Đề tài Enzym thực vật

O3 có độ ổn định cao hơn của ACT là 1,5 lần và hỗn hợp có thêm PEG còn có độ ổn định cao hơn hỗn hợp của nó 1,2 lần và cao hơn ACT tới 1,8-2,9 lần, đó là cơ sở quan trọng để tính tuổi thọ cũng như độ ổn định của sản phẩm thuốc ở điều kiện tự nhiên của Việt Nam (30 ± 200C, độ ẩm 75-85%), tuy thời gian thử mới có 2 tháng nhưng kết quả bước đầu cho thấy hoạt độ riêng của 2 hỗn hợp có độ ổn định cao, có ý nghĩa thiết lập công thức bào chế, pha chế viên có chứa CPE. Việc phối hợp chế phẩm BRO3 với ACT để sản xuất thuốc chữa viêm, chống phù nề mang lại hiệu quả về kinh tế, giảm được chi phí cho sản xuất, tăng tính khả thi để ứng dụng vào thực tế sản xuất, giúp giảm giá thành, ổn định giá bán sản phẩm và tăng độ ổn định của chế phẩm.  b. Enzym và bệnh nhân HIV/AIDS: Trong quá trình sinh sản trong tế bào người bệnh, virus suy giảm miễn dịch (HIV) cần một enzym hoạt hóa protease (protein - digesting enzym) để sao chép ngược nhằm cô đọng nhân protein để nhân bội virus. Thuốc điều trị HIV/AIDS theo cơ chế ức chế protein - digesting enzym này gọi là protease inhibitor hay anti-protease khá hữu hiệu nhưng rất đắt tiền và cũng gây nhiều phản ứng phụ. Các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có khả năng ngăn ức chế protease HIV và đã tìm thấy 19 hợp chất có tác dụng tương tự thuốc anti protease, trong đó bromelain trong dứa được coi là có giá trị nhất và có thể ăn, uống để trị HIV/AIDS. Thuốc cô đọng, bào chế từ enzym bromelain dứa này cũng rất đắt, nhưng người bệnh có thể dùng trực tiếp quả thơm, đọt thơm (phần trắng, mềm sau khi lột bỏ vỏ ngoài của chồi bên hoặc chồi ngọn quả thơm chứa enzym đậm đặc nhất). Các nhà bào chế chiết xuất enzym từ thân cây thơm. Enzym bromelain sẽ bị phân hủy khi đun nóng trên 600C. c. Nghiên cứu chế tạo thực phẩm chức năng từ nguồn nguyên liệu trong nước : Đây là kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học của Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ do Viện Hóa học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) tiến hành. Theo PGS-TS. Dương Anh Tuấn, Giám đốc Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ, bromelain là hoạt chất có hàng loạt tính năng như trị chứng khó tiêu, phòng các bệnh viêm phế quản, viêm khớp xương mãn tính, viêm xoang, làm sạch bên trong động mạch vành. Ngoài ra, bromelain còn có tác dụng chống viêm đường ruột và làm tăng khả năng đề kháng của cơ thể.     Trên cơ sở nghiên cứu chiết, tách, tinh chế thành công bromelain, nhóm nghiên cứu đã bổ sung hoạt chất curcumin được chiết, tách từ củ nghệ để sản xuất thực phẩm chức năng mang tên tinh nghệ - dứa. Cùng với tác dụng của curcumin là điều trị bệnh loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, viêm da, bảo vệ gan, mật..., sự kết hợp giữa curcumin và bromelain cho phép tinh nghệ - dứa có khả năng tăng cường miễn dịch và khả năng đề kháng của cơ thể, tăng khả năng phòng một số bệnh, đồng thời hỗ trợ điều trị các bệnh nan y nhờ hoạt tính sinh học cộng hưởng của curcumin và bromelain cùng các chất dinh dưỡng thiên nhiên.   Nhằm làm tăng giá trị sử dụng và tác dụng sinh học của curcumin trong các sản phẩm từ nghệ và bromelain từ quả dứa, nhóm nghiên cứu khoa học của GS.TSKH Trần Đình Toại và PGS.TS Dương Anh Tuấn thuộc Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, hợp tác với TS Lục Văn Puyvelde (Vương Quốc Bỉ) đã thành công trong việc nghiên cứu qui trình công nghệ chiết, tách, tinh chế bromelain từ quả dứa, đồng thời bổ sung vào sản phẩm curcumin làm thực phẩm chức năng đó là tinh nghệ - dứa. Qui trình công nghệ chiết, tách, tinh chế bromelain từ quả dứa được thực hiện trên các thiết bị của Viện Hóa học. Đây là lần đầu tiên sản phẩm thực phẩm chức năng này được nghiên cứu và sản xuất ở nước ta từ nguồn nguyên liệu nghệ và dứa sẵn có trong nước. Sản phẩm ở dạng bột, sử dụng đơn giản, thuận tiện và an toàn. Sản phẩm gồm có bột nghệ tinh (đã được