Đề tài Enzyme cố định và các ứng dụng

amino của chất mang, với các nhóm amino và các nhóm carboxyl của E. Phương pháp này được sử dụng đối với chất mang cellulose. Tạo liên kết peptide bằng phương pháp azide acid Phương pháp này dùng trong hóa tổng hợp peptid. Ví dụ dùng chất mang là CM-cellulose, phản ứng tiến hành như sau: Phương pháp diazot hóa Phương pháp này được sử dụng đối với các chất mang có các nhóm amino thơm, nhóm amin của nó được diazot hóa bằng acid nitrous, tạo thành dẫn xuất diazonium. Dẫn xuất này phản ứng với E tạo E không tan. Ví dụ dùng chất mang là 4-aminobenxyl cellulose, phản ứng tiến hành như hình. Cố định E trên bột thủy tinh bằng liên kết cộng hóa trị Chất mang bột thủy tinh có nhiều ưu điểm như chịu được các điều kiện khắc nghiệt, có cấu trúc bền vững, vì vậy rất thuận tiện trong công nghiệp. Hạn chế chính của chất mang này là có tính “trơ” về hóa học. Vì vậy để có thể sử dụng chúng một cách có hiệu quả, cần gắn thêm các nhóm phản ứng vào bề mặt của nó. Có thể trình bày tóm tắt quá trình gắn E vào bề mặt bột thủy tinh không có lỗ. Chuẩn bị bột thủy tinh, hạt có đường kính khoảng 1mm, quá trình gắn E được thực hiện qua 5 bước chính như sau : Hoạt hóa bề mặt thủy tinh bằng phản ứng với silane để đưa nhóm amin vào. Phản ứng tiếp với p-nitrobenzoylchloride, nhóm nitro của vòng thơm sẽ được chuyển hóa bằng các phản ứng khác. Khử nhóm nitro thành nhóm amino Cho tác dụng với acid nitrous, nhóm amino chuyển thành cation diazonium Nhóm diazonium sẽ kết hợp với gốc tyrosine trong phân tử E. Cố định E vào polyamide bằng liên kết cộng hóa trị Nylon là polyamide kỹ thuật quan trọng nhất, là polymer mạch dài được tạo thành do phản ứng ngưng tụ với lượng tương đương của acid adipic và hexanediamine n HOOC-(CH2)4-COOH + n H2N-(CH2)6-NH2 [-NH-CO-(CH2)4-CO-NH-(CH2)6-]n Ưu điểm của nylon là bền dưới tác dụng của vi sinh vật, và cũng có tính ưa nước ở mức độ nhất định. Vì vậy, có thể sử dụng nylon để bọc E, nhưng khó tạo được liên kết cộng hóa trị giữa E và nylon vì nó chỉ có hai nhóm ở hai đầu phân tử là có thể phản ứng với E. Để tăng số nhóm có khả năng kết hợp với E, cần thủy phân một số liên kết amide trong polymer để tạo thành các nhóm amino và carboxyl tự do có thể kết hợp với E. Cố định E vào các nhóm amin sau khi thủy phân một phần polyamide, quá trình này gồm có 4 bước Xử lý polymer để làm tăng diện tích bề mặt và tăng khả năng tiếp xúc với nước Cắt đứt một số liên kết amide Hoạt hóa các nhóm amin hoặc nhóm caborxyl tự do Gắn E vào polyamide đã được hoạt hóa Những điều cần lưu ý khi thực hiện việc cố định E Khi lựa chọn phương pháp và thử nghiệm cố định E cần lưu ý các điều sau đây: E phải ổn đinh trong điều kiện xảy ra phản ứng: quan trọng nhất là hoạt lực E và độ bền của nó theo thời gian phản ứng, điều này quyết định hiệu suất phản ứng, hiệu suất tổng thu hồi và hiệu quả của toàn bộ quá trình (giá thành, giá trị khoa học và thực tiễn, giá trị kinh tế - xã hội) Nếu có thể được thì các hợp chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang (giữa chất mang và E) sẽ chủ yếu tương tác với những nhóm chức năng nằm ngoài trung tâm hoạt