gắn cơ chất thứ tư sẽ biến đổi c lần: k4 = abck a, b, c được gọi là các thừa số yếu tố tương tác. Do đó, với enzyme điều hoà tetramer, hằng số phân ly nội tại enzyme - cơ chất tổng thể (k’): k’ = k1k2k3k4 = a3b2ck4 Các thừa số tương tác sẽ có giá trị 1 với điều hoà âm. Rất khó thu được các thừa số tương tác riêng biệt, hoặc các hằng số phân ly nội tại chính xác bằng cách phân tích động học enzyme trong trạng thái hoạt tính ổn định [Marangoni, 2003]. Hằng số phân ly vi mô - vĩ mô Việc phân biệt các hằng số phân ly vi mô và vĩ mô là điều quan trọng. Số cách các phân tử cơ chất chiếm giữ n trung tâm hoạt động trong enzyme, không quan tâm đến sự thay thế và thứ tự chiếm giữ (tổ hợp C) là [Marangoni, 2003]: !)!( ! ssn nC - = Với s là số phân tử cơ chất gắn với enzyme. Trong trường hợp enzyme tetramer có 4 trung tâm hoạt động (n = 4). Số cách tạo phức hệ enzyme-cơ chất vi mô ES2 là 6 (hình 5). Nồng độ của mỗi loại ES2 vi mô sẽ là [ES2]/6. Mối quan hệ giữa các hằng số phân ly vi mô và vĩ mô đạt được bằng cách thay các điều kiện nồng độ ESn vĩ mô bằng điều kiện nồng độ ESn vi mô, giả định cân bằng có thể xảy ra cho mỗi loại vi mô. Ví dụ, hằng số phân ly vĩ mô của phản ứng ES3 ES2 + S là: ]ES[ S]][ES[ 3 2 S =K Như được đề cập ở trên, có 6 cách enzyme và cơ chất tạo thành các loại ES2 vi mô. Với phức ES và ES3, có thể tạo thành bốn loại vi mô khác nhau trong khi chỉ có một loại vi mô cho phức hệ ES4 (hình 5). Do đó nồng độ ES2 vi mô là [ES2]/6. Nồng độ của phức hệ ES, ES3, và ES4 vi mô tương ứng là [ES]/4, [ES3]/4, và ES4 [Marangoni, 2003]. Từ những điều trên, hằng số phân ly vi mô của phản ứng ES3 ES2 + S là: ]ES[ S]][ES[ 3 2 4/]ES[ S])[6/]ES([ 3 2 3 2 ==Sk Do đó, mối quan hệ giữa các hằng số phân ly vĩ mô (Ks ) và vi mô (ks ) của phản ứng này là: SS kK 2 3 = (7) (8) (9) (10) (11) (12) Nguyễn Xuân Hưng 2005 10 ▲Hình 5. Các trường hợp trong đó, tương ứng, một, hai, ba và bốn phân tử cơ chất có thể chiếm giữ ngẫu nhiên các vị trí gắn trên một enzyme có bốn vị trí điều hoà [Theo Marangoni, 2003]. Như vậy, hằng số phân ly vĩ mô hay toàn bộ (Kn) và vi mô hay nội tại (kn) với các phức hệ ESn khác nhau là [Marangoni, 2003]: ][ES E][S][ 4 1 1 11 == kK 11 1 E][S][4E][S][]ES[ kK == ][ES ][S]ES[ 3 2 2 1 22 == kK 21 2 21 2 2 E][S][6E][S][]ES[ kkKK == ][ES ][S]ES[ 2 3 3 2 33 == kK 321 3 321 3 3 E][S][4E][S][]ES[ kkkKKK == ][ES ][S]ES[4 4 3 44 == kK 4321 4 4321 4 4 E][S][E][S][]ES[ kkkkKKKK == Khi cơ chất gắn vào, hằng số phân ly có thể giảm trong trường hợp điều hoà dương (tăng ái lực của enzyme với cơ chất) hoặc tăng trong trường hợp điều hoà âm (giảm ái lực của enzyme với cơ chất) [Marangoni, 2003]. S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S 1 4 6 4 (13) (14) (15) (16) Nguyễn Xuân Hưng 2005 11 Chuẩn hoá