chiết, tách loại bỏ tinh dầu, sáp và các chất nhựa) chứa hoạt chất chính curcumin và hoạt chất bromelain chiết từ quả dứa được phối trộn với nhau ở tỷ lệ thích hợp. Ngoài việc làm tăng tác dụng của curcumin, bản thân chất bromelain có khả năng làm tan biến các nội chất gây ra chứng nhồi máu cơ tim, tăng khả năng tiêu hóa và trị chứng khó tiêu, chống viêm đường ruột... Nhờ đó, việc sử dụng thực phẩm chức năng nói trên có tác dụng tăng cường miễn dịch và khả năng đề kháng của cơ thể, tăng khả năng phòng một số bệnh, đồng thời hỗ trợ trong điều trị các bệnh nan y, hiểm nghèo. Sản phẩm tinh nghệ - dứa nói trên đã được gần 100 bệnh nhân khác nhau sử dụng và đều cho kết quả rất tốt. Hiện nay Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Bộ Y tế đã cấp giấy chứng nhận sản phẩm thực phẩm chức năng “tinh nghệ - dứa” nêu trên đạt tiêu chuẩn chất lượng, vệ sinh, an toàn thực phẩm và được phép lưu hành. Hiện nay, dựa trên các kết quả nghiên cứu đã đạt được và được sự đầu tư kinh phí của Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, nhóm các cán bộ nghiên cứu này đang mở rộng hợp tác với các doanh nghiệp trong nước và quốc tế, để đẩy mạnh sản xuất sản phẩm tinh nghệ - dứa phục vụ tiêu dùng trong nước cũng như xuất khẩu, góp phần tích cực vào công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 1.4.2.Papain [3]: 1.4.2.1.Đặc điểm: Cấu tạo : Papain là một endoprotease chứa 16,1% N và 1,2% S. Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain là một chuỗi polypeptide gồm 212 amino acid không chứa methionine, đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí cysteine 25. Papain chưa hoạt hóa là hỗn hợp protein disulfurcysteine. Cấu trúc không gian: Phân tử papain có dạng cầu, mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt khe này, nhóm –SH của cysteine 25 ở bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn a chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử. Phân tử papain có hai nhân kỵ nước, mỗi nhân nằm ở một phần của papain và cả hai nhân đều bắt đầu với một chuỗi xoắn a. Ngoài ra trong phân tử còn chứa một số cầu nối nội phân tử. Cấu trúc tâm hoạt động của papain: Tâm hoạt động của papain gồm nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với amino acid là: Lys – Asp – Glu – Gly – Ser – Cys – Gly – Ser – Cys. Hình 1.7: Tâm hoạt động của papain Tính chất vật lý: Bột màu vàng hay nâu nhạt tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong nước hay glycerine, bền nhiệt) Bảng 1.7: Tính chất vật lý của papain: Tính chất vật lý Giá trị Điểm đẳng điện pI = 8,75 Hằng số lắng S20 2,42 ± 0,04 Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) 10,27 ± 0,13 Phân tử lượng 20700 Độ triền quang [a]D -66,7o Độ xoắn 17% Vòng hiệu ứng coton 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) 0,724 Trị số ma sát f/fo 1,16 Tính chất hóa học : Khi chưa được hoạt hóa, papain có hoạt lực rất yếu. Dưới tác dụng của các chất có tính khử, nhất là kèm theo sự có mặt của các chất kết hợp với kim loại, papain được hoạt hóa. Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng: Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase. Các endopeptidase thuỷ phân protein chủ yếu thành peptid: (-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH (-NH-CH(R)-COOH)i + (H2N-CH(R)-CO-)k i + k = n Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành các amino acid (H2N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH (H2N-CH(R)-COOH)n’ + (H2N-CH(R)-CO-)k’ n’ + k’ = n So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm carboxyl tự do. Papain có thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide có dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vị trí giữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y (có Phe nằm ở vị trí thứ hai trước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain. Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase. Hoạt hoá papain: Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta phải sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động. Do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glutation acid, hydrocyanic… Trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ. Bất hoạt: Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxi hoá như: O2, O3, H2O2, iodua acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác. Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó. Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. Papain tác dụng với chloromethyl cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên, papain rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ (độ quay cực hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6 - 8 M). Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain: Nhiệt độ: Papain là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC. Ở dạng dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ trên 100oC thì sẽ mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch vì cấu trúc tâm hoạt động của enzym đã bị phá hủy hoàn toàn. Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó. Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng, trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự tự phân hoặc oxi hoá. Papain dạng ổn định (có cấu trúc không gian ổn định) ở trạng thái khô có thể chịu được nhiệt độ sấy ở 115oC trong 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%. pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 10 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH 12. Tuỳ thuộc bản chất của cơ chất mà pH tối ưu của papain khác nhau. Papain dạng ổn định có thể chịu được pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút. Hình 1.8: Cơ chế ảnh hưởng của pH Hình 1.9: Cơ chế hoạt động Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70%, không bị giảm hoạt tính trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M, nhưng trong dung dịch TCA 10% papain bị biến đổi bất thuận nghịch. 1.4.2.2.Sản xuất [3]: a. Nguồn nguyên liệu: Quả đu đủ có tên khoa học là Carica Papaya Linn. Ðu đủ thuộc họ nhỏ Caricaceae có hai giống: họ Caricaceae, thường xếp chung vào họ Passifloraceae, người ta còn gọi Papaya theo tiếng Anh là Paw-paw. Ðu đủ là một loại quả nhiệt đới, được trồng nhiều ở các nước Nam Mỹ, châu Phi, Ấn Ðộ, Ðông Nam Á. Các nước có sản lượng thu hoạch đu đủ cao nhất thế giới là Brazil, kế đến là Nigeria, Ấn Ðộ... Bảng 1.8: Giá trị dinh dưỡng trên100 g chất quả Nước (%) 88 Năng lượng (Calories) 43 Protein (%) 0.6 Chất mỡ (%) 0.1 Carbohydrates (%) 10 Chất xơ 0.3 Bảng 1.9: %RDI Vitamin A 48 Vitamin B1 3.6 Vitamin B2 8.1 Niacin 2.2 Vitamic C 80 Calcium 2.4 Phosphorus 1.6 Sắt 3 Natri - Kali - * RDI, recommended daily intake: nhu cầu tiêu thụ trong 1 ngày do FDA Mỹ đề xuất, thiết lập dựa trên nhu cầu trung bình của một người nam, nặng 70kg, mức năng lượng tiêu thụ 2700kcal/ngày. Khoảng 1500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650 gram papain: Theo các nghiên cứu khoa học, papain có nhiều nhất chủ yếu trong nhựa cây và quả đu đủ xanh. Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. Nhựa là hỗn hợp enzym chứa các protease sau: papain, chymopapain A (gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B (gốc amino acid cuối là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thiolprotease, trong đó papain chiếm tới 95%. Điều kiện lấy nhựa: + Cây đang sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhựa nhiều. + Quả: lấy ở những quả xanh, vỏ mịn, từ 0,3 – 1kg, độ 10 tuần tuổi là tốt nhất. + Thời gian lấy nhựa: sáng sớm. Hình 1.10: Vườn đu đủ trồng để lấy nhựa Cách tiến hành: + Lấy nhựa ở quả xanh còn ở trên cây, dùng dao inox đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (không rạch sâu quá 2cm để dịch nước và tinh bột từ quả không bị trộn lẫn vào nhựa làm giảm chất lượng nhựa). + Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 - 6 phút, lấy nhựa xong phải đậy nắp kín, giữ trong tối và bảo quản lạnh trong thời gian chờ các công đoạn xử lý tiếp theo. Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho nhựa tiếp xúc lâu với không khí, đảm bảo hoạt tính papain có trong nhựa. Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào. Hình 1.11: Công nhân đang thu nhận nhựa từ trái đu đủ Lưu ý: Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì sẽ làm giảm chất lượng nhựa. Quả có thể được rút nhựa trong suốt 4 - 7 ngày, lần đầu có thể chỉ cần một rạch là đủ, những lần thu nhựa sau rạch 2 - 3 đường giữa những đường rạch trước đó. Cần tránh không cho nhựa tươi tiếp xúc vào da vì nó sẽ gây bỏng, không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm từ kim loại nặng như sắt, đồng… vì sẽ làm biến màu và giảm hoạt tính enzym. Lọ, dao, muỗng… phải được làm bằng nhựa hoặc thép không rỉ. Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới 5% ẩm. b.Quy trình công nghệ: Chuẩn bị : Do trong nhựa đu đủ tươi ngoài papain, chymopapain còn có một số loại enzym, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác nên để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm loại bỏ các tạp chất trên. Cách làm như sau: Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kĩ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300mL dung dịch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cystein hydrochloride trong 1000mL dung dịch NaOH 0,054M, kiềm được sử dụng để đưa pH dịch chiết tới 5,7). Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù thì gạn bỏ lớp nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300mL dung dịch cysteine. Rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích dịch chiết lên 1l. Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh trên giấy lọc Whatman số 1, thời gian lọc có thể rất dài. Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5,7. Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzym tiến hành trong điều kiện lạnh. Loại bỏ các chất không tan ở pH 9: Thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110mL dung dịch NaOH 1M để điều chỉnh pH của dịch chiết thu được ở trên lên pH 9. Lọc hoặc ly tâm ở 2600 vòng/phút trong 1 giờ để loại bỏ tủa xám tạo thành (tủa gây biến tính protein), thu dịch trích trong. Quá trình phân đoạn bằng (NH4)2SO4: Cho (NH4)2SO4 vào dịch enzym đến 40% độ bão hòa, sau 1 - 2 giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại để lấy chymopapain. Tủa được rửa lại một lần nữa với 400 - 500mL dung dịch (NH4)2SO4 40% độ bão hòa. Quá trình phân đoạn bằng NaCl: Hòa tan tủa trong 600mL dung dịch cysteine 0,02M, dung dịch thu được có pH 7-7,5, sau đó thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa, bỏ dịch lỏng. Kết tinh: Hoà tan tủa với 400mL dung dịch cysteine 0,002M ở nhiệt độ phòng thu được một dung dịch huyền phù có pH = 6,5. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, duy trì ở 4oC qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể. Tái kết tinh: Hòa tan tinh thể thu được ở bước trên trong nước cất ở nhiệt độ phòng tạo dung dịch có nồng độ protein khoảng 1%. Sau đó cho vào từ từ (đồng thời khuấy đều) dung dịch NaCl bão hòa (10mL/300mL dung dịch protein). Khi 75% thể tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch huyền phù được giữ ở 4oC qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/phút trong 4 - 5 giờ để thu nhận tinh thể. Hoạt độ riêng của enzym có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên. Để tăng hoạt tính enzym, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trong dung dịch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000Ao và đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc. Sấy chân không: Sấy chân không ở nhiệt độ 40oC thu nhận papain tinh chế. Nghiên cứu phương pháp mới thu nhận papain: Sử dụng dung dịch EDTA có pH = 7 thêm vào nhựa tươi đến nồng độ 1mM, sục nitơ vào trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng có lắc đảo. Dịch huyền phù đem ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ phòng bằng máy ly tâm Sorvall RC-2B để tách những chất không tan thu được dịch lỏng (phân đoạn 1) Chỉnh pH lên 9 bằng cách thêm từ từ dung dịch NaOH 0,1M khuấy liên tục, ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng để tách tủa. Phần dịch trong (phân đoạn 2) được bảo quản lạnh ở OoC. Sau 72 giờ bảo quản ở OoC, papain sẽ kết tinh tự nhiên (kết tinh lần 1), đem ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 20 phút ở OoC thu tủa (phân đoạn 3). Phân đoạn 3 được rửa 3 lần bằng một lượng dung dịch EDTA 1mM ít nhất có thể có pH = 7 ở 4oC. Sau đó tiến hành ly tâm ở 12100 vòng/phút trong 20 phút ở OoC thu tủa (phân đoạn 4). Phân đoạn 4 được hòa tan trong một lượng dung dịch EDTA 1mM, pH = 7 ở 37oC trong 30 phút với tỷ lệ 25mg protein/mL EDTA. Sau đó tiến hành kết tinh tự nhiên ở nhiệt độ OoC (tái kết tinh). Toàn bộ quá trình được tiến hành trong điều kiện khí trơ để chống lại sự oxi hoá của không khí. Hàm lượng protein được xác định bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 280nm. Phương Pháp Tinh Sạch Papain : +Điện di: Sử dụng gel polyacrylamide 12%, dung dịch đệm là b-alanine 34mM, pH = 4,3 và cường độ dòng điện không đổi là 4mA. Mẫu sẽ được chuẩn bị trong Tris-glycerol-b-mercaptoethanol cho vào nước sôi trong 40 giây. Gel sẽ được hiện màu bằng thuốc thử Coomassie-Blue R-250 và Brilliant Blue G-colloidal. +Lọc qua Sephadex G-75: Để xác định phân tử lượng của papain, ta dùng cột Sephadex G-75 có kích thước là 1,1x100 cm. Cột được cân bằng trước bằng dung dịch đệm gồm sodium phosphate 0,1M và dung dịch EDTA (ethylenediamine-tetraacetic acid) pH = 7. 1.4.2.3.Ứng dụng: a. Trong công nghệ thực phẩm: Papain được sử dụng rất rộng rãi trong công nghiệp chế biến thịt.Với phương pháp này, người ta có thể biến đổi những loại thịt cá rẻ tiền, khô cứng, những phần không ngon thành các chế phẩm có tính chất tốt hơn. Trong quy trình sản xuất bột cá cổ điển, người ta lợi dụng hệ enzym vi sinh vật thuỷ phân protease có sẵn trong trong cá để phân giải các protein trong thời gian dài và ở nhiệt độ thích hợp. Ngày nay, việc bổ sung chế phẩm enzym, đặc biệt là papain không những rút ngắn thời gian thuỷ phân mà còn ngăn ngừa được các vi khuẩn gây thối, do nhiệt độ hoạt động tối ưu của nó là 70oC. Bảng 1.10 : Mức độ phân giải (%) một số protein thực phẩm phụ thuộc trạng thái cơ chất của papain: Tên cơ chất Trạng thái cơ chất Sống Chín Casein 40,31 51,15 Lòng trắng trứng 0 35,42 Albumin bò 22,33 41,86 Protid cá 28,59 50,02 Protid tôm 38,22 50 Ngoài ra, papain còn ngăn ngừa sự làm đục bia và các loại nước trái cây khi ướp lạnh do nó phân huỷ các vết protein hoà tan. b.Trong y học: Là thành phần chính của các loại thuốc trị bệnh biếng ăn, ăn không tiêu. Papain khi kết hợp với lipase, amylase trợ giúp cho hệ tiêu hóa hoạt động hiệu quả. Còn được dùng để điều trị lở loét; làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu; chống kết dính sau phẫu thuật. Papain có tác dụng giảm độc tố với toxin và toxabumin: 18mg papain trong dung dịch trung tính được 10mg rixin là chất độc có trong hạt thầu dầu, 2mg papain trung tính được 4 liều độc của toxin uốn ván . Papain còn có tác dụng làm ngăn cản quá trình thụ thai ở phụ nữ. Qua kết quả nghiên cứu, họ đưa ra hai thuyết về tác dụng ngừa thai của quả đu đủ;: chất Papain trong đu đủ có tác dụng ức chế hoocmon (nội tiết tố) progesterone và làm ngăn cản quá trình thụ thai, thứ hai là chính tác dụng làm mềm thịt của papain có thể phá hủy màng tế bào phôi thai. Tiêu huỷ các dị vật thừa, các protein chết trong cơ thể. Hỗn hợp papain- bromelin- cellulase được sử dụng hiệu quả để phá sỏi thận. Papain còn có hoạt tính kháng sinh trong tri bệnh hen suyễn, viêm cuống phổi. Có khả năng sử dụng như một loại thuốc chữa bệnh giun kim, giun đũa. Ức chế một số vi khuẩn gram (+), vi trùng