động của E. Nếu điều kiện này không thực hiện được hoàn toàn thì chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang phải có kích thước lớn không cho phép nó xâm nhập, ảnh hưởng đến trung tâm hoạt động của E. Trung tâm hoạt động của E phải luôn được bảo vệ bằng các phương pháp khác nhau. Ví dụ như E với trung tâm hoạt động có nhóm – SH thì cần xử lý sơ bộ bằng glutation hay systein và chỉ tái hoạt hóa E sau khi đã gắn nó vào chất mang. Hoặc có thể che chắn tâm hoạt động bằng cách bổ sung vào hỗn hợp phản ứng cơ chất đã được bão hòa bởi E (nồng độ cao nhất mà E có thể thực hiện được phản ứng xúc tác) Khi rửa thiết bị phản ứng để phụ hồi E, không được làm ảnh hưởng xấu đến hoạt tính của E đã được gắn vào chất mang. Khi lựa chọn chất mang cần phải để ý đến phản ứng E sẽ diễn ra cụ thể, sao cho không làm ảnh hưởng thậm chí hủy hoại chất mang và sản phẩm phản ứng không được ức chế hoạt động của E. Ví dụ không thể gắn E cellulose vào chính chất mang là cellulose và các dẫn xuất của nó cũng không thể tiến hành phản ứng thủy phân cellulose trên chính chất mang này. Cần lưu ý đến độ bền của chất mang (bền cơ học, thủy lực học, bền nhiệt, bền gel) nhất là khi phản ứng trong các cột công suất lớn. Phân tích chế phẩm E không tan Khi cố định E trên chất mang, cũng như trong quá trình bảo quản và sử dụng chế phẩm, để biết có bao nhiêu, còn bao nhiêu E trên chất mang, hoạt động của nó biến đổi ra sao cần xác định: Protein Hoạt độ của chế phẩm 3.1. Xác định protein Có nhiều phương pháp khác nhau nhưng nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp sử dụng acid bicinchoninic (BCA) cho kết quả tốt hơn cả. Nguyên tắc Các ion Cu2+ bị protein khử đến Cu1+ trong môi trường kiềm, Cu1+ kết hợp với 2 phân tử BCA tạo thành phức màu đỏ tía. Phản ứng có độ nhạy cao hơn phản ứng biuret nhiều lần: độ nhạy của phản ứng biuret là 0.1- 0.8 mg trong phương pháp BCA có độ nhạy < 10mg, và cũng không quá nhạy đối với các detergent ở nồng độ cao. Cách thực hiện Lấy một mẫu E không tan có khối lượng xác định cho vào 1ml dung dịch thuốc thử C và giữ ở 370C, lắc nhẹ, trước khi so màu cần loại bỏ phần không tan. Xác định hoạt độ của E không tan Phương pháp quang học Cách thực hiện: Lấy một lượng xác định E không tan, cho vào bình phản ứng cùng với dung dịch đệm, cơ chất, cofactor, giữ ở nhiệt độ xác định, hỗn hợp phải khuấy liên tục. Để đo vận tốc phản ứng, nếu chất mang E đủ nặng, dễ lắng, có thể dừng ngay phản ứng, gạn lấy phần trong, đo độ hấp thụ quang học, sau khi đo phải cho dung dịch vào lại bình phản ứng để giữ cho thể tích hỗn hợp phản ứng không thay đổi. Trường hợp chất mang không dễ lắng, có thể lọc hay ly tâm, nhưng phải làm thật nhanh, sau khi đo phải cho cả dịch trong và cặn trở lại bình phản ứng. Như vậy sẽ nhận được giá trị ở các thời gian khác nhau. Để tính toán tốt hơn cả là tính trên khối lượng khô, hoặc bề mặt tiếp xúc của chế phẩm. Để đo liên tục phản ứng E có thể dùng thiết bị chuyên dụng: hỗn hợp phản ứng được bơm liên tục vào bình phản ứng trong vòng tuần hoàn khép kín, dịch sau khi đi qua cuvette để đo mật độ quang học. Hình 5: Bình phản ứng E để đo vận tốc