phương trình tốc độ ta có [Marangoni, 2003]: 4321 4 321 3 21 2 1 4321 4 321 3 21 2 1 max /]S[/]S[4/]S[6/]4[S1 /]S[/]S[3/]S[3/]S[ kkkkkkkkkk kkkkkkkkkk V v ++++ +++ = Với Vmax = 4kcat[ET ]. Trong trường hợp đặc biệt, khi enzyme có tính điều hoà dương rõ rệt, [ES], [ES2], và [ES3] << [ES4]. Ta có dạng thu gọn [Marangoni, 2003]: 4 4 4321 4 4321 4 max ]S[' ]S[ /]S[1 /]S[ + = + » kkkkk kkkk V v ; Với k’ = k1k2k3k4= a3b2ck4 2.1.3 Trường hợp tổng quát Tổng quát hoá phương trình 18 với enzyme điều hoà cao có n trung tâm hoạt động: n n kV v ]S[' ]S[ max + = Phương trình 19 gọi là phương trình Hill. Hằng số Hill k’, hệ số Hill n, và Vmax là các tham số được dùng để xác định tính chất xúc tác của các enzyme điều hoà. Hằng số Hill liên quan đến các hằng số phân ly enzyme - cơ chất (k’ = Pkn) cho phép đánh giá ái lực của enzyme với một cơ chất riêng. Tương quan giữa hằng số Hill và nồng độ cơ chất tại ]S[ 2 1 0,5maxV là: nk ]S[' 0,5= Hằng số Hill là một chỉ số của ái lực enzyme với cơ chất, nhưng không phải là hằng số phân ly enzyme - cơ chất. Đơn vị của nó là (nồng độ)n. Do vậy khó mà so sánh các phản ứng có giá trị n khác nhau [Marangoni, 2003]. Hệ số Hill là một chỉ số của tính điều hoà trong quá trình gắn cơ chất. Giá trị n càng lớn, tính điều hoà càng cao. Trong trường hợp n = 1 (không hợp tác), phương trình Hill trở thành phương trình Michaelis - Menten. Khi mức độ hợp tác của các vị trí thấp, n sẽ không còn là số vị trí gắn cơ chất và có thể không phải là số nguyên [Copeland, 2000; Marangoni, 2003]. Tuy nhiên, phương trình Hill vẫn có thể được sử dụng để xác định động học của enzyme điều hoà. Trong trường hợp này, hệ số xác định được từ thí nghiệm gọi là giá trị n biểu kiến (nH). Giá trị làm tròn lên của nH gọi là số vị trí gắn cơ chất nhỏ nhất trên enzyme oligomer. Ví dụ, từ thí nghiệm xác định được nH = 1,65. Mặc dù có thể nói rằng số vị trí gắn nhỏ nhất trên enzyme là 2 và các vị trí thể hiện mức độ hợp tác vừa phải. Tuy nhiên, không có bằng chứng thí nghiệm cho thấy enzyme này chỉ có hai vị trí gắn cơ chất. Nó có thể có 3, 4 hoặc nhiều vị trí gắn hơn với tính hợp tác yếu hơn. Điều này giải thích tại sao giá trị 2 trong ví dụ này gọi là số vị trí gắn có thể nhỏ nhất [Copeland, 2000]. Bằng cách kết hợp phương trình Hill với dữ liệu v - [S] thực nghiệm, có thể dễ dàng xác định k’, n, và Vmax. Hình 8.4 vẽ các đường cong v - [S] theo phương trình 19. Theo hình 6(a), khi số mũ Hill (n) lớn hơn độ sigmoid của đường cong rõ ràng hơn. Khi n = 1, (17) (18) (19) (20) Nguyễn Xuân Hưng 2005 12 đồ thị có dạng Michaelis–Menten. Tăng giá trị hằng số Hill (k’) làm độ dốc của đường cong v - [S] giảm dần (hình 6b). Do đó, từ phối cảnh topo học, hình dạng (mức độ sigmoid và độ dốc) của đường cong có thể xác định hai tham