thương hàn, Staphylococus. Dung dịch papain cysteine salicilate có công dụng chữa bỏng. c. Trong các ngành công nghệ khác : Trong công nghệ sản xuất dầu cá, nếu cho papain tác dụng trước lên gan thì việc tách dầu sẽ dễ dàng hơn và chất lượng dầu cũng tăng lên. Khi tinh chế dầu gan cá ngừ, người ta tiêm papain vào gan cá trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin D và A hơn. Papain có thể sử dụng kết hợp với một số chất khác để điều chế ra mỹ phẩm chăm sóc da, giúp làm da mềm mại, tẩy các tế bào chết trên da. Papain làm mềm da trong công nghệ thuộc da. Len đã qua xử lý papain sẽ tăng độ sạch và nhuộm được những màu sống động. Papain là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su. Hình 1.12: Papain ứng dụng trong mỹ phẩm 1.4.2.4. Sản phẩm thương mại: Hình 1.13: Papain trong các loại dược phẩm Ficin [3]: 1.4.3.1. Đặc điểm: Ficin là một protease được tìm thấy trong nhựa của cây thuộc họ Ficus (sung, vải). Người ta thấy rằng hoạt tính của enzym ficin cao khi nhựa được thu nhận vào buổi sáng sớm do đó nhựa sung thường được thu nhận vào buổi sáng sớm, sấy khô thường được dùng trong công nghiệp thực phẩm. Tính chất của Ficin Cấu tạo hóa học Ficin là một protease thực vật trong cấu trúc bậc một có chứa sulfhydryl. Trình tự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng gần giống với papain và bromelin. Trình tự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng của ficin như sau: Pro-Leu-Arg-Gln-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys-Tryp- Tùy theo nguồn thu nhận enzim ficin từ các loại sung khác nhau, tiến trình xác định khác nhau mà thành phần hóa học của enzim ficin sẽ khác nhau Bảng 1.11: Thành phần amino acid của phân tử enzyme ficin STT Amino acid Tên tác giả nghiên cứu Marini Metrione Gould Englund 1 Lysine 7 9 9 5 2 Histidine 2 2 2 1 3 Amonia - 52 52 25 4 Arginine 8 10 10 10 5 Aspartic acid 20 21 21 17 6 Threonine 10 10 10 8 7 Serine 13 16 16 14 8 Glutamic acid 22 25 25 25 9 Proline 11 13 13 11 10 Glycine 28 32 32 28 11 Alanine 19 21 21 20 12 Half-cystine 7 9 9 8 13 Valine 15 19 19 18 14 Methionine 3 4 4 5 15 Isoleucine 10 10 10 7 16 Leucine 17 17 17 15 17 Tyrosine 14 15 15 15 18 Phenylalanine 5 6 6 5 19 Tryptophan - 9 9 2 Tổng số gốc aminoacid* 206 211 300 243 * số lượng các gốc aminoacid trên 1 mol protein Tính chất vật lí: Tùy theo nguồn thu nhận enzim mà các tính chất vật lí của chúng không giống nhau. Tuy nhiên sự khác nhau này không lớn lắm. Một số tính chất vật lí của ficin có thể được trình bày như sau: Trọng lượng phân tử: 23.000-27.000 Da Nhiệt độ hoạt động: 30-80o. Nhiệt độ tối thích: 50-65oC Hệ số sa lắng: 2.5-2.7S Điểm đẳng điện: 9-10 Không tan trong hầu hết dung môi hữu cơ nhưng tan một phần trong nước và glycerine Bảng 1.12: Tính chất vật lí của ficin Nguồn thu nhận Phương pháp tinh sạch Hệ số sa lắng (S0) Trọng lượng phân tử Điểm đẳng điện Hệ số tinh sạch A280, A260 Hệ số tắt Bước sóng hấp thu (nm) Tác giả F.glabrata Tủa muối sắc ký trên CM-cellulose,pH7 25.500750 23.800700 21,1 267 Englund F.glabata Tủa muối 2,56 26.000 Bernhard và Gulfreund Liener F.glabata Tủa muối sắc ký trên CM-cellulose, pH4.4 2,61 F.carica var kadota Các hợp phần có hoạt tính được tách từ nhựa sung bằng phương pháp sắc ký trên CM-cellulose, pH7 >9,6 1,88 20,2 Kramer và Whitaker F.anthelmitica 26.500 Marini bettolo Tính chất hóa học pH hoạt động của ficin rộng: 4-9.5(dịch nhựa sung có pH 5), pH tối thích của ficin phụ thuộc vào loại cơ chất của enzim: gelatin: pHopt=5 casein: pHopt=9.5 hemoglobin: pHopt=7 Ở dạng nhựa tươi, ficin dễ bị oxi hóa bởi không khí làm cho dịch nhựa chuyển sang màu hồng nâu hoặc hồng và đồng thời hoạt tính xúc tác bị giảm. 1.4.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của ficin - Các yếu tố hoạt hóa: - Khi có mặt của kim loại kiềm, hoạt tính thủy gỉai của protein của ficin tăng lên. Hoạt tính của ficin cũng sẽ tăng lên khi nó kết hợp với một trong số cá