phản ứng E không tan Ưu và nhược điểm của E không tan 4.1. Ưu điểm E không hoà tan có đầy đủ tính chất của một E, tuy ở dạng không hoà tan mà vẫn giữ được hoạt động xúc tác, ưu điểm nổi bật của E không hoà tan so với khi ở dạng hoà tan là: Có thể sử dụng lặp lại nhiều lần một lượng E xác định (60 – 70 lần), nên làm giảm đáng kể giá thành chế phẩm E, và có thể sử dụng liên tục trong các hệ thống dòng chảy. pH thích hợp của các E này khác nhau, vẫn có thể tìm được điều kiện để các E hoạt động tốt. Không trộn lẫn với các phẩm vật khác của phản ứng và dễ dàng tách ra khỏi hỗn hợp phản ứng, do đó có thể ngừng phản ứng ở bất kì giai đoạn nào. E không tan có độ bền đối với các yếu tố hóa lý (nhiệt độ, pH, áp suất…) cao hơn khi ở dạng hoà tan. Ví dụ: cố định protease làm tăng độ bền nhiệt gấp chục nghìn lần. Sau khi được cố định không những độ bền với nhiệt của E tăng lên mà phạm vi nhiệt độ tối thích của E cũng được mở rộng. Nhiệt độ cao làm cho E bị biến tính, cấu trúc bậc ba của E bị phá vỡ và E bị mất hoạt tính. Khi E được cố định nhờ nhiều liên kết gắn với chất mang quá trình biến tính sẽ bị ngăn cản, làm cho E chịu được nhiệt độ cao. Trong một số trường hợp đối với các E thủy phân protein, ví dụ papain và trypsin, sự cố định làm ngăn cản một phần hoặc hoàn toàn hiện tượng tự phân. Điều này có ý nghĩa thực tế vì nó giúp làm tăng thời gian làm việc của E. Có thể thực hiện chuỗi phản ứng bằng cách gắn nhiều E lên một chất mang nhằm giúp giảm chi phí, đẩy nhanh quá trình. Ví dụ : A E1 B E2 C E3 D Thiết lập mô hình để nghiên cứu các E liên kết với màng trong hệ thống sống, nghiên cứu ảnh hưởng của vi môi trường lipid đối với hoạt động của các enzyne trong màng, giúp chúng ta mô hình hóa hệ thống sống. 4.2. Nhược điểm Khi E được cố định trên chất mang, hoạt động của nó bị giới hạn trong một vi môi trường nhất định. Tính chất của E không hoà tan còn phụ thuộc vào phương pháp cố định và bản chất của chất mang. Mỗi loại E có chất mang phù hợp Phải có thiết bị dùng để cố định E có hiệu suất cao Hoạt độ riêng thấp hơn ở dạng hoà tan Hằng số Km biểu kiến có thể thay đổi do ảnh hưởng trường tĩnh điện của chất mang Độ bền của E không tan có thể không thay đổi, tăng hoặc giảm tùy thuộc vào khuynh hướng ảnh hưởng của vi môi trường pH thích hợp của mỗi E có thể thay đổi, nhất là các chất mang có điện tích ỨNG DỤNG CỦA E CỐ ĐỊNH Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, E và các chế phẩm của nó ngày càng được sản xuất nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, da giày, dệt may, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Cho tới nay, người ta đã biết được khoảng 3.000 E. Tất cả các E đều được gọi tên và được xếp vào “Hệ thống phân loại” gồm 6 lớp (class), trong các lớp có các lớp phụ (subclass), nhóm (section). Hằng năm, lượng E được sản xuất trên thế giới vào khoảng trên 300.000 tấn, với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Phần lớn, E được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại E đơn cấu tử, xác tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là E thủy phân, dùng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Thấy