số này [Marangoni, 2003]. ▲Hình 6: (a) Mô phỏng hiệu quả khác nhau của số mũ Hill (n) đối với hình dạng của đường cong vận tốc - nồng độ cơ chất của enzyme điều hoà. (b) Mô phỏng hiệu quả của các hằng số Hill (k’) với hình dạng của đường cong vận tốc đầu - nồng độ cơ chất với enzyme điều hoà [Theo Marangoni, 2003]. Phương trình Hill có thể chyển về dạng tuyến tính bằng cách lấy loga hai vế: )'log(]Slog[log max kn vV v -=÷÷ ø ö çç è æ - Do đó, đồ thị log(v/(Vmax-v)) là hàm của log[S] có dạng đường thẳng với độ dốc bằng n và cắt trục tung tại -log(k’), như được minh hoạ trong hình 7. Tuy nhiên, đồ thị này không được sử dụng phổ biến vì cần biết trước Vmax và mối tương quan tuyến tính theo phương trình 21 chỉ đúng trong dải nồng độ cơ chất giới hạn (trong vùng [S] = k’). Do đó, bất cứ khi nào có thể, xác định Vmax, n, và Km của enzyme điều hoà từ đường cong không tuyến tính theo phương trình 19 là tốt nhất [Copeland, 2000]. ▲Hình 7: Đồ thị Hill log[v/(Vmax-v)] là hàm của log[S]. Đường thẳng cắt trục tung tại -log(k’) và độ dốc của nó cho phép đánh giá của hệ số Hill n [Theo Copeland, 2000]. (21) Nguyễn Xuân Hưng 2005 13 Phương trình Hill là hàm của ba tham số (k’, n, Vmax) là phương trình động học đơn giản nhất của các enzyme điều hoà. Từ khía cạnh thực nghiệm, mô hình hữu dụng nhất tiếp đó là mô hình đối xứng. Mặc dù nó chỉ thích hợp với điều hoà dương và đôi khi dựa trên các giả định không chắc chắn xảy ra, mô hình này có thể thích hợp với các hiệu ứng dị không gian [Marangoni, 2003]. 2.2 Mô hình đối xứng hay phối hợp Năm1965, J. Monod, J. Wyman, và J. P. Changeux đưa ra lý thuyết mô hình chuyển tiếp dị không gian (allosteric transitions). Mô hình này thích hợp với dị không gian nhưng không giải thích tính kháng hợp tác (anticooperativity). Họ đã đưa ra mô hình cấu trúc của các enzyme dị không gian với các tiên đề sau [Marangoni, 2003]: 1. Các enzyme dị không gian gồm các phần dưới đơn vị đồng nhất chiếm giữ các vị trí như nhau trong enzyme. Hay nói cách khác, có ít nhất một trục đối xứng trong phân tử. Mỗi phần dưới đơn vị là một đơn vị cấu trúc chứa duy nhất một vị trí gắn với mỗi phối tử đặt hiệu (cơ chất hay chất hoạt hoá). Một phần dưới đơn vị có thể không phải chỉ luôn là một chuỗi polypeptide [Leskovac, 2003; Marangoni, 2003]. 2. Mỗi phần dưới đơn vị chỉ tồn tại ở một trong hai trạng thái, R (lỏng hay ái lực gắn cơ chất lớn) hoặc T (chặt hay ái lực gắn cơ chất thấp). Hằng số phân ly của phức hệ cơ chất - dưới đơn vị trạng thái R (KR) thấp hơn của phức hệ cơ chất - dưới đơn vị trạng thái T (KT) [Marangoni, 2003]. 3. Tất cả các dưới đơn vị trong enzyme phải có dạng R hoặc T, không cho phép dạng hỗn hợp mà chỉ có cân bằng giữa chúng [Marangoni, 2003]. 