được vai trò quan trọng của E - chất xúc tác quan trọng trong các phản ứng hóa học ở mọi cơ thể sống. Ở Việt Nam, vấn đề về nghiên cứu E học cũng đã được quan tâm, thu hút sự quan tâm của nhiều nhà sinh hóa, sinh học thực nghiệm cũng như các nhà khoa học trong lĩnh vực khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch E, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu về cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của E, khả năng ứng dụng vào đời sống của E và các sinh phẩm từ nó. Các E thường được sử dụng trong dung dịch, sau đó không thu hồi được, mà việc chiết tách chúng rất tốn kém làm giá thành cao. Chính vì khắc phục nhược điểm của E hòa tan, có thể sử dụng lặp lại nhiều lần (60 đến 70 lần) nên E cố định mang lại hiệu quả cao khi sản xuất ở quy mô công nghiệp, tiết kiệm chi phí sản xuất. Đặc biệt, khi dùng các E cố định thì sản phẩm không bị lẫn E nên tinh sạch hơn và đỡ tốn kém hơn. Vì thế, khai thác ưu điểm này, E cố định được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phẩm, y dược, xử lý chất thải… 1. Trong công nghiệp 1.1. Sản xuất sirop giàu fructose E cố định glucoisomerase Ứng dụng công nghệ sử dụng E chuyển hóa này đã mang lại nhiều ích lợi đáng kể, đặc biệt là ở các nước có nguồn nguyên liệu tinh bột dồi dào. Một trog những ví dụ điển hình về ứng dụng các E cố định với quy mô lớn trong công nghiệp là sản xuất chất ngọt từ bột. Mỹ đã sản xuất hơn 8 triệu tấn sirop giàu fructose. Chất bột dưới tác dụng của α – amylase biến thành dextrin, chất này nhờ glucoamylase thủy giải đến tận cùng tạo glucose có độ ngọt thấp hơn đường thường là saccharose hay sucrose. Glucose được biến thành fructose nhờ glucoseisomera tạo ra sirop glucose – fructose ngọt hơn đường saccharose. Phản ứng do glucoseisomerase thực hiện là thuận nghịch. Quá trình được thể hiện như sau: α- --z Việc sử dụng enzyme không tan để sản xuất sirop giàu fructose đã được ứng dụng trong sản xuất dịch fructose nồng độ cao từ bột ngô (HFCS), mỗi năm khoảng 5 triệu tấn. Khi sử dụng glucoamylase và glucoisomerase không tan trong hệ thống phản ứng liên tục, giá thành của enzyme chỉ chiếm 0,28% giá thành sản phẩm cuối cùng. Giá thành sản phẩm sản xuất theo phương pháp này chỉ bằng 1/10 khi sử dụng enzyme ở dạng tự nhiên. Khoảng năm 1970, ở Mỹ dùng 6 loại chế phẩm glucoisomerase gắn với chất mang khác nhau, theo các phương pháp khác nhau, đến năm 2002, ở Mỹ chỉ dùng 4 loại chế phẩm không tan của enzyme này tách ra từ Streptomyces. Hai chế phẩm ở dạng hạt, cố định bằng tương tác tĩnh điện với chất mang tích điện (DEAE - cellulose và chất mang làm từ silic dioxyde), hai chế phẩm khác là chế phẩm không tan của tế bào Streptomyces cố định bằng liên kết chéo đồng hóa trị nhờ glutaraldehyde. Để tăng tỷ lệ fructose lên gấp 1.7 lần đường ăn, các glucoisomerase cố định được sử dụng trong bioreactor. Dung dịch glucose khi qua bioreactor chứa glucoisomerase sẽ biến thành fructose rồi thoát ra ngoài để được thu hồi, nhờ vậy dịch sirop glucose – fructose từ bột giàu fructose chứa đến 42% fructose, 50% glucose và 8% các đường khác. Dịch sirop này có thể được xử lý bằng nhiều cách khác nhau để tạo thành một số sản phẩm có hàm lượng fructose khác nhau: 55%, 70%, 90% hoặc tinh thể fructose. Từ những kết quả trên cho thấy enzyme cố định thể hiện rõ vai trò ưu việt của nó. Hình 6: Bioreactor sử dụng E hoặc tế bào cố định [3] Một số chế phẩm thương mại sử dụng E glucoseisomerase được liệt kê trong bảng sau: [4] Các enyme glucoisomera thường được sử dụng ở dạng E cố định liên kết với cầu nối glutaraldehyde, trong một số chế phẩm cobal và magiesium làm tăng hoạt tính. E glucoisomerase được tách chiết từ xạ khuẩn Actinomyces, khi bảo quản cần tránh O2. Trong quá trình chuyển gluco thàng fructo vẫn còn 1 lượng ít glucose, cần tiến hành hồi lưu để thu sản phẩm tinh sạch. E cố định invertase Với các nước ở vùng nhiệt đới như Ấn Độ, lượng mía trồng rất phong phú, các sirop fructose cao có thể thu được từ một quá trình đơn giản hơn đó là thủy phân sucrose nhờ E invertase. So với sucrose đường nghịch hoạt tính và độ hòa tan cao hơn. Trong lịch sử, invertase có lẽ là E đầu tiên được cố định, nghiên cứu và ứng dụng. Một số lượng lớn các hệ thống invertase cố định đã được nghiên cứu và cấp bằng sáng chế. Việc sử dụng các tế bào nấm men nguyên vẹn để thu E invertase đã được chứng minh bởi D'Souza và Nadkarni vào năm 1978. Một nghiên cứu có hệ thống đã được tiến hành trong phòng thí nghiệm để tạo ra đường nghịch (invert sugar) bằng cách sử dụng E cố định invertase hay sinh khối của các tế bào nấm men 17-19, 38, 45, 55, 68, 69, 71, 98. Những nghiên cứu toàn diện thực hiện trên các khía cạnh khác nhau về việc sử dụng tế bào nấm men nguyên vẹn để cố định E đã thu được nhiều kết quả đáng kể trong công nghiệp sản xuất đường nghịch (Glucose và Fructose). Hiện nay, xu hướng trong công nghiệp là sản xuất chất ngọt theo phương pháp dùng các E cố định này, vì ít tiêu tốn năng lượng hơn và không phụ thuộc mùa vụ như đường làm từ mía vì sản xuất đường mía phải quy hoạch vùng nguyên liệu cho nhà máy, đến mùa thu hoạch phải tốn nhiều năng lượng chế biến, chặt và chuyên chở khối lượng lớn, ép mía, nấu cô đặc, kết tinh, li tâm và thu đường, chỉ khoảng 10% như vậy sản lượng là rất thấp. Ngoài ra, còn được ứng dụng trong công nghệ giải khát do giảm lượng đường gần 2 lần, dẫn đến giảm chi phí nguyên liệu để từ đó giảm giá thành các sản phẩm như pepsi, cocacola... Sử dụng trong chế biến thức ăn cho người ăn kiêng, do fructose không gây bệnh đường và không gây sâu răng, giúp giả quyết nhu vầu cần thiết của người bị bệnh tiểu đường. 1.2. Sản xuất sữa phi lactose Lactose là một disaccharic có công thức cấu tạo galacto – O – gluco được gọi là đường sữa loại đường có này có độ ngọt thấp (bằng 30% với đường saccharic ở cũng nồng độ), độ hòa tan kém gây nên hiện tượng sạn đường trong sữa. Một bộ phận người sử dụng không có khả năng tiêu hóa hấp thụ được sữa này. Như ta biết, những người lớn tuổi thường được khuyến khích nên uống sữa vì cơ thể họ không có E phân hủy lactose trong sữa. Mặc khác đường sữa hầu như được thải cùng với sữa, nếu đem chế biến các sản phẩm sữa chua, phomat sẽ gây ô nhiễm môi trường. Như vậy nếu thủy phân lactose thành 2 monosaccharic cấu