4. Ái lực gắn của phối tử đặc hiệu phụ thuộc hình dạng của enzyme (R hoặc T) mà không phụ thuộc vào sự chiếm giữ bởi cơ chất ở vị trí gần kề [Marangoni, 2003]. 5. Khi protein chuyển từ trạng thái này đến trạng thái khác, tính đối xứng phân tử của nó được bảo tồn [Leskovac, 2003]. Trong khi mô hình SI sử dụng một chuỗi biến đổi cấu trúc bậc ba, mô hình MWC sử dụng biến đổi cấu trúc bậc bốn [Koshland, 1968]. Khi không có phối tử, cân bằng giữa hai trạng thái dị không gian của protein: R0 T0 R0 và T0 là hai trạng thái hình dạng của enzyme không gắn với phối tử. Hằng số cân bằng (L) của hai trạng thái “trống” này gọi là hằng số dị không gian [Copeland, 2000]: ]R[ ]T[ 0 0=L L được giả định là lớn tức protein trong trạng thái hình dạng T nhiều hơn trong hình dạng R. Họ đưa ra L = 104 [Garrett & Grisham, 2003]. (21) Nguyễn Xuân Hưng 2005 14 Trường hợp tổng quát Xét trường hợp enzyme gồm bốn phần dưới đơn vị, quan tâm đến các cách sắp xếp cơ chất (S) khác nhau ta có các cân bằng sau R + S RS1 T + S TS1 R + RS1 RS2 T + TS1 TS2 R + RS2 RS3 T + TS2 TS3 R + RS3 RS4 T + TS3 TS4 Tất cả các phương trình cân bằng trên có hằng số phân ly nội tại KR ứng với trạng thái R và hằng số phân ly nội tại KT ứng với trạng thái T [Leskovac, 2003]. ◄Hình 8: Mô hình chuyển tiếp dị không gian Monod - Wyman - Changeux (MWC). Protein dimer có hai trạng thái hình dạng R hoặc T. Mỗi dưới đơn vị trong dimer có một vị trí gắn cơ chất S và một vị trí hiệu ứng dị không gian F. Các phần dưới đơn vị đồng nhất, đối xứng và tính đối xứng này được duy trì trong cả hai trạng thái hình dạng. Trạng thái của protein khi gắn hoặc không gắn với phối tử liên hệ với nhau thông qua cân bằng khác nhau. Do đó, tương quan mật độ của các phân tử trong trạng thái R và T là hàm của các cân bằng này và nồng độ của cơ chất và các chất hiệu ứng khác nhau (cái gắn với FSR hoặc FST). Khi [S] tăng, cân bằng T/R chuyển theo hướng tăng nồng độ R [Theo Garrett & Grisham, 2003]. Nguyễn Xuân Hưng 2005 15 ◄Hình 9: Biểu đồ thể hiện các cân bằng gắn cơ chất của enzyme tetramer theo mô hình SI (1965) [Theo Copeland, 2000]. Quan tâm đến các khả năng phân ly có thể của các phức hệ R1, R2, R3, R4 và T1, T2, T3, T4, ta có các phương trình biểu diễn nồng độ của 10 dạng enzyme trong hình 9 qua nồng độ trạng thái trống [Leskovac, 2003]: ]R[4]R[]S[4]R[ 001 a== RK ]R[4]R[]S[4]T[ 001 cLLK c R a== ]R[6]R[]S[4]R[ 0 2 02 2 2 a== RK ]R[6]R[]S[6]T[ 02202 22 2 LcLK c R a== ]R[4]R[]S[4]R[ 0 3 03 3 3 a== RK ]R[4]R[]S[4]T[ 03303 33 3 LcLK c R a== ]R[]R[]S[]R[ 0 4 04 4 4 a== RK ]R[]R[]S[]T[ 04404 44 4 LcLK c R a== [T0] = L[R0] Trong đó hệ số gắn chung (nonexclusive binding coefficient), c, là tỷ lệ hằng số phân ly nội tại enzyme - cơ chất của enzyme trong các trạng thái R và T: T R K Kc = (22) (24) (26) (28) (23) (25) (27) (29) (30) (31) R2 R4 S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S R3 R1 T2 T1 T4 T0 R0 T3 +S +S +S +S +S +S +S +S KS KS KS KS KS KS KS KS L Nguyễn Xuân Hưng 2005 16 a là nồng độ chuẩn hoá của cơ chất: RK S][ =a Trường hợp enzyme oligomer có n vị trí gắn cơ chất Tỷ lệ protein trong trạng thái R (hàm trạng thái R): ])T[...]T[]T[]T[]T([])R[...]R[]R[]R[]R([ ]R[...]R[]R[]R[]R[ n3210n3210 n3210 +++++++++++ +++++ =R Tỷ lệ các vị trí thực tế đã gắn phối tử (YF = hàm bão hoà): ])T[...]T[]T[]T[]T([])R[...]R[]R[]R[]R([ ])T[...]T[3]T[2]T([])R[...]R[3]R[2]R([ n3210n3210 n321n321 F +++++++++++ +++++++++ = nn nnY Sử dụng các phương trình cân bằng và phương trình 31 và 32 và các phương trình biểu diễn nồng độ theo trạng thái trống ta thu được hai hàm mới. Hàm trạng thái R: nn n cL R )1()1( )1( aa a +++ + = Tương tự, hàm trạng thái T: nn n cL cLT )1()1( )1( aa a +++ + = Tỷ lệ tương đối của protein trong trạng thái R so với protein trong trạng thái T (quotient function): n n cLR R T RQ )1( )1( 1 a a + + = - == Với một enzyme trong các điều kiện cân bằng nhanh, tỷ lệ các vị trí bị phối tử F chiếm giữ bằng v0/Vmax [Leskovac, 2003]. Do đó: nn nn cL cLc V vY )1()1( )1()1( 11 max 0 F aa aaaa +++ +++ == -- Rút gọn phương trình này: RR c c V vY ÷ ø ö ç è æ + +- + == a a a a 1 )1( )1(max 0 F Vai trò của L và c với tính hợp tác Hình 10 minh họa hiệu ứng của L và c đối với hình dạng và độ sigmoid của các đường cong bão hoà. Hình này vẽ các đường cong lý thuyết của hàm YF tương ứng với (32) (33) (34) (35) (36) (37) (38) (39) Nguyễn Xuân Hưng 2005 17 các giá trị L và c khác nhau. Trong đó, hiệu ứng hợp tác dị hướng của phối tử được tiên đoán bởi các tính chất đối xứng của mô hình, được biểu hiện bởi độ cong phần thấp hơn của đường cong. Đồ thị cho thấy tính hợp tác của phối tử phụ thuộc vào các giá trị L và c. Tính hợp tác rõ ràng hơn khi hằng số dị không gian lớn tức khi cân bằng R0 T0 nghiêng về về phía T0. Tính hợp tác cũng rõ ràng khi tỷ lệ của các hằng số phân ly vi mô (c) nhỏ [Leskovac, 2003]. Do đó, có thể kết luận là tính hợp tác gắn phối tử phụ thuộc lớn vào độ lớn của L và c. Đường cong bão hoà trở nên sigmoid hơn khi L tăng tức trạng thái T chiếm đa số. Cũng vậy, đường cong bão hoà sigmoid hơn khi c giảm tức là ái lực của trạng thái T với S giảm tương đối so với ái lực của R với S [Leskovac, 2003]. ▲Hình 10: Các đường cong lý thuyết của hàm bão hoà YF với L, c biến thiên và n = 4 [Theo Leskovac, 2003]. Với bất kỳ hệ thống enzyme nào, các hiệu ứng hoạt hoá hay kìm hãm được đánh giá trong giới hạn biến thiên của Km và Vmax. Có hai loại hiệu ứng trong các enzyme dị không gian [Leskovac, 2003]: - Hệ thống K: F và S có ái lực khác nhau với trạng thái R và T. Do đó, rõ ràng sự có mặt của F sẽ thay đổi ái lực của enzyme với S và ngược lại. - Hệ thống V. Trường hợp này R và T có cùng ái lực với cơ chất S nhưng khác nhau trong khả năng xúc tác và ái lực của chúng với F. F có thể là chất hoạt hoá, A (hệ thống V dương), hoặc chất kìm hãm, I (hệ thống V âm). 