thành nó sẽ mang lại hiệu quả lớn hơn, nâng cao chất lượng sữa, lọai bỏ hiện tượng sạn sữa, nâng cao độ tiêu hóa và các monosac sẽ được vi sinh vật sử dụng khi lên men sữa. b-galactosidase E cố định trong công nghiệp sữa phi lactose, thường sử dụng b-galactosidase. Sự có mặt của b-galactose trong sữa đã khắc phục được vấn đề này một cách đơn giản. Chính vì vậy, những người “tiêu hóa khó” với lactose hoàn toàn có thể yên tâm khi sử dụng những chế phẩm sữa được bổ sung E thủy phân lactose. Điều này có ý nghĩa rất lớn đối với một đất nước như Ấn Độ - nơi có số người không dung nạp được lactose rất lớn. Lactose thủy phân còn tăng cường vị ngọt, tính hòa tan của đường. Và từ đó, mở ra trong tương lai nhiều tiềm năng phát triển đa dạng hơn các chế phẩm từ sữa. Chất thủy phân lactose có thể được sử dụng như là một thành phần của sữa, đồ uống có pha các chế phẩm sữa, các chất liệu thức ăn, hoặc có thể được lên men để sản xuất ethanol và rượu. Như vậy, ta đã chuyển một phụ gia rẻ tiền vào những thực phẩm dinh dưỡng cao, chất lượng tốt Các chuyên gia ngành sữa tại Anh và xứ Wales, đã thiết lập E cố định b-galactosidase tại nhà máy ở Bắc xứ Wales để sản xuất lactose-hydrolysed. Các b-galactosidase được chiết xuất từ nấm, sau đó được ứng dụng và sản suất theo quy mô công nghiệp. Lactase Bên cạnh việc sản xuất E cố định b-galactosidase, người ta còn cố định E lactase cho cùng hiệu quả trên. Dưới tác dụng của E lactase của ruột non thì Với các bệnh nhân về đường tiêu hóa hay trẻ em suy dinh dưỡng, kém ăn, do hệ E lactase kém, hoạt động yếu nên việc sản xuất loại sữa lactose đã được thủy phân sẽ giúp dễ tiêu hóa hơn. E latase được sinh tổng hợp từ 1 số loài nấm mốc và nấm men. Hãng SNAM progetti (Ý) sử dụng bioreactor dung tích 10l chứa 4 kg latase cố định trong sợi acetat celluloza. Trước hết sữa được tiệt trùng cực nhanh ( 42 oC, 3s), làm lạnh nhanh đến 4 – 7oC rồi cho chảy qua bioreactor với vận tốc 7lít/phút. Sản phẩm sữa bảo quản tốt trong 3 đến 4 tháng ở 4oC. Hiện nay hãng sản xuất hàng ngày 10 tấn sữa phi tactose. Các công ty đầu tiên thương mại hydrolyse - lactose trong sữa bởi E cố định lactase đã được Centrale del Latte của Milan (Italia) sử dụng công nghệ snamprogetti. Quá trình này sử dụng một lactase trong sợi tổng hợp. Hãng Corning Glass từ năm 1978 sử dụng E latase liên kết đồng hóa trị với silicagel để xử lý dịch trong sữa với công suất 30 tấn / ngày. Một số chế phẩm thương mại sử dụng E latase được liệt kê trong bảng sau:[5] 1.3. Dùng E cố định trong việc biến đổi aminoacid Trong quá trình tổng hợp hóa học hay lên men để sản xuất các acid amin, nhược điểm lớn là cho ra các sản phẩm raxemic, tức là hỗn hợp của 2 dạng đồng phân quang học D, L. Trong đó chỉ có dạng L mới có hoạt tính sinh học cao, có ý nghĩa trong khoa học hóa sinh. Nếu sử dụng phương pháp hóa học hay kết hợp với sinh tổng hợp bằng cách lên men hai pha sẽ rất tốn kém, không khả thi. Từ năm 1969 hãng Tanabe Seizaku của Nhật Bản đã sử dụng E cố định amino acylase, là loại E đồng phân hóa chuyển acid amin từ dạng D sang dạng L.Từ đó chuyển hóa hoàn toàn hỗn hợp D, L acid amin. Quá trình thực hiện