2.2.1 Khi không có chất hiệu ứng Trường hợp gắn riêng (cơ chất chỉ có ái lực với trạng thái R) Mô hình này giả định rằng trạng thái T hầu như không có ái lực với cơ chất S (do đó KT >> KR,, c = 0). Dưới điều kiện này: n n L R )1( )1( a a ++ + = phương trình vận tốc rút gọn thành: (40) Nguyễn Xuân Hưng 2005 18 n n L R V v Y )1( )1( 1 1 max 0 F a aa a a ++ + =÷ ø ö ç è æ + == - Khi enzyme có bốn vị trí gắn cơ chất: 4 S 4 3 S 3 2 S 2 S 4 S 4 3 S 3 2 S 2 S max 0 ]S[]S[4]S[6]S[41 ]S[]S[3]S[3]S[ KKKK L KKKK V v +++++ +++ = Với KS = KR. Hệ thống V Trong hệ thống V, các trạng thái R và T có cùng ái lực với S, nhưng hoạt tính xúc tác nội tại khác nhau hay Rcatk > Tcatk . Phương trình tốc độ của hệ thống V với giả định cân bằng nhanh [Leskovac, 2003]: )1)(1( )1( max 0 F L gL V vY ++ + == a a Với Vmax = nkcatE0 và g là tỷ lệ hoạt tính xúc tác trong trạng thái T và R. Trong phương trình trên g Tcatk ). Đồ thị Mechaelis trong hệ thống V này là hypebol chỉ khi hỗn hợp 2 enzyme cùng Km nhưng Vmax khác nhau [Schuller et al., 1995; Grant et al., 1996]. Hệ thống K và V hỗn hợp Trong trường hợp này, các trạng thái R và T có ái lực khác nhau (c ¹ 1), cũng như hoạt tính xúc tác khác nhau ( Rcatk ¹ Tcatk hay g ¹ 1) với S. Phương trình tốc độ trở thành: nn nn cL cgLc V v Y )1()1( )1()1( 11 max 0 F aa aaa +++ +++ == -- Với Vmax = nkcatE0. Nếu g < 1 và c < 1, trạng thái R có ái lực và hoạt tính với S cao hơn. Cũng có trường hợp trong đó trạng thái ái lực cao hơn, hoạt tính xúc tác thấp hơn (g > 1 và c < 1) dẫn đến sự kìm hãm cơ chất [Leskovac, 2003]. 2.2.2 Các chất hiệu ứng gắn riêng Kìm hãm trong hệ thống K gắn riêng (cơ chất chỉ gắn với trạng thái R và chất kìm hãm chỉ gắn với trạng thái T) Giả sử trong hệ thống K, chất kìm hãm dị không gian có ái lực cao hơn với trạng thái T. Do đó cân bằng T0 R0 sẽ chuyển dịch về phía T0. Nếu cơ chất S chỉ gắn với trạng thái R (c = 0) và chất kìm hãm I chỉ gắn với trạng thái T ( RiK / TiK >>1), phương trình tốc độ trở thành: (41) (42) (43) (44) Nguyễn Xuân Hưng 2005 19 nn n L R V vY )1()1( )1( )1( 1 max 0 F ab aa a a +++ + = + == - Với nn n L R )1()1( )1( ab a +++ + = RKK SS ]S[]S[ ==a , TKK ii ]I[]I[ ==b Áp dụng với enzyme tetramer: ÷÷ ø ö çç è æ +++++÷÷ ø ö çç è æ ++++ +++ == 4 S 4 3 S 3 2 S 2 S 4 i 4 3 i 3 2 i 2 i 4 S 4 3 S 3 2 S 2 S max 0 F ]S[]S[4]S[6]S[41]I[]I[4]I[6]I[41 ]S[]S[3]S[3]S[ KKKKKKKK L KKKK V vY Phương trình 48 chứa cả [I] và [S], vì mỗi phối tử chỉ gắn với một trong hai trạng thái. Phương trình 45 cho thấy khi nồng độ S tăng, đồ thị của