qua các bước sau: Bước 1: hỗn hợp D, L – amino acid được xử lý acetyl anhydride thành D, L - acyl aminoacid. Bước 2: D, L - acyl amino acid dưới tác động đặc hiệu của L – amino acid acylase cố đinhj cắt nhóm acyl tạo L – amino acid có độ hòa tan khác với D – acyl amino acid. Bước 3: tách L – amino acid khỏi D – acyl amino acid. Bước 4 : D – acyl amino acid có thể được triền quang hóa rồi tái sử dụng Trong đó ezyme amino acylase được cố định trên DEAE Sephadex bằng liên kết ion trong thời gian bán hủy là 65 ngày ở 50oC. E sau khi gắn vào chất mang có hoạt tình 50 – 60% hoạt tính E tự do. Chế phẩm E cố định được nhồi vào bioreactor. Sau 65 ngày làm việc sẽ được tái sinh với dịch E mới, cứ như vậy sau 8 năm mới phải thay chất mới, tiết kiệm được một lượng lớn chi phí và công sức trong sản xuất. Hình 7: Sơ đồ công nghệ sản xuất L axit amin của hãng TANABE SEIZAKY [6] E aspartase chuyển dạng L – aspartic L – aspartic acid được sử dụng rộng rãi trong các loại thuốc và như là một phụ gia thực phẩm. Là cơ chất trung gian của rất nhiều quá trình chuyển hóa sinh tổng hợp các acid amin khác rất quan trọng trong dinh dưỡng động vật và chế biến thực phẩm như sản xuất acid L – valin, tổng hợp acid α – xetoglutaric là tiền chất để chuyển hóa thành acid L – glutamic. Cơ chế hóa sinh của sự tạo thành acid aspartic là quá trình tạo liên kết đồng hóa trị giữa NH3 với acid fumaric bởi E aspartase theo phương trình sau: Các E đã được cố định bằng cách sử dụng toàn bộ tế bào E.coli. Đây được coi là ứng dụng công nghiệp đầu tiên của tế bào vi khuẩn cố định. Quá trình ban đầu được cố định trên gel polyacrylamit sau này được thay thế bằng gel carageenan. Từ năm 1973, hãng TANABE SEIZAKY đã sử dụng tế bào có chứa E aspatase và cố định nó trong gel polyacrylamit với bán chu kỳ hoạt động là 120 ngày ở 37oC. Sau quá trình ứng dụng với cột bioreactor dung tích 1m3 trên đã sản xuất được 1700 kg acid L – aspartic / ngày với chi phí bằng < 60% so với công nghệ cũ (chuyển hóa bằng phương pháp hóa học). E thermolysin sản xuất aspartame L – aspartic acid là thành phần gốc của aspartame, được phát hiện vào năm 1969, có độ ngọt gấp 200 lần đường ăn, được tạo thành từ phenylalanime và aspartate, nhưng α – aspatame có vị ngọt, còn β – aspartame lại có vị đắng. Người ta đã sử dụng thermolysin trong môi trường nước, E này xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide, nhưng nếu bảo vệ nhóm amin của L - aspartame và khóa nhóm carboxyl của Phe, nó sẽ xúc tác cho phản ứng ngược, tức là tổng hợp liên kết peptide, tạo thành aspartame ở dạng muối kết tinh, D - phenyalanine methyl ester còn lại trong dung dịch, racemic hóa thành dạng L và được tái sử dụng như trên. Aspartame được sử dụng như chất đường cho người ăn kiêng. Sản xuất acid L – malic bằng E fumarase hydratase cố định Acid malic được sử dụng để thay thế acid citric trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Hiện nay, đây là một thì trường rộng lớn, giàu tiềm năng, mang lại lợi ích kinh tế lớn. Vì vậy việc sản xuất acid L – malic thay acid citric bằng cách sử dụng E cố định ngày càng được quan tâm hơn. Dưới tác dụng của E fumarase, acid fumaric được chuyển hóa thành acid malic. Ở Nhật Bản, các công ty như Tanabe Seiyaku và Kyowa Hakko đã sử dụng E fumarase cố định để sản xuất acid malic. Nguồn E được lấy từ các vi khuẩn B.flavus và được cố định trong gel polyacrylamde hay trong sợi triacetat celluloza. 