v0/Vmax - [I] trở nên sigmoid hơn (hình 11) [Leskovac, 2003]. Có thể dùng đồ thị để xác định Ki và L trong hệ thống này bằng cách biến đổi phương trình 45: nLvV v )1( 1 0max 0 ba a + = - Với ÷ ø ö ç è æ + = a aa 1maxmax VV và n)(1 L aa + =L Chuyển phương trình 49 về dạng tuyến tính: n i n n L K L v vV a a a +÷ ÷ ø ö ç ç è æ = - ]I[ 0 0max Do đó, nếu nồng độ cơ chất không đổi (a = [S]/KA), đồ thị n vvV 00max /)( -a - [I] có dạng đường thẳng cắt trục hoành và trục tung các giá trị Ki và n La tương ứng. (45) (46) (47) (48) (49) (50) (51) Nguyễn Xuân Hưng 2005 20 ▲Hình 11: Sự kìm hãm của enzyme tetramer trong hệ thống K. Các đường cong vẽ theo phương trình 45. Khi nồng độ cơ chất S tăng (a= [S]/Ks), các đường cong sigmoid hơn [Theo Leskovac, 2003]. Hoạt hoá trong hệ thống K gắn riêng (S gắn với cả hai trạng thái nhưng A chỉ gắn với trạng thái R) Giả sử trong hệ thống K, chất hoạt hoá dị không gian A gắn ưu tiên với trạng thái R không tại trung tâm hoạt động. Trong trường hợp đặc biệt này, RKA / TKA <<1. Chất hoạt hoá bắt chước (mimic) cơ chất bằng cách chuyển dịch cân bằng T0 R0 về phía R0. Phương trình tốc độ trong trường hợp này: n n n LV v Y )1( )1( )1( 1 max 0 F a g aa ++ + + == - Với RKK SS ]S[]S[ ==a và RKK AA ]A[]A[ ==g Cả S và A có thể gắn độc lập với phần dưới đơn vị R tạo thành rất nhiều khả năng hình thành phức giữa trạng thái R và phối tử. Phương trình tốc độ trong trường hợp này sẽ phức tạp hơn nhiều. Với enzyme dimer, phương trình tốc độ 52 có dạng: 2 A 2 S 22 2 AS 2 A 2 S 2 AS 2 A 2 A 2 S 2 S 2 A 2 S 22 2 AS 2 A 2 S 2 AS 2 S 2 S max 0 F ]A[]S[]A][S[2]A[]S[2]A][S[4]A[]A[2]S[]S[21 ]A[]S[]A][S[]A[]S[2]A][S[2]S[]S[ KKKKKKKKKKKK L KKKKKKKKKK V v Y +++++++++ +++++ == Với Vmax=2kcatE0 (52) (53) (54) Nguyễn Xuân Hưng 2005 21 Rút gọn phương trình 54 thành: 2 A 2 S 2 ASS max 0 F ]A[1]S[1 ]A[1]S[1]S[ ÷÷ ø ö çç è æ +÷÷ ø ö çç è æ ++ ÷÷ ø ö çç è æ +÷÷ ø ö çç è æ + == KK L KKK V vY Biến đổi tiếp ta được: 22 2 max 0 F )1()1( )1)(1( ga gaa +++ ++ == LV v Y Với a và g xác định giống như phương trình 53. Hình 12 vẽ hệ thống K trong trường hợp hoạt hoá. ▲Hình 12: Sự hoạt hoá của enzyme tetramer trong hệ thống K. Các đường cong vẽ theo phương trình 52. Nồng độ của chất hoạt hoá g tăng dần trong sự có mặt của các nồng độ cơ chất khác nhau, a, và ngược lại [Theo Leskovac, 2003]. L và KA trong hệ thống này tương tự với hệ thống trước đây. Với mục đích này, phương trình tốc độ thông thường của chất hoạt hoá 52 có thể chuyển thành dạng tuyến tính: nn n LLKvV v aa a 1]A[1 A0max 0 +÷ ÷ ø ö ç ç è æ = - Với amaxV và La có ý nghĩa theo phương trình 50. (55) (56) (57) Nguyễn Xuân Hưng 2005 22 Tương tác dị hướng với các phối tử dị không gian Bây giờ phân tích mô hình với khía cạnh các tương tác dị hướng giữa các phối t