2. Ứng dụng trong y học Ứng dụng trong phân tích chất Cố định E Glucose-oxidase Một ứng dụng khác của E cố định trong lĩnh vực y học là thực hiện định lượng đường máu (Glucose) hiệu quả hơn. Nồng độ glucose bình thường trong máu người khoẻ mạnh, lúc đói là: 4,4 – 6,1 mmol/l (0.8-1.1g/l). Trước kia, định lượng đường máu theo phương pháp Folin - Wu là phương pháp định lượng không đặc hiệu dựa vào tính khử của đường cho nên khi trong máu bệnh nhân có các chất khử khác (ví dụ vitamin C) nó sẽ tạo nên kết quả cao hơn nồng độ đường thực có. Hiện nay, định lượng đường máu đặc hiệu là phương pháp enzym - màu. Đó là phương pháp định lượng đường máu dựa trên phản ứng xúc tác của gluco-oxidase: oxy hóa glucose thành acid gluconic và peroxidhydrogen (H2O2). H2O2 tác dụng với 4 - aminoantipyrine và phenol dưới xúc tác của peroxidase (POD) tạo thành chất có màu hồng là quinoneimine và nước. Đo mật độ quang của đỏ quinoneimine ở bước sóng 500nm sẽ tính được kết quả đường máu. CHO-(CHOH)4 - CH2OH + O2 , E gluco oxydase COOH –( CHOH )4–CH2OH Gluco oxydase được gắn lên điện cực platin, khi đo nhúng điện cực vào dung dịch rồi đo kết quả phản ứng. Bằng phường pháp enzym, kết quả đường máu chính xác hơn, không phụ thuộc vào các chất khử. E cố định sử dụng trong biosensor (cảm biến sinh học) Hình 8: Hệ thống biosensor [7] Các E cố định được sử dụng trong biosensor để chẩn đoán và mục đích khác. Một biosensor được cấu tạo từ 1 thụ thể sinh học và 1 hệ thống chuyển tiếp. thụ thể sinh học (bioreceptor) là phân tử sinh học nhận biết được nhân tố đích, sự nhận biết đó được nhân tố chuyển tiếp biến thành tín hiệu có thể đo được. Tính độc đáo của biosensor là hai thành phần trên được kết hợp thành một đầu dò duy nhất. Sự kết hợp này giúp đo được nhân tố đích cần phân tích mà không cần các chất phản ứng. Điều này thuận lợi so với việc xét nghiệm qua nhiều bước và mỗi bước phải sử dụng một chất phản ứng đối với mẫu. Ezyme là biosenssor nhờ khả năng nhận biết đặc hiệu, các bioreceptor gồm kháng thể, nucleic acid và các protein thụ thể. Sự nhận biết này thông qua tương tác yếu giữa nhóm trên bề mặt trình diện E và ở các phân tử khác không phải E. Cách đo đơn giản và nhanh là thuận lợi chính của biosensor sử dụng E cố định, và có thể cho ra kết quả định tính và định lượng. GDH của B.cereus được sử dụng vàp mục đích này vì nó có tính đặc hiệu cao, chỉ oxy hóa D – gluco. Phản ứng xảy ra như sau : Lượng NADH tạo thành được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm, từ đó định lượng gluco trong máu. Như việc nghiên cứu sử dụng E acetylcholin esterase được cố định để ứng dụng tạo biosensor nhạy cảm, có khả năng phát hiện ra thuốc trừ sâu OP (organophosphate), parauxon. Trong khoảng 0.4 – 2 ppm với thời gian phân tích là 15 phút cũng đã có những kết quả khả quan. [8] E cố định trong công nghiệp kháng sinh